Вытеснительная хроматография

Вытеснительная хроматография — это метод хроматографии , при котором образец помещается в головку колонки. и затем вытесняется растворенным веществом , которое сорбируется сильнее, чем компоненты исходной смеси. В результате компоненты разделяются на последовательные «прямоугольные» зоны высококонцентрированных чистых веществ, а не на «пики», разделенные растворителем. Это прежде всего препаративный метод; Можно получить более высокую концентрацию продукта, более высокую чистоту и увеличенную производительность по сравнению с другими режимами хроматографии.

Открытие

Появление вытеснительной хроматографии можно отнести к Арне Тиселиусу . который в 1943 году впервые классифицировал режимы хроматографии как фронтальную, элюирующую и вытесняющую. Вытесняющая хроматография нашла множество применений, включая выделение трансурановых элементов. и биохимические объекты. Техника была переработана Чабой Хорватом . которые использовали современные колонны и оборудование высокого давления. С тех пор он нашел множество применений, особенно в области биологической очистки макромолекул.

Принцип

Пример изотермы Ленгмюра для популяции сайтов связывания, имеющих одинаковое сродство. В этом случае вертикальная ось представляет количество связанного вещества на единицу неподвижной фазы, а горизонтальная ось — концентрацию в подвижной фазе. В этом случае константа диссоциации равна 0,5, а емкость 10; единицы произвольны.

Основной принцип вытесняющей хроматографии заключается в следующем: в матрице имеется только конечное число мест связывания растворенных веществ (неподвижная фаза), и если сайт занят одной молекулой, он недоступен для других. Как и в любой хроматографии, равновесие устанавливается между молекулами данного вида, связанными с матрицей, и молекулами того же вида, свободными в растворе. Поскольку количество сайтов связывания конечно, когда концентрация свободных молекул в растворе велика по сравнению с константой диссоциации этих сайтов, эти сайты в основном будут заполнены. Это приводит к искривлению вниз графика связанного и свободного растворенного вещества, что в простейшем случае дает изотерму Ленгмюра . Молекула с высоким сродством к матрице (вытеснитель) будет более эффективно конкурировать за места связывания, оставляя подвижную фазу обогащенной растворенным веществом с более низким сродством. Поток подвижной фазы через колонку преимущественно уносит растворенное вещество с более низким сродством, и, таким образом, при высокой концентрации растворенное вещество с более высоким сродством в конечном итоге вытеснит все молекулы с меньшим сродством.

Режим работы

Загрузка

В начале анализа в колонку подается смесь растворенных веществ, подлежащих разделению, в условиях, выбранных для обеспечения высокого удерживания. Растворенные вещества с более высоким сродством предпочтительно задерживаются в начале колонки, а растворенные вещества с более низким сродством движутся дальше вниз по течению. Ниже по потоку наиболее быстро движущийся компонент начинает формировать чистую зону. Другие компоненты также начинают образовывать зоны, но продолжающаяся подача смешанного сырья в голову колонны препятствует полному разрешению.

Смещение

После загрузки всего образца подача переключается на вытеснитель, выбранный с более высоким сродством, чем любой компонент образца. Вытеснитель образует зону с острыми краями в начале колонны, выталкивая другие компоненты вниз по потоку. Каждый компонент пробы теперь действует как вытеснитель для растворенных веществ с более низким сродством, и растворенные вещества сортируются на ряд смежных полос («последовательность смещения»), все они движутся вниз по течению со скоростью, установленной вытеснителем. Размер и загрузка колонны выбираются таким образом, чтобы процесс сортировки завершился до того, как компоненты достигнут нижней части колонны. Растворенные вещества появляются в нижней части колонки в виде ряда смежных зон, каждая из которых состоит из одного очищенного компонента, при этом концентрация внутри каждой отдельной зоны практически одинакова.

Регенерация

После элюирования последнего растворенного вещества необходимо снять вытеснитель с колонки. Поскольку вытеснитель был выбран из-за высокого сродства, это может стать проблемой. Для материалов с обращенной фазой может быть достаточно промывки высоким процентом органического растворителя. Также часто используются большие сдвиги pH. Одной из эффективных стратегий является удаление вытеснителя с помощью химической реакции; например, если ион водорода использовался в качестве вытеснителя, его можно удалить реакцией с гидроксидом, или ион поливалентного металла можно удалить реакцией с хелатирующим агентом. Для некоторых матриц реакционноспособные группы на неподвижной фазе можно титровать для временного устранения мест связывания, например, слабокислотные ионообменники или хелатирующие смолы можно перевести в протонированную форму. Для ионитов гелевого типа решением может стать изменение селективности при очень высокой ионной силе. Иногда вытеснитель специально разрабатывается с использованием титруемой функциональной группы для изменения его сродства. После промывки вытеснителя колонку промывают по мере необходимости для восстановления ее исходного состояния для следующего запуска.

Сравнение с элюционной хроматографией

Общие основы

В любой форме хроматографии скорость, с которой растворенное вещество движется вниз по колонке, является прямым отражением процента времени, которое растворенное вещество проводит в подвижной фазе. Чтобы добиться разделения при помощи элюентной или вытеснительной хроматографии, должны быть заметные различия в сродстве соответствующих растворенных веществ к неподвижной фазе. Оба метода основаны на движении вниз по колонке для усиления эффекта небольших различий в распределении между двумя фазами. Распределение между подвижной и стационарной фазами описывается изотермой связывания, графиком растворенного вещества, связанного с неподвижной фазой (или разделенного на нее) в зависимости от концентрации в подвижной фазе. Изотерма часто является линейной или приблизительно линейной при низких концентрациях, но обычно изгибается (вогнуто вниз) при более высоких концентрациях, когда стационарная фаза становится насыщенной.

Характеристики режима элюирования

В режиме элюирования растворенные вещества наносятся на колонку в виде узких полос и при низкой концентрации движутся вниз по колонке в виде примерно гауссовых пиков. Эти пики продолжают расширяться по мере продвижения пропорционально квадратному корню из пройденного расстояния. Для разделения двух веществ они должны мигрировать вниз по колонке с достаточно разными скоростями, чтобы преодолеть эффект расширения полос. Работа при высокой концентрации, когда изотерма искривлена, невыгодна при элюционной хроматографии, поскольку в этом случае скорость перемещения зависит от концентрации, вызывая расплывание и искажение пиков.

Удерживание в элюционной хроматографии обычно контролируют путем регулирования состава подвижной фазы (с точки зрения состава растворителя, pH, ионной силы и т. д.) в соответствии с типом используемой неподвижной фазы и конкретными растворенными веществами, которые необходимо разделить. Компоненты подвижной фазы обычно имеют меньшее сродство к неподвижной фазе, чем разделяемые растворенные вещества, но присутствуют в более высоких концентрациях и достигают своего эффекта за счет действия масс . Разрешение в элюционной хроматографии обычно лучше, когда пики сильно сохраняются, но условия, которые обеспечивают хорошее разрешение ранних пиков, приводят к длительному времени анализа и чрезмерному уширению более поздних пиков, если не градиентное элюирование используется . Градиентное оборудование усложняет и увеличивает затраты, особенно в больших масштабах.

Преимущества и недостатки режима перемещения

В отличие от элюционной хроматографии, растворенные вещества, разделенные в режиме вытеснения, образуют зоны с острыми краями, а не растекающиеся пики. Границы зон в вытеснительной хроматографии самозаостряются: если молекула по каким-либо причинам опередит свою полосу, она попадет в зону, в которой она прочнее удерживается, а затем будет двигаться медленнее, пока ее зона не догонит. Более того, поскольку вытеснительная хроматография использует преимущество нелинейности изотерм, нагрузки намеренно высоки; на данной колонке за заданное время можно отделить больше материала, при этом очищенные компоненты извлекаются в значительно более высоких концентрациях. Условия удерживания по-прежнему можно регулировать, но вытеснитель контролирует скорость миграции растворенных веществ. Вытеснитель выбирают так, чтобы он имел более высокое сродство к неподвижной фазе, чем любое из разделяемых растворенных веществ, а его концентрацию устанавливают так, чтобы она приближалась к насыщению неподвижной фазы и обеспечивала желаемую скорость миграции волны концентрации. Условия высокого удерживания можно использовать без градиентной операции, поскольку вытеснитель обеспечивает удаление всех интересующих растворенных веществ в течение расчетного времени работы.

Из-за концентрирующего эффекта загрузки колонки в условиях высокого удерживания вытеснительная хроматография хорошо подходит для очистки компонентов из разбавленных потоков сырья. Однако также возможно концентрировать материал из разбавленного потока в головной части хроматографической колонки, а затем переключать условия для элюирования адсорбированного материала в обычных изократических или градиентных режимах. Таким образом, этот подход не уникален для вытесняющей хроматографии, хотя более высокая нагрузочная способность и меньшее разбавление позволяют увеличить концентрацию в режиме вытеснения.

Недостатком вытеснительной хроматографии является то, что неидеальность всегда приводит к зоне перекрытия между каждой парой компонентов; эту смешанную зону необходимо собирать отдельно для переработки или выбрасывать, чтобы сохранить чистоту разделенных материалов. Была исследована стратегия добавления спейсерных молекул для образования зон между компонентами (иногда называемая «хроматографией со смещением носителя»). и может быть полезен, когда найдены подходящие, легкосъемные прокладки. Другим недостатком является то, что необработанную хроматограмму, например график зависимости поглощения или показателя преломления от объема элюирования, может быть трудно интерпретировать для смежных зон, особенно если серия вытеснения не полностью развита. Документирование и устранение неисправностей могут потребовать дополнительного химического анализа для установления распределения данного компонента. Другим недостатком является то, что время, необходимое для регенерации, ограничивает производительность.

Согласно статье Джона К. Форда в «Энциклопедии хроматографии» , теоретические исследования показывают, что, по крайней мере, для некоторых систем оптимизированная перегруженная элюционная хроматография обеспечивает более высокую производительность, чем вытесняющая хроматография, хотя ограниченные экспериментальные тесты показывают, что вытесняющая хроматография превосходит (по крайней мере, до рассмотрения время регенерации).

Приложения

Исторически вытеснительная хроматография применялась для препаративного разделения аминокислот и редкоземельных элементов, а также исследовалась для разделения изотопов.

Белки

Хроматографическая очистка белков из сложных смесей может быть весьма сложной задачей, особенно если смеси содержат одинаково сохраняемые белки или когда желательно обогатить микроэлементы в корме. Кроме того, загрузка колонки часто ограничивается, когда требуется высокое разрешение при использовании традиционных режимов хроматографии (например, линейно-градиентной, изократической хроматографии). В этих случаях вытеснительная хроматография является эффективным методом очистки белков из сложных смесей при высокой загрузке колонки в различных приложениях.

Важным достижением в области вытесняющей хроматографии стала разработка низкомолекулярных вытеснителей для очистки белков в ионообменных системах. Это исследование имело большое значение, поскольку оно представляло собой серьезный отход от общепринятого мнения о том, что крупные полиэлектролитные для замещения белков в ионообменных системах необходимы полимеры.

Низкомолекулярные вытеснители имеют значительные эксплуатационные преимущества по сравнению с крупными полиэлектролитными вытеснителями. Например, если между вытеснителем и интересующим белком существует какое-либо перекрытие, эти материалы с низкой молекулярной массой можно легко отделить от очищенного белка во время обработки после вытеснения с использованием стандартных методов очистки на основе размера (например, эксклюзионной хроматографии , ультрафильтрации ). . Кроме того, зависимое от соли поведение адсорбции этих вытеснителей с низкой молекулярной массой значительно облегчает регенерацию колонки. Эти вытеснители использовались для широкого спектра разделений с высоким разрешением в ионообменных системах. Кроме того, полезность вытеснительной хроматографии для очистки рекомбинантных факторов роста , антигенные вакцинные белки и антисмысловые олигонуклеотиды также было продемонстрировано. Есть несколько примеров, когда вытесняющая хроматография применялась для очистки белков с использованием ионного обмена , гидрофобного взаимодействия , а также обращенно-фазовой хроматографии .

Вытесняющая хроматография хорошо подходит для получения миллиграммовых количеств очищенных белков из сложных смесей с использованием стандартных аналитических хроматографических колонок в лабораторных условиях. Он также особенно хорошо подходит для обогащения корма микроэлементами. Вытесняющую хроматографию можно легко провести с использованием различных систем смол, включая ионообменную, HIC и RPLC.

Двумерная хроматография

Двумерная хроматография представляет собой наиболее тщательный и строгий подход к оценке протеома . Хотя ранее принятые подходы использовали хроматографические подходы в режиме элюирования, такие как катионный обмен на обращенно-фазовую ВЭЖХ , выходы обычно очень низкие, что требует аналитической чувствительности в диапазоне от пикомолярного до фемтомолярного. Поскольку вытесняющая хроматография дает преимущество концентрации следовых компонентов, двумерная хроматография, использующая вытесняющий, а не элюирующий режим на этапе восходящей хроматографии, представляет собой потенциально мощный инструмент для анализа микроэлементов, модификаций и идентификации второстепенных экспрессируемых компонентов протеома.