Сюжет шеврона
Шевронный график — это способ представления сворачивания белка данных о кинетике в присутствии различных концентраций денатуранта белка , который разрушает нативную третичную структуру . График известен как «шевронный» график из-за канонической v или шевронной формы, наблюдаемой, когда логарифм наблюдаемой скорости релаксации отображается как функция концентрации денатуранта.
В системе с двумя состояниями скорости сворачивания и разворачивания доминируют над наблюдаемыми скоростями релаксации ниже и выше средней точки денатурации (Cm). Это порождает терминологию складывания и раскладывания рычагов для конечностей шеврона. Априорную информацию о Cm белка можно получить из равновесных экспериментов. При подгонке к модели с двумя состояниями предполагается, что логарифм скоростей сворачивания и разворачивания линейно зависит от концентрации денатуранта, что приводит к наклонам m f и m u , называемым m-значениями сворачивания и разворачивания соответственно (также называемые кинетическими m-значениями). Сумма двух скоростей представляет собой наблюдаемую скорость релаксации. Согласие между равновесным значением m и абсолютной суммой кинетических значений m обычно рассматривается как признак двухсостояния. Большинство известных экспериментов по денатурации проводились при температуре 298 К с использованием мочевины или хлорида гуанидиния (GuHCl) в качестве денатурантов.
Экспериментальная методология
[ редактировать ]Чтобы создать складчатое колено шеврона, белок в высококонцентрированном денатурирующем растворе быстро (менее чем за миллисекунду) разбавляют в подходящем буфере до определенной концентрации денатуранта с помощью аппарата с остановленным потоком . Релаксация к новому равновесию контролируется с помощью спектроскопических датчиков, таких как флуоресценция или, реже, с помощью кругового дихроизма (CD). Объем разведения регулируют для получения скорости релаксации при определенной концентрации денатуранта. Конечная концентрация белка в смеси обычно составляет 1–20 мкМ, в зависимости от ограничений, налагаемых амплитудой релаксации и соотношением сигнал/шум. Разворачивающаяся конечность создается аналогичным образом путем смешивания белка, не содержащего денатурантов, с концентрированным денатурирующим раствором в буфере. Когда логарифм этих скоростей релаксации отображается как функция конечной концентрации денатуранта, получается шевронная диаграмма.
Смешивание растворов определяет мертвое время прибора, которое составляет около миллисекунды. Поэтому аппарат с остановленным потоком можно использовать только для белков со временем релаксации в несколько миллисекунд. В тех случаях, когда время релаксации короче мертвого времени прибора, экспериментальную температуру понижают (таким образом увеличивая вязкость воды /буфера), чтобы увеличить время релаксации до нескольких миллисекунд. С другой стороны, для быстро сворачивающихся белков (то есть белков со скоростью релаксации от 1 до 100 микросекунд) скачок давления (мертвое время ~ несколько микросекунд) [1] скачок температуры (Т-скачок; мертвое время ~ несколько наносекунд) или непрерывное перемешивание потоков (мертвое время ~ несколько микросекунд), [2] можно проводить при различных концентрациях денатуранта для получения шевронной диаграммы.
Перевороты с шевроном
[ редактировать ]Хотя предполагается, что части шеврона линейны в зависимости от концентрации денатуранта, это не всегда так. Нелинейности обычно наблюдаются либо в обеих конечностях, либо в одной из них и называются шевронными переворотами. Причина такого наблюдения не ясна. Множество интерпретаций, включая промежуточные, [3] ограничения мертвого времени, движения переходного состояния ( эффект Хаммонда ), [4] артефакты агрегации, [5] складной для спуска , [6] вызванные солью Дебая – Хюккеля, и эффекты [7] были предложены объяснить такое поведение. Во многих случаях перевороты складчатых конечностей игнорируются, поскольку они происходят при низких концентрациях денатуранта, и данные соответствуют модели двух состояний с линейной зависимостью скоростей. Таким образом, скорости сворачивания, сообщаемые для таких белков в отсутствие денатурантов, являются завышенными.
См. также
[ редактировать ]- Складывание белка
- Денатурация (биохимия)
- Средняя точка денатурации
- Равновесие разворачивается
- Анализ значения Фи
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Дженкинс Д.С., Пирсон Д.С., Харви А., Сильвестр И.Д., Дживс М.А., Пинейро Т. (2009). «Быстрое сворачивание прионного белка, захватываемого скачком давления» . Эур Биофиз Дж . 38 (5): 625–35. дои : 10.1007/s00249-009-0420-6 . ПМК 4509520 . ПМИД 19255752 .
- ^ Фергюсон Н., Джонсон С.М., Масиас М., Ошкинат Х., Фершт А. (2001). «Сверхбыстрое сворачивание WW-доменов без структурированных ароматических кластеров в денатурированном состоянии» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 98 (23): 13002–13007. Бибкод : 2001PNAS...9813002F . дои : 10.1073/pnas.221467198 . ПМК 60814 . ПМИД 11687613 .
- ^ Санчес И.Е., Кифхабер Т. (2003). «Доказательства наличия последовательных барьеров и обязательных промежуточных продуктов в очевидном двухсостоянии сворачивания белка». Дж. Мол. Биол . 325 (2): 367–376. дои : 10.1016/S0022-2836(02)01230-5 . ПМИД 12488101 .
- ^ Тернстрем Т., Мэр У., Акке М., Оливеберг М. (1999). «От снимка к фильму: φ-анализ переходных состояний сворачивания белков сделан на шаг вперед» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 96 (26): 14854–14859. Бибкод : 1999PNAS...9614854T . дои : 10.1073/pnas.96.26.14854 . ПМК 24737 . ПМИД 10611302 .
- ^ Пошел, ХМ; Бенитес-Кардоса, центральный защитник; Джексон, ЮВ (2004). «Заселено ли промежуточное состояние на пути сворачивания убиквитина?». Письма ФЭБС . 567 (2–3): 333–8. дои : 10.1016/j.febslet.2004.04.089 . ПМИД 15178347 .
- ^ Кая Х, Чан Х (2003). «Происхождение переворотов шевронов в кинетике сворачивания белка без двух состояний». Физ. Преподобный Летт . 90 (258104–1): 258104–4. arXiv : cond-mat/0302305 . Бибкод : 2003PhRvL..90y8104K . doi : 10.1103/PhysRevLett.90.258104 . ПМИД 12857173 . S2CID 15026414 .
- ^ Риос М., Плашко К. (2005). «Очевидные эффекты Дебая-Хюкеля при сворачивании простого однодоменного белка». Биохимия . 44 (4): 1243–1250. дои : 10.1021/bi048444l . ПМИД 15667218 .