Анализ гемагглютинации
Анализ гемагглютинации или анализ гемагглютинации ( HA ) и анализ ингибирования гемагглютинации ( HI или HAI были разработаны в 1941–42 американским вирусологом Джорджем Херстом как методы количественного определения относительной концентрации вирусов бактерий , ) или антител. [ 1 ]
HA и HAI применяют процесс гемагглютинации , при котором рецепторы сиаловой кислоты на поверхности эритроцитов (эритроцитов) связываются с гликопротеином гемагглютинина, обнаруженным на поверхности вируса гриппа (и некоторых других вирусов), и создают сеть или решетчатую структуру. , взаимосвязанных эритроцитов и вирусных частиц. [ 2 ] Агглютинированная решетка удерживает эритроциты во взвешенном состоянии, которое обычно рассматривается как диффузный красноватый раствор. Формирование решетки зависит от концентрации вируса и эритроцитов, и когда относительная концентрация вируса слишком низкая, эритроциты не удерживаются решеткой и оседают на дно лунки. Гемагглютинация наблюдается в присутствии стафилококков, вибрионов и других видов бактерий, аналогично механизму, с помощью которого вирусы вызывают агглютинацию эритроцитов. [ 3 ] [ 4 ] Эритроциты, используемые в анализах HA и HI, обычно получают от кур, индеек, лошадей, морских свинок или людей, в зависимости от селективности целевого вируса или бактерии и связанных с ними поверхностных рецепторов на эритроцитах.
Процедура
[ редактировать ]Общая процедура для HA заключается в следующем: серийные разведения вируса готовят по рядам в 96-луночном микротитровальном планшете U- или V-образной формы. [ 5 ] Наиболее концентрированный образец в первой лунке часто разбавляют до 1/5 исходного раствора, а в последующих лунках обычно разбавляют в два раза (1/10, 1/20, 1/40 и т. д.). Последняя лунка служит в качестве отрицательного контроля без вируса. Каждый ряд планшета обычно содержит разные вирусы и один и тот же образец разведения. После серийных разведений в каждую лунку добавляют стандартизированную концентрацию эритроцитов и осторожно перемешивают. Планшет инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубационного периода анализ можно проанализировать, чтобы отличить агглютинированные и неагглютинированные лунки. Изображения в ряду обычно прогрессируют от агглютинированных лунок с высокой концентрацией вируса и диффузным красноватым оттенком до серии лунок с низкими концентрациями вируса, содержащих темно-красный осадок или кнопку в центре лунки. Лунки с низкой концентрацией выглядят почти идентичными лункам с отрицательным контролем без вируса. Появление кнопки происходит потому, что эритроциты не удерживаются в агглютинированной решетчатой структуре и оседают в нижней точке U- или V-образного дна лунки. Переход от агглютинированных лунок к неагглютинированным происходит четко, в пределах 1-2 лунок.
Относительная концентрация или титр образца вируса рассчитывается по лунке с последней агглютинацией, непосредственно перед тем, как наблюдается осадок. [ 6 ] По отношению к исходной концентрации вирусного запаса концентрация вируса в этой лунке будет представлять собой некоторое разбавление исходного материала, например, в 1/40 раза. Значение титра этого образца обратно пропорционально разведению, т.е. 40. В некоторых случаях вирус изначально настолько разбавлен, что агглютинированные лунки никогда не наблюдаются. В этом случае титру этих образцов обычно присваивается значение 5, что указывает на максимально возможную концентрацию, но точность этого значения явно низкая. Альтернативно, если относительная концентрация вируса чрезвычайно высока и лунки никогда не приобретают вид кнопки. Значение титра обычно присваивается самому высокому разведению, например 5120.
HI тесно связан с анализом HA, но включает в себя противовирусные антитела в качестве «ингибиторов», препятствующих взаимодействию вируса и эритроцитов. Цель состоит в том, чтобы охарактеризовать концентрацию антител в антисыворотке или других образцах, содержащих антитела. [ 7 ] Анализ HI обычно проводят путем создания серии разведений антисыворотки в рядах 96-луночного микротитровального планшета. Каждая строка обычно представляет собой отдельный образец. В каждую лунку добавляют стандартизированное количество вируса или бактерий и смесь оставляют инкубироваться при комнатной температуре в течение 30 минут. Последняя лунка в каждом ряду будет отрицательным контролем без добавления вируса. Во время инкубации антитела связываются с вирусными частицами, и если концентрация и аффинность связывания антител достаточно высоки, вирусные частицы эффективно блокируются, не вызывая гемагглютинации. [ 8 ] Затем в каждую лунку добавляют стандартизированное количество эритроцитов и оставляют инкубироваться при комнатной температуре еще в течение 30 минут. Полученные изображения планшета HI обычно прогрессируют от неагглютинированных «кнопочных» лунок с высокой концентрацией антител к агглютинированным красным диффузным лункам с низкой концентрацией антител. Значение титра HI является обратным значению последнего разведения сыворотки, которое полностью ингибировало гемагглютинацию. [ 9 ]
Приведенные выше описания процессов HA и HI являются обобщенными, а конкретные детали могут варьироваться в зависимости от оператора и лаборатории. Например, описано серийное разведение по рядам, но некоторые лаборатории используют альтернативную ориентацию и вместо этого выполняют разведения по столбцам. Аналогичным образом, начальное разведение, коэффициент серийного разведения, время инкубации и выбор планшета с U-образным или V-образным дном могут зависеть от конкретной лаборатории.
Преимущества
[ редактировать ]Преимущества HA и HI заключаются в простоте анализа, использовании относительно недорогих и доступных инструментов и расходных материалов и получении результатов в течение нескольких часов. Эти анализы также хорошо зарекомендовали себя во многих лабораториях по всему миру, что позволяет обеспечить определенную степень достоверности, сравнения и стандартизации. [ 10 ] [ 11 ]
Ограничения
[ редактировать ]Оптимальные и надежные результаты требуют контроля нескольких переменных, таких как время инкубации, концентрация эритроцитов и тип эритроцитов. [ 12 ] Неспецифические факторы в образце могут привести к интерференции и неправильным значениям титра. Например, молекулы в образце, отличные от вирус-специфических антител, могут ингибировать агглютинацию между вирусом и эритроцитами, а также потенциально блокировать связывание антител с вирусом. Ферменты, разрушающие рецепторы (RDE), обычно используются для обработки образцов перед анализом, чтобы предотвратить неспецифическое ингибирование. [ 13 ] Анализ результатов HA или HI зависит от того, что квалифицированный специалист прочитает планшет и определит значения титра. Метод ручной интерпретации создает больше возможностей для расхождений в анализе, поскольку результаты могут быть субъективными, а согласие между читателями непоследовательно. [ 14 ] Кроме того, не существует цифровой записи результатов определения планшета или титра, поэтому первоначальная интерпретация утомительна и обычно выполняется в повторах. Диапазон потенциальных переменных и различия между экспертами-читателями могут затруднить сравнение межлабораторных результатов. [ 15 ]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Херст, ГК (1942). «Количественное определение вируса гриппа и антител методом агглютинации эритроцитов» . Джей Эксп Мед . 75 (1): 49–64. дои : 10.1084/jem.75.1.49 . ПМК 2135212 . ПМИД 19871167 .
- ^ «Антигенная характеристика, активность и эпиднадзор за гриппом, сезонный грипп (грипп)» . CDC . 15.10.2019.
- ^ Нетер, Э; Горжинский, Е.А.; Залевски, Дж; Рахман, Р; Джино, РМ (1954). «Исследования по бактериальной гемагглютинации» . Американский журнал общественного здравоохранения . 44 (1): 49–54. дои : 10.2105/ajph.44.1.49 . ПМК 1620628 . ПМИД 13114484 .
- ^ Нетер, Э (1956). «Бактериальная гемагглютинация и гемолиз» . Исследовательские лаборатории Статлера и кафедра педиатрии, Детская больница, лаборатория бактериологии, Мемориальный институт Розуэлл-Парк, а также кафедры педиатрии и бактериологии, Медицинский факультет Университета Буффало, Буффало, Нью-Йорк . 20 (3): 166–182. дои : 10.1128/бр.20.3.166-188.1956 . ПМК 180858 . ПМИД 13363771 .
- ^ ВОЗ. «Серологическое обнаружение инфекций, вызванных вирусом птичьего гриппа A (H7N9), с помощью анализа ингибирования гемагглютинации у индейки - Лабораторные процедуры» (PDF) . ВОЗ.
- ^ ВОЗ. «Серологическое обнаружение инфекций, вызванных вирусом птичьего гриппа A (H7N9), с помощью анализа ингибирования гемагглютинации у индейки - Лабораторные процедуры» (PDF) . ВОЗ.
- ^ Ной, ДЛ; Хилл, Х; Хайнс, Д; Пока, ЭЛ; Вольф, MC (2009). «Квалификация анализа ингибирования гемагглютинации в поддержку лицензирования вакцины против пандемического гриппа» . Клин Вакцина Иммунол . 16 (4): 558–566. дои : 10.1128/cvi.00368-08 . ПМК 2668270 . ПМИД 19225073 .
- ^ Вебстер, Р.; Кокс, Н.; Стор, К. (2002). Руководство ВОЗ по диагностике и эпиднадзору за гриппом животных (PDF) . ВОЗ.
- ^ Вироцит. «Обзор методов количественного определения вирусов» (PDF) . Вироцит. Архивировано из оригинала (PDF) 3 марта 2016 г. Проверено 8 июня 2015 г.
- ^ Вироцит. «Обзор методов количественного определения вирусов» (PDF) . Вироцит. Архивировано из оригинала (PDF) 3 марта 2016 г. Проверено 8 июня 2015 г.
- ^ Ной, ДЛ; Хилл, Х; Хайнс, Д; Пока, ЭЛ; Вольф, MC (2009). «Квалификация анализа ингибирования гемагглютинации в поддержку лицензирования вакцины против пандемического гриппа» . Клин Вакцина Иммунол . 16 (4): 558–566. дои : 10.1128/cvi.00368-08 . ПМК 2668270 . ПМИД 19225073 .
- ^ ВОЗ. «Серологическое обнаружение инфекций, вызванных вирусом птичьего гриппа A (H7N9), с помощью анализа ингибирования гемагглютинации у индейки - Лабораторные процедуры» (PDF) . ВОЗ.
- ^ ВОЗ. «Серологическое обнаружение инфекций, вызванных вирусом птичьего гриппа A (H7N9), с помощью анализа ингибирования гемагглютинации у индейки - Лабораторные процедуры» (PDF) . ВОЗ.
- ^ Вуд, Дж; Лори, К; Энгельхардт, О. (сентябрь 2013 г.). «Сравнительное исследование протоколов анализа ингибирования гемагглютинации гриппа - разработка консенсусного протокола HI». № 4-я Международная встреча. ПОДУМАЙТЕ.
- ^ Вуд, Дж. М.; Майор, Д; Хит, А; Ньюман, RW; Хошлер, К; Стивенсон, я; Кларк, Т; Кац, Дж; Замбон, MC (2012). «Воспроизводимость серологических анализов на пандемический грипп H1N1: совместное исследование для оценки кандидата на международный стандарт ВОЗ». Вакцина . 30 (2): 210–217. doi : 10.1016/j.vaccine.2011.11.019 . ПМИД 22100887 .
