Двумерная хроматография
Двумерная хроматография — это тип хроматографического метода, при котором введенный образец разделяется путем прохождения двух разных стадий разделения. Две разные хроматографические колонки соединяют последовательно, и элюат из первой системы переносят на вторую колонку. [1] Обычно вторая колонка имеет другой механизм разделения, так что полосы, которые плохо разрешаются в первой колонке, могут быть полностью разделены во второй колонке. (Например, за колонкой обращенно-фазовой хроматографии C18 может следовать фенильная колонка.) Альтернативно, две колонки могут работать при разных температурах. На втором этапе разделения скорость разделения должна быть выше, чем на первом этапе, поскольку детектор все еще остается только один. Плоская поверхность поддается последовательной проявке в двух направлениях с использованием двух разных растворителей.
История
[ редактировать ]Современные методы двумерной хроматографии основаны на результатах ранних разработок бумажной хроматографии и тонкослойной хроматографии (ТСХ), в которых использовались жидкие подвижные фазы и твердые неподвижные фазы. Эти методы позже станут основой современного анализа газовой хроматографии (ГХ) и жидкостной хроматографии (ЖХ). Различные комбинации одномерной ГХ и ЖХ позволили создать метод аналитической хроматографии, известный как двумерная хроматография.
Самая ранняя форма 2D-хроматографии возникла в виде многоступенчатого разделения ТСХ, при котором сначала используется тонкий лист целлюлозы с одним растворителем в одном направлении, затем, после того как бумага высохла, в другой растворитель пропускают другой растворитель. направлении под прямым углом к первому. Эта методология впервые появилась в литературе в 1944 году в публикации А.Дж.П. Мартина и его коллег, подробно описывающей эффективный метод разделения аминокислот: «...но двумерная хроматограмма особенно удобна, поскольку она сразу показывает информацию, которую можно иного добились лишь в результате многочисленных экспериментов» (Biochem J., 1944, 38, 224).
Примеры
[ редактировать ]Двумерное разделение можно проводить с помощью газовой или жидкостной хроматографии . Для «пересчета» первого столбца во второй были разработаны различные стратегии объединения. Некоторым важным оборудованием для двумерного разделения являются переключатель Динса и модулятор, которые избирательно переносят элюент первого измерения в колонку второго измерения. [2]
Главное преимущество двумерных методов заключается в том, что они обеспечивают значительное увеличение пиковой производительности, не требуя чрезвычайно эффективного разделения в любой из колонок. (Например, если первая колонка обеспечивает пиковую емкость (k 1 ) 100 при 10-минутном разделении, а вторая колонка обеспечивает пиковую емкость 5 (k 2 ) при 5-секундном разделении, то объединенный пик емкость может приближаться к k 1 × k 2 =500, при этом общее время разделения все равно ~ 10 минут). 2D-разделение применялось для анализа бензина и других нефтяных смесей, а в последнее время и для белковых смесей. [3] [4]
Тандемная масс-спектрометрия
[ редактировать ]
Тандемная масс-спектрометрия (тандемная МС или МС/МС) последовательно использует два масс-анализатора для разделения более сложных смесей аналитов. Преимущество тандемного МС заключается в том, что он может работать намного быстрее, чем другие двумерные методы, при этом время варьируется от миллисекунд до секунд. [5] Поскольку в МС нет разбавления растворителями, вероятность помех меньше, поэтому тандемная МС может быть более чувствительной и иметь более высокое соотношение сигнал/шум по сравнению с другими двумерными методами. Основным недостатком тандемной МС является высокая стоимость необходимого оборудования. Цены могут варьироваться от 500 000 до более чем 1 миллиона долларов. [6] Многие формы тандемного MS включают этап массового отбора и этап фрагментации. Первый масс-анализатор можно запрограммировать так, чтобы он пропускал только молекулы с определенным соотношением массы к заряду. Затем второй масс-анализатор может фрагментировать молекулу, чтобы определить ее идентичность. Это может быть особенно полезно для разделения молекул одинаковой массы (т.е. белков одинаковой массы или молекулярных изомеров). Различные типы масс-анализаторов могут быть объединены для достижения различных эффектов. Одним из примеров может быть TOF - квадрупольная система. Ионы можно последовательно фрагментировать и/или анализировать в квадруполе по мере их выхода из TOF в порядке возрастания m/z. Другим распространенным тандемным масс-спектрометром является анализатор квадруполь-квадруполь-квадруполь (QQQ). Первый квадруполь разделяется по массе, во втором квадруполе происходят столкновения, а в третьем квадруполе происходит разделение осколков по массе.
Газовая хроматография-масс-спектрометрия
[ редактировать ]
Газовая хроматография-масс-спектрометрия (ГХ-МС) представляет собой метод двумерной хроматографии, сочетающий в себе метод разделения газовой хроматографии с методом идентификации масс-спектрометрии . ГХ-МС — единственный и наиболее важный аналитический инструмент для анализа летучих и полулетучих органических соединений в сложных смесях. [7] При этом образец сначала вводится во входное отверстие ГХ, где он испаряется и проталкивается через колонку газом-носителем, обычно гелием. Аналиты в пробе разделяются на основе их взаимодействия с покрытием колонки, или неподвижной фазой, и газом-носителем, или подвижной фазой. [8] преобразуются в ионы посредством электронного удара (ЭУ) или химической ионизации (ХИ). Соединения, элюированные из колонки , перед прохождением через масс-анализатор [9] Масс-анализатор служит для разделения ионов по принципу «масса-заряд». Популярные варианты выполняют ту же функцию, но различаются способом разделения. [10] Анализаторы, обычно используемые с ГХ-МС, — это времяпролетный масс-анализатор и квадрупольный масс-анализатор . [8] Покинув масс-анализатор, аналиты достигают детектора и производят сигнал, который считывается компьютером и используется для создания газовой хроматограммы и масс-спектра. Иногда в ГХ-МС используются два газовых хроматографа для особенно сложных образцов, чтобы получить значительную степень разделения и иметь возможность однозначно отнести конкретные виды к соответствующим пикам в методе, известном как ГХХ-(МС). [11] В конечном счете, ГХ-МС — это метод, используемый во многих аналитических лабораториях, и являющийся очень эффективным и адаптируемым аналитическим инструментом.
Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия
[ редактировать ]Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ/МС) сочетает хроматографическое разделение высокого разрешения с МС-детектированием. Поскольку в системе используется высокая степень разделения ВЭЖХ, аналиты, находящиеся в жидкой подвижной фазе, часто ионизируются различными методами мягкой ионизации, включая химическую ионизацию при атмосферном давлении (APCI), ионизацию электрораспылением (ESI) или матричную лазерную десорбцию/ионизацию (MALDI) . ), что обеспечивает ионизацию газовой фазы, необходимую для связи с МС. [ нужна ссылка ] Эти методы ионизации позволяют анализировать более широкий спектр биологических молекул, включая молекулы с большей массой, термически нестабильные или нелетучие соединения, которые ГХ-МС обычно не способен анализировать.
ЖХ-МС обеспечивает высокую селективность, поскольку неразрешенные пики можно выделить путем выбора определенной массы. Кроме того, с помощью масс-спектров достигается лучшая идентификация, и пользователю не нужно полагаться исключительно на время удерживания аналитов. В результате информация о молекулярной массе и структуре, а также количественные данные могут быть получены с помощью ЖХ-МС. [9] Таким образом, ЖХ-МС может применяться в различных областях, таких как идентификация примесей и составление профиля при разработке лекарств и фармацевтическом производстве, поскольку ЖХ обеспечивает эффективное разделение примесей, а МС обеспечивает структурную характеристику для определения профиля примесей. [12]
Обычные растворители, используемые в нормальной или обращенно-фазовой ЖХ, такие как вода, ацетонитрил и метанол, совместимы с ESI, однако растворитель класса ЖХ может не подходить для МС. Кроме того, следует избегать использования буферов, содержащих неорганические ионы, поскольку они могут загрязнить источник ионов. [13] Тем не менее, проблема может быть решена с помощью 2D LC-MS, а также других различных проблем, включая коэлюирование аналитов и реакцию УФ-детектирования. [14]
Жидкостная хроматография-жидкостная хроматография
[ редактировать ]Двумерная жидкостная хроматография (2D-LC) объединяет два отдельных анализа жидкостной хроматографии в один анализ данных. Современная двумерная жидкостная хроматография зародилась в конце 1970-х - начале 1980-х годов. В это время гипотетические принципы 2D-ЖХ подтверждались посредством экспериментов, проводимых наряду с дополнительными концептуальными и теоретическими работами. Было показано, что 2D-ЖХ может предложить немного большую разрешающую способность по сравнению с традиционными методами одномерной жидкостной хроматографии. В 1990-х годах метод 2D-LC сыграл важную роль в разделении чрезвычайно сложных веществ и материалов, обнаруженных в областях исследований протеомики и полимеров. К сожалению, было показано, что этот метод имеет существенный недостаток, когда дело касается времени анализа. Ранние работы с 2D-ЖХ ограничивались небольшой частью разделения жидкой фазы из-за длительного времени анализа оборудования. Современные методы 2D-LC решили этот недостаток и значительно уменьшили то, что когда-то было вредным свойством. Современный метод 2D-ЖХ имеет инструментальные возможности для разделения с высоким разрешением, которое можно выполнить за час или меньше. В связи с растущей потребностью в приборах для проведения анализа веществ растущей сложности с лучшими пределами обнаружения, развитие 2D-ЖХ продвигается вперед. Инструментальные детали стали основной отраслью промышленности, и их гораздо легче достать, чем раньше. До этого 2D-ЖХ выполнялась с использованием компонентов инструментов 1D-ЖХ и приводила к результатам разной степени точности и прецизионности. Снижение нагрузки на приборостроение позволило провести новаторскую работу в области и технике 2D-ЖХ.
Целью использования этого метода является разделение смесей, которые одномерная жидкостная хроматография иначе не может эффективно разделить. Двумерная жидкостная хроматография лучше подходит для анализа проб сложных смесей, таких как моча, вещества окружающей среды и судебно-медицинские доказательства, такие как кровь.
Трудности разделения смесей можно объяснить сложностью смеси в том смысле, что разделение не может произойти из-за количества различных стоков в соединении. Другая проблема, связанная с одномерной жидкостной хроматографией, связана с трудностью разделения близкородственных соединений. Близкородственные соединения обладают схожими химическими свойствами, которые может оказаться трудным разделить в зависимости от полярности, заряда и т. д. [15] Двумерная жидкостная хроматография обеспечивает разделение на основе более чем одного химического или физического свойства. Используя пример Надя и Векея, смесь пептидов можно разделить по их основности, но аналогичные пептиды могут плохо элюироваться. Используя последующий метод ЖХ, сходную основность пептидов можно дополнительно разделить, используя различия в аполярном характере. [16]
В результате, чтобы иметь возможность более эффективно разделять смеси, последующий анализ ЖХ должен использовать совсем другую селективность разделения по сравнению с первой колонкой. Еще одним требованием для эффективного использования двумерной жидкостной хроматографии, по мнению Буши и Йоргенсона, является использование сильно ортогональных методов, что означает, что два метода разделения должны быть как можно более разными. [17]
Существует две основные классификации двумерной жидкостной хроматографии. К ним относятся: комплексная 2D жидкостная хроматография (LCxLC) и душераздирающая 2D жидкостная хроматография (LC-LC). [18] При комплексной 2D-ЖХ все пики элюирования на колонке полностью отбираются, но было сочтено ненужным переносить весь образец из первой колонки во вторую. Часть пробы отправляется в отходы, а остальная часть отправляется в пробоотборный клапан. В ошеломляющей 2D-ЖХ анализируются специфические пики, при этом лишь небольшая часть пика вводится во вторую колонку. Пронзительная 2D-ЖХ оказалась весьма полезной для анализа проб не очень сложных веществ при условии, что они имеют схожее поведение при удерживании. По сравнению с комплексной 2D-ЖХ, 2D-ЖХ представляет собой эффективный метод с гораздо меньшими затратами на настройку системы и гораздо более низкими эксплуатационными расходами. Множественное разделение сердца (mLC-LC) может использоваться для отбора проб нескольких пиков из одномерного анализа без риска временного перекрытия двухмерного анализа. [18] Множественное вырезание сердца (mLC-LC) использует настройку нескольких циклов отбора проб.
Для 2D-ЖХ пиковая мощность является очень важным вопросом. Этого можно добиться с помощью разделения градиентным элюированием с гораздо большей эффективностью, чем изократическое разделение, при условии разумного промежутка времени. Хотя изократическое элюирование гораздо проще в быстром масштабе времени, предпочтительно выполнять разделение градиентным элюированием во втором измерении. Сила подвижной фазы варьируется от слабого состава элюента до более сильного. На основе линейной теории силы растворителя (LSST) градиентного элюирования для обращенно-фазовой хроматографии взаимосвязь между временем удерживания, инструментальными переменными и параметрами растворенного вещества показана ниже. [18]
- t R =t 0 +t D + t 0 /b*ln(b*(k 0 -t d /t 0 ) + 1)
Несмотря на то, что за годы, прошедшие с тех пор, как 2D-ЖХ стала основным аналитическим хроматографическим методом, было выполнено множество новаторских работ, остается еще много современных проблем, требующих рассмотрения. Большое количество экспериментальных переменных еще предстоит определить, и метод постоянно находится в стадии разработки.
Газовая хроматография – газовая хроматография
[ редактировать ]Комплексная двумерная газовая хроматография — это аналитический метод, позволяющий разделять и анализировать сложные смеси. Он использовался в таких областях, как ароматизаторы, ароматизаторы, экологические исследования, фармацевтика, нефтепродукты и судебная медицина. GCxGC обеспечивает высокий диапазон чувствительности и большую мощность разделения благодаря увеличенной пиковой мощности.
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Векей, Карой; Вертес, Акос; Телекес, Андраш (2008). Медицинское применение масс-спектрометрии . Эльзевир Б.В. ISBN 9780444519801 .
- ^ Шариф К.М., Чин С.Т., Кулсинг С., Марриотт П.Дж. (сентябрь 2016 г.). «Микрофлюидный переключатель Динса: 50 лет прогресса, инноваций и применения». Тенденции в аналитической химии . 82 : 35–54. дои : 10.1016/j.trac.2016.05.005 .
- ^ Бломберг Дж., Шенмейкерс П.Дж., Бенс Дж., Тийссен Р. (1997). «Комплексная двумерная газовая хроматография (ГХ×ГХ) и ее применимость для характеристики сложных (нефтехимических) смесей». Журнал хроматографии высокого разрешения . 20 (10): 539–544. дои : 10.1002/jhrc.1240201005 .
- ^ Столл Д.Р., Ван X, Карр П.В. (январь 2008 г.). «Сравнение практической разрешающей способности одно- и двумерного высокоэффективного жидкостного хроматографического анализа метаболомных образцов». Аналитическая химия . 80 (1): 268–78. дои : 10.1021/ac701676b . ПМИД 18052342 .
- ^ Jump up to: а б с Скуг Д.А., Западный DM (2014). Основы аналитической химии . Соединенные Штаты Америки: Cengage Learning. п. 816. ИСБН 978-0-495-55828-6 .
- ^ Маклафферти, Фред В. (октябрь 1981 г.). «Тандемная масс-спектрометрия». Наука . 214 (4518): 280–287. Бибкод : 1981Sci...214..280M . дои : 10.1126/science.7280693 . JSTOR 1686862 . ПМИД 7280693 .
- ^ Хайтс, Рональд (1986). «Газовая хроматография, масс-спектрометрия» (PDF) . Аналитическая химия . 58 . дои : 10.1021/ac00292a767 . hdl : 2445/32139 . S2CID 42703412 . Архивировано из оригинала (PDF) 4 декабря 2018 года . Проверено 3 декабря 2018 г.
- ^ Jump up to: а б «Газовая хроматография, масс-спектрометрия (ГХ/МС)» . Бристольский университет . Проверено 3 декабря 2018 г.
- ^ Jump up to: а б Скуг Д.А., Вест Д.М., Холлер Ф.Дж., Крауч С.Р. (2014). Основы аналитической химии (9-е изд.). Брукс/Коул Сенгедж Обучение. стр. 895–920. ISBN 978-0-495-55828-6 .
- ^ Хусейн С.З., Макбул К. (2014). «GS-MS: Принцип, метод и его применение в пищевой науке». Международный журнал современной науки . 13 : 116–126.
- ^ Онг RC, Marriott PJ (2002). «Обзор основных концепций комплексной двумерной газовой хроматографии» . Журнал хроматографической науки . 40 (5): 276–291. дои : 10.1093/chromsci/40.5.276 . ПМИД 12049157 .
- ^ Гу GC, Дэвид Р., Питер Ю (2016). «Применение LCMS при разработке низкомолекулярных лекарств» . Европейский фармацевтический обзор . 21 (4).
- ^ Питт Джей-Джей (февраль 2009 г.). «Принципы и применение жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии в клинической биохимии» . Клинический биохимик. Отзывы . 30 (1): 19–34. ПМК 2643089 . ПМИД 19224008 .
- ^ Катрен, Анисет; Делобель, Арно; Ларджи, Эрик; Ван Винхт, Жери (май 2016 г.). «2D-LC–MS для анализа моноклональных антител и конъюгатов антитело-лекарственное средство в регулируемой среде» . www.spectrossionline.com . Спецвыпуски-01-05-2016. 14 (2): 29–35 . Проверено 03 декабря 2018 г.
- ^ Jump up to: а б с Столл Д.Р., Карр П.В. (январь 2017 г.). «Двумерная жидкостная хроматография: современное учебное пособие». Аналитическая химия . 89 (1): 519–531. дои : 10.1021/acs.analchem.6b03506 . ПМИД 27935671 .
- ^ БОЛЬШОЙ, ВОЗРАСТ; ВЕКЕЙ, КАРОЛИ (2008), «Методы разделения», Медицинские применения масс-спектрометрии , Elsevier, стр. 61–92, номер домена : 10.1016/b978-044451980-1.50007-0 , ISBN. 9780444519801
- ^ Буши М.М., Йоргенсон Дж.В. (15 мая 1990 г.). «Автоматизированное оборудование для комплексной двумерной высокоэффективной жидкостной хроматографии/капиллярного зонного электрофореза». Аналитическая химия . 62 (10): 978–984. дои : 10.1021/ac00209a002 . ISSN 0003-2700 .
- ^ Jump up to: а б с Карр П.В., Столл Д.Р. (2016). Двумерная жидкостная хроматография: принципы, практическая реализация и применение . Германия: Agilent Technologies, Inc., с. 1.
