Дифференциально-интерференционно-контрастная микроскопия

Micrasterias Furcata, полученные с помощью ДИК-микроскопии в проходящем свете

Лазерно-индуцированные оптические повреждения в LiNbO ₃ под микроскопом Номарского с увеличением 150×

дифференциального интерференционного контраста ( DIC ) Микроскопия , также известная как интерференционный контраст Номарского ( NIC ) или микроскопия Номарского , представляет собой метод оптической микроскопии, используемый для повышения контраста в неокрашенных прозрачных образцах . DIC работает по принципу интерферометрии , чтобы получить информацию о длине оптического пути образца и увидеть невидимые в противном случае особенности. Относительно сложная оптическая система создает изображение, в котором объект выглядит черно-белым на сером фоне. Это изображение похоже на изображение, полученное с помощью фазово-контрастной микроскопии , но без яркого дифракционного ореола. Эту технику изобрел Фрэнсис Хьюз Смит. «Смит ДИК» производился Эрнстом Лейтцем Вецларом в Германии и был сложен в производстве. ДИК был затем развит польским физиком Жоржем Номарским в 1952 году.

ДИК работает путем разделения источника поляризованного света на две ортогонально поляризованные взаимно когерентные части, которые пространственно смещены (сдвинуты) в плоскости образца и повторно объединены перед наблюдением. Интерференция двух частей при рекомбинации чувствительна к их оптической разности путей (т.е. к произведению показателя преломления и геометрической длины пути). Добавляя регулируемую фазу смещения, определяющую интерференцию при нулевой разности оптических путей в образце, контраст становится пропорциональным градиенту длины пути вдоль направления сдвига, создавая вид трехмерного физического рельефа, соответствующего изменению оптической плотности образца. образец, подчеркивающий линии и края, но не обеспечивающий топографически точное изображение.

Светлый путь

1. Неполяризованный свет попадает в микроскоп и поляризуется под углом 45°.

Для работы метода необходим поляризованный свет.

2. Поляризованный свет попадает в первую модифицированную Номарским призму Волластона, , и разделяется на два луча, поляризованных под углом 90° друг к другу: выборочный и опорный лучи.

Призмы Волластона — это разновидность призмы, состоящей из двух слоев кристаллического вещества, например кварца, которое из-за изменения показателя преломления в зависимости от поляризации света расщепляет свет в соответствии с его поляризацией. Призма Номарского заставляет два луча сходиться в фокусе за пределами корпуса призмы, что обеспечивает большую гибкость при настройке микроскопа, поскольку призму можно активно фокусировать.

3. Два луча фокусируются конденсором для прохождения через образец. Эти два луча сфокусированы таким образом, что они пройдут через две соседние точки образца на расстоянии около 0,2 мкм друг от друга.

Образец эффективно освещается двумя источниками когерентного света: один с поляризацией 0°, другой с поляризацией 90°. Однако эти два источника освещения не совсем выровнены: один из них слегка смещен относительно другого.

Путь света через ДИК-микроскоп. Два световых луча должны быть параллельны между конденсором и объективом.

4. Лучи проходят через соседние участки образца, разделенные сдвигом. Разделение обычно соответствует разрешению микроскопа. У них будет разная длина оптического пути, если области различаются показателем преломления или толщиной. Это вызывает изменение фазы одного луча относительно другого из-за задержки, которую испытывает волна в более оптически плотном материале.

Прохождение многих пар лучей через пары соседних точек образца (а также их поглощение, преломление и рассеяние образцом) означает, что изображение образца теперь будет переносить свет с поляризацией как 0 °, так и 90 °. Если рассматривать их по отдельности, это будут светлопольные изображения образца, слегка смещенные друг от друга. Свет также несет информацию об изображении, невидимом для человеческого глаза, фазе света. Это очень важно позже. Различные поляризации предотвращают интерференцию между этими двумя изображениями на этом этапе.

5. Лучи проходят через объектив и фокусируются на второй призме Волластона, модифицированной Номарским.

6. Вторая призма объединяет два луча в один, поляризованный под углом 135°. Комбинация лучей приводит к интерференции , осветлению или затемнению изображения в этой точке в зависимости от оптической разности путей.

Эта призма накладывает два изображения светлого поля и выравнивает их поляризацию, чтобы они могли интерферировать. Однако изображения не совсем совпадают из-за смещения освещенности – это означает, что вместо интерференции, возникающей между двумя лучами света, прошедшими через одну и ту же точку образца, возникает интерференция между лучами света, прошедшими через соседние точки, которые поэтому имеют немного другую фазу. Поскольку разница в фазе обусловлена ​​разницей в длине оптического пути, эта рекомбинация света вызывает «оптическую дифференциацию » длины оптического пути, создавая видимое изображение.

Изображение

Процесс получения изображения в ДИК-микроскопе

Изображение выглядит как трехмерный объект при очень наклонном освещении, что приводит к появлению сильных светлых и темных теней на соответствующих гранях. Направление видимого освещения определяется ориентацией призм Волластона.

Как объяснялось выше, изображение генерируется из двух идентичных изображений в светлом поле, наложенных друг на друга с небольшим смещением друг от друга (обычно около 0,2 мкм), и последующей интерференции из-за разности фаз, преобразующей изменения фазы (и, следовательно, длины оптического пути) в видимый перемена в темноте. Это вмешательство может быть как конструктивным, так и деструктивным, приводя к характерному появлению трехмерности.

Типичная разность фаз, вызывающая интерференцию, очень мала и очень редко превышает 90° (четверть длины волны). Это связано с сходством показателей преломления большинства образцов и сред, в которых они находятся: например, клетка в воде имеет разницу показателей преломления всего около 0,05. Эта небольшая разность фаз важна для правильной работы DIC, поскольку, если разность фаз на стыке двух веществ слишком велика, то разность фаз может достигать 180° (половина длины волны), что приводит к полной деструктивной интерференции и аномальной темноте. область; если бы разность фаз достигла 360° (полная длина волны), это привело бы к полной конструктивной интерференции, создав аномально яркую область.

Изображение можно аппроксимировать (пренебрегая преломлением и поглощением, обусловленными образцом, а также пределом разрешения разделения лучей) как дифференциалом длины оптического пути относительно положения поперек образца вдоль сдвига, и, таким образом, дифференциалом показателя преломления (оптический плотность) образца.

ДИК-изображения с разными фазами смещения φ ₀

Контраст можно регулировать с помощью смещения фазы либо путем перемещения объективной призмы Номарского, либо с помощью волновой пластины лямбда/4 между поляризатором и конденсорной призмой Нормарского (компенсация Де-Сенармона). Результирующий контраст меняется от темного поля при нулевом сдвиге фазы (интенсивность, пропорциональная квадрату дифференциала сдвига), к типичному рельефу, наблюдаемому для фазы ~ 5–90 градусов, к оптическому окрашиванию на 360 градусов, где длина волны гашения сдвигается с разницей фаз.

При сопоставлении последовательно сдвинутых изображений фазовый сдвиг, вносимый объектом, можно отделить от нежелательных неинтерферометрических артефактов, что обычно приводит к улучшению контрастности, особенно в мутных образцах.

Приложения

Ориентационно-ориентированная визуализация прозрачного кубоида при ДВС-синдроме

Частично проявленный фоторезист в Nomarski DIC

ДИК используется для визуализации живых и неокрашенных биологических образцов, таких как мазки из тканевой культуры или отдельные одноклеточные организмы, переносимые водой. Из-за максимально пространственно некогерентного освещения теоретическое разрешение приближается к теоретическому максимальному охвату, диктуемому сферой Эвальда . Это улучшение методов, требующих более высокой степени когерентности, таких как фазовый контраст .

Яма для легирования алюминия и кремния, сделанная Nomarski DIC.

Частично протравленный диоксид кремния в ДИК Номарского

Одной из небиологических областей, где используется ДИК, является анализ обработки планарных кремниевых полупроводников. Тонкие (обычно 100–1000 нм) пленки при обработке кремния часто в основном прозрачны для видимого света (например, диоксида кремния, нитрида кремния и поликристаллического кремния), а дефекты в них или лежащие поверх них загрязнения становятся более заметными. Это также позволяет определить, является ли элемент ямкой в ​​материале подложки или каплей постороннего материала сверху. Вытравленные кристаллические элементы приобретают особенно яркий вид при ДИК.

Качество изображения при использовании в подходящих условиях превосходное. в разрешении. Однако анализ изображений ДИК всегда должен учитывать ориентацию призм Волластона и видимое направление освещения, поскольку параллельные им объекты не будут видны. Однако это легко преодолеть, просто вращая образец и наблюдая за изменениями изображения.

См. также

• Классическая интерференционная микроскопия
• Нановидная микроскопия

Ссылки

• Мерфи, Д., Микроскопия дифференциально-интерференционного контраста (ДИК) и микроскопия с модуляционным контрастом, в «Основах световой микроскопии и цифровой визуализации», Вили-Лисс, Нью-Йорк, стр. 153–168 (2001).
• Салмон Э. и Тран П., Световой микроскоп с дифференциальным интерференционным контрастом (VE-DIC) высокого разрешения. Видеомикроскопия, Слудер Г. и Вольф Д. (редакторы), Academic Press, Нью-Йорк, стр. 153–184 (1998).
• Дифференциальный интерференционный контраст — ссылки

Внешние ссылки

• Праймер для дифференциально-интерференционного контраста
• Контраст дифференциальных интерференций. Архивировано 25 июля 2020 г. на Wayback Machine.
• ДИК-микроскопия в отраженном свете
• Руководство по дифференциальному интерференционному контрасту (DIC)