Первый диммер
Димер праймера ( ПД ) является потенциальным побочным продуктом полимеразной цепной реакции (ПЦР), распространенного биотехнологического метода. Как следует из названия, ПД состоит из двух молекул праймера , которые прикрепились ( гибридизировались ) друг к другу благодаря цепочкам комплементарных оснований в праймерах. В результате ДНК-полимераза амплифицирует PD, что приводит к конкуренции за реагенты для ПЦР, тем самым потенциально ингибируя амплификацию последовательности ДНК , предназначенной для амплификации ПЦР. При количественной ПЦР ПД могут мешать точному количественному определению.
Механизм образования
[ редактировать ]
Димер праймера формируется и амплифицируется в три этапа. На первом этапе два праймера отжигаются на своих соответствующих 3'-концах (этап I на рисунке). Если эта конструкция достаточно стабильна, ДНК-полимераза свяжет и удлинит праймеры в соответствии с комплементарной последовательностью (этап II на рисунке). Важным фактором, способствующим стабильности конструкции на этапе I, является высокое содержание GC на 3'-концах и длина перекрытия. Третий этап происходит в следующем цикле, когда одна цепь продукта этапа II используется в качестве матрицы, с которой отжигаются свежие праймеры, что приводит к синтезу большего количества продукта PD. [ 1 ]
Обнаружение
[ редактировать ]Димеры праймера могут быть видны после гель-электрофореза продукта ПЦР. ПД в гелях, окрашенных бромидом этидия , обычно проявляются в виде полосы длиной 30-50 пар оснований (п.н.) или размазывания от умеренной до высокой интенсивности и отличимы от полосы целевой последовательности, длина которой обычно превышает 50 п.н.
При количественной ПЦР ФД можно обнаружить с помощью анализа кривой плавления с использованием интеркалирующих красителей, таких как SYBR Green I , неспецифический краситель для обнаружения двухцепочечной ДНК. Поскольку они обычно состоят из коротких последовательностей, ПД денатурируют при более низкой температуре, чем целевая последовательность, и, следовательно, их можно отличить по характеристикам кривой плавления.
Предотвращение образования праймер-димеров
[ редактировать ]Один из подходов к предотвращению ЧР состоит в физико-химической оптимизации системы ПЦР, т.е. изменении концентраций праймеров, хлорида магния , нуклеотидов , ионной силы и температуры реакции. Этот метод несколько ограничен физико-химическими характеристиками, которые также определяют эффективность амплификации целевой последовательности в ПЦР. Следовательно, снижение образования ПД может также привести к снижению эффективности ПЦР. Чтобы преодолеть это ограничение, другие методы направлены только на уменьшение образования ПД, включая разработку праймеров и использование различных ферментных систем или реагентов ПЦР. [ нужна ссылка ]
Программное обеспечение Primer-design
[ редактировать ]Программное обеспечение для проектирования праймеров использует алгоритмы, которые проверяют возможность формирования вторичной структуры ДНК и отжига праймеров к себе или внутри пар праймеров. Физическими параметрами, которые учитываются программой, являются потенциальная самокомплементарность и GC-содержание праймеров; схожие температуры плавления грунтовок; и отсутствие вторичных структур, таких как стебель-петли , в целевой последовательности ДНК. [ 2 ]
ПЦР с горячим стартом
[ редактировать ]Поскольку праймеры сконструированы таким образом, чтобы иметь низкую комплементарность друг другу, они могут отжигаться (этап I на рисунке) только при низкой температуре, например комнатной температуре, например, во время приготовления реакционной смеси. Хотя ДНК-полимеразы, используемые в ПЦР, наиболее активны при температуре около 70 °C, они обладают некоторой полимеризующей активностью и при более низких температурах, что может вызвать синтез ДНК из праймеров после отжига друг с другом. [ 3 ] Было разработано несколько методов предотвращения образования ФД до тех пор, пока реакция не достигнет рабочей температуры (60–70 ° C), и они включают первоначальное ингибирование ДНК-полимеразы или физическое разделение реакции компонентов реакции до тех пор, пока реакционная смесь не достигнет более высоких температур. Эти методы называются ПЦР с горячим стартом .
Воск : в этом методе фермент пространственно отделен от реакционной смеси воском, который плавится, когда реакция достигает высокой температуры. [ 4 ]
Медленное высвобождение магния : для активности ДНК-полимеразы необходимы ионы магния. [ 5 ] поэтому магний химически выделяется из реакции путем связывания с химическим соединением и выделяется в раствор только при высокой температуре. [ 6 ]
Нековалентное связывание ингибитора : в этом методе пептид , антитело [ 7 ] или аптамер [ 8 ] связываются нековалентно с ферментом при низкой температуре и ингибируют его активность. После инкубации в течение 1–5 минут при 95 °C ингибитор высвобождается и начинается реакция.
Чувствительная к холоду Taq-полимераза : представляет собой модифицированную ДНК-полимеразу, практически не проявляющую активности при низкой температуре. [ 9 ]
Химическая модификация : в этом методе небольшая молекула ковалентно связывается с боковой цепью аминокислоты в активном центре ДНК-полимеразы. Небольшая молекула высвобождается из фермента при инкубации реакционной смеси в течение 10–15 минут при 95 °C. Как только небольшая молекула высвобождается, фермент активируется. [ 10 ]
Структурные модификации праймеров
[ редактировать ]Другой подход к предотвращению или уменьшению образования ПД заключается в модификации праймеров так, чтобы отжиг между собой или друг с другом не вызывал удлинения.
РУКИ ( гомо - система использованием N Dimer с тегов ) - [ 11 ] ): нуклеотидный хвост, комплементарный 3'-концу праймера, добавляется к 5'-концу праймера. Из-за непосредственной близости 5'-хвоста он отжигается с 3'-концом праймера. В результате получается праймер «стебель-петля» , который исключает отжиг, включающий более короткие перекрытия, но позволяет отжиг праймера до его полностью комплементарной последовательности в мишени.
Химерные праймеры : некоторые основания ДНК в праймере заменяются основаниями РНК, создавая химерную последовательность . Температура плавления химерной последовательности с другой химерной последовательностью ниже, чем температура плавления химерной последовательности с ДНК. Эта разница позволяет установить температуру отжига таким образом, чтобы праймер отжигался со своей целевой последовательностью, но не с другими химерными праймерами. [ 12 ]
Блокированные-расщепляемые праймеры : метод, известный как РНКаза H-зависимая ПЦР (рчПЦР), [ 13 ] использует термостабильную РНКазу HII для удаления блокирующей группы из праймеров для ПЦР при высокой температуре. Этот фермент РНКаза HII практически не проявляет активности при низкой температуре, поэтому удаление блока происходит только при высокой температуре. Ферменту также присуща способность различать несоответствия праймер:матрица, что приводит к дополнительному отбору против димеров праймеров.
Самоизбегающие системы молекулярного распознавания : также известные как SAMRS, [ 14 ] устранение димеров праймера путем введения в праймер нуклеотидных аналогов Т*, А*, G* и С*. ДНК SAMRS может связываться с природной ДНК, но не с другими представителями того же вида SAMRS. Например, T* может быть привязан к A, но не к A*, а A* может быть привязан к T, но не к T*. Таким образом, благодаря тщательному проектированию, [ 15 ] праймеры, созданные на основе SAMRS, могут избежать взаимодействия праймер-праймер и обеспечить чувствительное обнаружение SNP, а также мультиплексную ПЦР.
Предотвращение получения сигнала от димеров праймеров
[ редактировать ]Хотя описанные выше методы предназначены для уменьшения образования ПД, другой подход направлен на минимизацию сигнала, генерируемого ПД в количественной ПЦР . Этот подход полезен, пока образуется мало ПД и их ингибирующее влияние на накопление продуктов незначительно.
Четырехступенчатая ПЦР : используется при работе с неспецифическими красителями, такими как SYBR Green I. Она основана на разной длине, а следовательно, и разной температуре плавления ПД и целевой последовательности. В этом методе сигнал получается ниже температуры плавления целевой последовательности, но выше температуры плавления ФД. [ 16 ]
Зонды, специфичные для последовательности : зонды TaqMan и молекулярные маяки генерируют сигнал только в присутствии их целевой (комплементарной) последовательности, и эта повышенная специфичность исключает получение сигнала (но не возможное ингибирующее воздействие на накопление продукта) от PD.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Альбертс; и др. (2017). Молекулярная биология клетки (6-е изд.). Гирляндная наука. стр. 100-1 708–711.
- ^ Начальная страница дизайна Медицинского центра Лейденского университета.
- ^ Патель, Юинг (2008). Полимеразная цепная реакция: методы и применение . Научная пресса. стр. 595–599.
- ^ Чоу, Куин; Рассел, Мэрион; Берч, Дэвид Э.; Раймонд, Джонатан; Блох, Уилл (1992). «Предотвращение неправильного прайминга перед ПЦР и димеризации праймеров улучшает амплификацию с низким числом копий» . Исследования нуклеиновых кислот . 20 (7): 1717–23. дои : 10.1093/нар/20.7.1717 . ПМК 312262 . ПМИД 1579465 .
- ^ Ян, Линьцзин; Арора, Карунеш; Борода, Уильям А.; Уилсон, Сэмюэл Х.; Шлик, Тамар (2004). «Критическая роль ионов магния в закрытии и сборке активного сайта бета-полимеразы ДНК». Журнал Американского химического общества . 126 (27): 8441–53. дои : 10.1021/ja049412o . ПМИД 15238001 .
- ^ Номер заявки на патент США 2007/0254327. [ мертвая ссылка ]
- ^ Патент США № 5338671. [ мертвая ссылка ]
- ^ Патент США № 6183967. [ мертвая ссылка ]
- ^ Патент США № 6214557. [ мертвая ссылка ]
- ^ Патент США № 5677152. [ мертвая ссылка ]
- ^ Брауни, Джаннин; Шокросс, Сьюзен; Тикер, Джейн; Уиткомб, Дэвид; Ферри, Ричард; Ньютон, Клайв; Литтл, Стивен (1997). «Устранение накопления праймер-димеров в ПЦР» . Исследования нуклеиновых кислот . 25 (16): 3235–41. дои : 10.1093/нар/25.16.3235 . ПМК 146890 . ПМИД 9241236 .
- ^ «Химерные праймеры для улучшенных реакций амплификации нуклеиновых кислот» . Патентная линза .
- ^ Добоси-младший, Роуз С.Д., Бельц К.Р., Рупп С.М., Пауэрс К.М., Белке М.А., Уолдер Дж.А. (август 2011 г.). «РНКаза H-зависимая ПЦР (рчПЦР): улучшенная специфичность и обнаружение полиморфизма отдельных нуклеотидов с использованием блокированных расщепляемых праймеров» . БМК Биотехнология . 11:80 . дои : 10.1186/1472-6750-11-80 . ПМЦ 3224242 . ПМИД 21831278 .
- ^ Хошика С., Чен Ф., Леал Н.А., Беннер С.А. (2020). «Искусственные генерические системы: самоизбегание ENA в ПЦР и мультиплексной ПЦР» . Энджью. Хим . 122 (32): 5686–5689. дои : 10.1002/ange.201001977 . ПМК 6027612 . ПМИД 20586087 .
- ^ Ян ЗЯ, Ле Дж.Т., Хаттер Д., Брэдли К.М., Овертон Б.Р., МакЛендон С., Беннер С.А. (2020). «Устранение димеров праймеров и улучшение обнаружения SNP с использованием самоизбегающих систем молекулярного распознавания» . Биологические методы и протоколы . 5 (1): bpaa004. doi : 10.1093/biomethods/bpaa004 . ПМК 7200914 . ПМИД 32395633 .
- ^ Четыре этапа ПЦР
Внешние ссылки
[ редактировать ]«Онлайн-программа для прогнозирования димеров праймеров» . ОлигоАнализатор 3.1 . Интегрированные ДНК-технологии .
«Дизайн праймера. Что такое праймер-димер?» . Видео на YouTube . 3 ноября 2013 г. Архивировано из оригинала 20 декабря 2021 г.