Эшерихия коли BL21(DE3)
| Эшерихия коли BL21(DE3) | |
|---|---|
Научная классификация 
| |
| Домен: | Бактерии |
| Тип: | Псевдомонадота |
| Сорт: | Гаммапротеобактерии |
| Заказ: | Энтеробактерии |
| Семья: | Энтеробактерии |
| Род: | Эшерихия |
| Разновидность: | кишечная палочка |
| Напряжение: | Э.с. БЛ21(ДЕ3) |
| Трехчленное имя | |
| Эшерихия коли BL21(DE3) | |
Escherichia coli BL21(DE3) — широко используемый штамм, продуцирующий белок. Этот штамм сочетает в себе несколько особенностей, которые позволяют осуществлять избыточную экспрессию гетерологичных белков . Он происходит из линии B E. coli . [ 1 ]
Мы
[ редактировать ]Генотип этого штамма обозначен E. coli B F. – ompT гал dcm lon hsdS B (r B – м Б – ) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB + ] К-12 (л С ) . [ 2 ]
Характеристики
[ редактировать ]Снижение протеолиза
[ редактировать ]Протеолиз гетерологично экспрессируемых белков снижается из-за функциональной недостаточности двух основных протеаз , Lon и OmpT. [ 3 ] Lon обычно присутствует в цитоплазме клетки , но во всех штаммах B его продукция предотвращается вставкой в последовательность промотора . OmpT расположен на внешней мембране , но отсутствует у штаммов B из-за делеции . [ 4 ]
Индукция экспрессии
[ редактировать ]Хотя E. coli BL21(DE3) поддерживает экспрессию генов под контролем конститутивных промоторов, он специально разработан для индукции IPTG рекомбинантных генов под контролем промотора T7. Реальная сила индукции зависит от нескольких факторов, включая концентрацию ИПТГ и время его добавления. [ 5 ]
Эта функция обеспечивается наличием рекомбинантного λ- профага (DE3). DE3 несет ген РНК-полимеразы T7 (RNAP) под контролем промотора lacUV5 ( ген lacUV5-T7 1 ). Т7-РНКП высокоспецифична к промотору Т7 и ортогональна нативным промоторам E. coli . Следовательно, Т7-РНКП транскрибирует (вводится экзогенно) только гены, которые регулируются промотором Т7. [ 6 ] Промотор LacUV5 происходит от E. coli дикого типа промотора lac , но демонстрирует повышенную силу транскрипции из-за двух мутаций, которые облегчают его взаимодействие с нативным E. coli РНКП σ-фактором . [ 7 ]
В E. coli BL21(DE3) экспрессия T7-RNAP подавляется конститутивно экспрессируемым репрессором LacI . LacI связывает оператор lac , который расположен ниже промотора LacUV5, предотвращая выработку T7-РНКП. Однако при добавлении IPTG репрессор LacI диссоциирует от оператора lac, обеспечивая экспрессию T7-РНКП. Впоследствии Т7-РНКП может инициировать транскрипцию рекомбинантного гена под контролем промотора Т7. [ 1 ]
Другие модификации DE3 обеспечивают стабильную интеграцию профага в геном и предотвращают вступление профага в литический цикл ( ind1 , sam7 и nin5 ). [ 8 ]
Облегченное клонирование
[ редактировать ]У E. coli функционального типа I BL21(DE3) отсутствует система рестрикции-модификации , на что указывает hsdS(r B - м Б - ). В частности, домены рестрикции ( hsdR ) и модификации ( hsdM ) неактивны. Это повышает трансформации эффективность , поскольку экзогенно введенная неметилированная ДНК остается ненацеленной на систему рестрикции-модификации. [ 9 ]
Ген dcm становится неактивным, предотвращая метилирование цитозина также на обеих цепях последовательности узнавания 5'-CC(A/T)GG-3'. [ 10 ] Это облегчает дальнейшую обработку очищенной ДНК, поскольку метилирование Dcm предотвращает расщепление некоторыми ферментами рестрикции. [ 11 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б «Что такое экспрессирующие штаммы E. coli?» . Голдбио . Проверено 7 июня 2024 г.
- ^ «Генотипы кишечной палочки» . OpenWetWare . Проверено 7 июня 2024 г.
- ^ «BL21(DE3)» . ЭколиВики . Проверено 6 июня 2024 г.
- ^ «Штамм CGSC №: 12504» . Центр генетического фонда Coli . Проверено 7 июня 2024 г.
- ^ «Как работает индукция IPTG?» . Голдбио . Проверено 7 июня 2024 г.
- ^ «РНК-полимераза Т7» . Промега . Проверено 7 июня 2024 г.
- ^ «BCH-GENE-SCBD-258850-1» . Информационный центр по биобезопасности . Проверено 7 июня 2024 г.
- ^ «Генетическое происхождение каждого штамма Escherichia coli, используемого в The ST. 2 OOL Project» (PDF) . IGEM . Проверено 7 июня 2024 г. .
- ^ «Система ограничения-модификации ЭкоКИ» . ЭкоЦик . Проверено 7 июня 2024 г.
- ^ "P0AED9 · DCM_ECOLI" . ЮниПрот . Проверено 7 июня 2024 г.
- ^ «Метилазы Dam и Dcm E. coli » . Биолаборатории Новой Англии . Проверено 7 июня 2024 г.