Изотермическая амплификация, опосредованная петлей обратной транскрипции
Изотермическая амплификация, опосредованная обратной транскрипцией ( RT-LAMP ), представляет собой одноэтапный метод амплификации нуклеиновых кислот для умножения специфических последовательностей РНК. Его используют для диагностики инфекционных заболеваний, вызванных РНК-вирусами . [1]
Он сочетает в себе LAMP [2] Обнаружение ДНК с обратной транскрипцией , получение кДНК из РНК перед запуском реакции. [3] RT-LAMP не требует термических циклов (в отличие от ПЦР ) и проводится при постоянной температуре от 60 до 65 °C.
RT-LAMP используется для обнаружения РНК-вирусов (группы II, IV и V по Балтиморской системе классификации вирусов ), таких как вирус SARS-CoV-2. [4] и вирус Эбола . [5]
Приложения
[ редактировать ]RT-LAMP используется для проверки наличия специфических образцов РНК вирусов для конкретной последовательности вируса, что стало возможным благодаря сравнению последовательностей с большой внешней базой данных ссылок.
Обнаружение вируса SARS-CoV2
[ редактировать ]Метод RT-LAMP поддерживается как более дешевая и простая альтернатива RT-PCR для ранней диагностики людей, заразных COVID-19 . [6] Существуют конструкции тестов с открытым доступом (включая рекомбинантные белки ), что позволяет любому законно проводить тесты. В отличие от классических экспресс-тестов с латеральным потоком , RT-LAMP позволяет диагностировать заболевание на ранней стадии путем тестирования вирусной РНК . [7]
Тесты можно проводить без предварительного выделения РНК, обнаруживая вирусы непосредственно в мазках. [8] или из слюны . [9]
Обнаружение нечеловеческих вирусов
[ редактировать ]Одним из примеров использования RT-LAMP был эксперимент по обнаружению нового утиного вируса BYD, похожего на Тембусу, названного в честь региона Байяндянь , где он был впервые выделен. [10] [11] [1] Еще одним недавним применением этого метода стал эксперимент 2013 года по обнаружению вируса Акабане с использованием RT-LAMP. В ходе эксперимента, проведенного в Китае, вирус был выделен из абортированных плодов теленка. [12]
Обнаружение жидкостей организма
[ редактировать ]RT-LAMP также используется в судебно-медицинской серологии для идентификации жидкостей организма. Исследователи провели эксперименты, чтобы показать, что этот метод может эффективно идентифицировать определенные жидкости организма. Зная, что будут ограничения, Су и др. пришли к выводу, что RT-LAMP способна идентифицировать только кровь. [13] [14]
Методология
[ редактировать ]Обратная транскрипция
[ редактировать ]Специфическая последовательность кДНК выявляется с помощью 4 праймеров LAMP . Два из них являются внутренними праймерами (FIP и BIP), которые служат основой для фермента Bst, копирующего матрицу в новую ДНК. ( Внешние праймеры F3 и B3) отжигаются с цепью матрицы и способствуют протеканию реакции.
Как и в случае с RT-PCR , процедура RT-LAMP начинается с получения ДНК из образца РНК. Это преобразование осуществляется обратной транскриптазой — ферментом, полученным из ретровирусов, способным осуществлять такое преобразование. [15] Эта ДНК, полученная из РНК, называется кДНК или комплементарной ДНК. Праймер FIP используется обратной транскриптазой для построения одноцепочечной копии ДНК. Праймер F3 также связывается с этой стороной цепи матрицы и вытесняет ранее созданную копию.
Усиление
[ редактировать ]Эта смещенная одноцепочечная копия представляет собой смесь целевой РНК и праймеров. Праймеры разработаны так, чтобы иметь последовательность, которая связывается с самой последовательностью, образуя петлю.
Праймер BIP связывается с другим концом этой одиночной цепи и используется ДНК-полимеразой Bst для построения комплементарной цепи, образуя двухцепочечную ДНК. Праймер F3 связывается с этим концом и снова вытесняет эту вновь созданную одноцепочечную молекулу ДНК.
Эта новая выпущенная одиночная цепь послужит отправной точкой для циклической амплификации LAMP. Эта одноцепочечная ДНК имеет структуру, напоминающую гантель : концы сгибаются и самосвязываются, образуя две петли.
ДНК-полимераза и праймеры FIP или BIP продолжают амплифицировать эту цепь, и продукт реакции LAMP удлиняется. Этот цикл можно начать как с передней, так и с обратной стороны пряди, используя соответствующий праймер. Как только этот цикл начался, цепь подвергается самопраймируемому синтезу ДНК во время стадии элонгации процесса амплификации. Это усиление происходит менее чем за час в изотермических условиях от 60 до 65 °C.
Зачитать
[ редактировать ]Результаты тестов RT-LAMP часто являются колориметрическими. Два распространенных способа основаны на измерении pH или ионов магния . Реакция амплификации приводит к снижению pH и снижению уровня Mg2+. Это можно определить по таким индикаторам, как феноловый красный для pH и гидроксинафтоловый синий (HNB) для магния. [15] Другой вариант — использовать SYBR Green I , интеркалирующий ДНК краситель. [16]
Преимущества и недостатки
[ редактировать ]
Этот метод особенно выгоден, потому что все это можно сделать быстро за один этап. Образец смешивают с праймерами, обратной транскриптазой и ДНК-полимеразой, и реакция протекает при постоянной температуре. Требуемой температуры можно добиться с помощью простой бани с горячей водой.
ПЦР требует термоциклирования ; RT-LAMP этого не делает, что делает его более эффективным по времени и очень экономичным. [3] Этот недорогой и упрощенный метод можно с большей готовностью использовать в развивающихся странах, у которых нет доступа к высокотехнологичным лабораториям.
Недостатком этого метода является создание праймеров, специфичных для последовательности. Для каждого анализа LAMP праймеры должны быть специально разработаны так, чтобы быть совместимыми с целевой ДНК. Это может быть сложно, что мешает исследователям использовать метод LAMP в своей работе. [1] Однако существует бесплатное программное обеспечение Primer Explorer, разработанное Fujitsu в Японии, которое может помочь в выборе этих букварей.
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б с Мори Ю, Нотоми Т (2009). «Петлевая изотермическая амплификация (LAMP): быстрый, точный и экономически эффективный метод диагностики инфекционных заболеваний» . Дж. Заразить. Чематер . 15 (2): 62–9. дои : 10.1007/s10156-009-0669-9 . ПМЦ 7087713 . ПМИД 19396514 .
- ^ Нотоми, Цугунори; Окаяма, Хирото; Масубучи, Харуми; Ёнекава, Тошихиро; Ватанабэ, Кейко; Амино, Нобуюки; Хасэ, Тецу (15 июня 2000 г.). «Петлевая изотермическая амплификация ДНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 28 (12): е63. дои : 10.1093/нар/28.12.e63 . ISSN 0305-1048 . ПМЦ 102748 . ПМИД 10871386 .
- ^ Перейти обратно: а б Фу С, Цюй Г, Го С, Ма Л, Чжан Н, Чжан С, Гао С, Шэнь З (2011). «Применение петлевой изотермической амплификации ДНК». Прил. Биохим. Биотехнология . 163 (7): 845–50. дои : 10.1007/s12010-010-9088-8 . ПМИД 20844984 . S2CID 45682156 .
- ^ Хабибзаде, Пархам; Мофаттех, Мохаммед; Силави, Мохаммед; Гавами, Саид; Фагихи, Мохаммад Али (17 февраля 2021 г.). «Молекулярные диагностические тесты на COVID-19: обзор» . Критические обзоры клинических лабораторных наук . 58 (6): 385–398. дои : 10.1080/10408363.2021.1884640 . ISSN 1549-781X . ПМЦ 7898297 . ПМИД 33595397 .
- ^ Куросаки, Ёхей; Магассуба, Н'Фали; Олониний, Оламид К.; Шериф, Махамуд С.; Сакабе, Саори; Такада, Аято; Хираяма, Кендзи; Ясуда, Дзиро (22 февраля 2016 г.). «Разработка и оценка метода изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией (RT-LAMP), в сочетании с портативным устройством для быстрой диагностики болезни, вызванной вирусом Эбола, в Гвинее» . PLOS Забытые тропические болезни . 10 (2): e0004472. дои : 10.1371/journal.pntd.0004472 . ISSN 1935-2735 . ПМЦ 4764121 . ПМИД 26900929 .
- ^ «Тест на основе LAMP может позволить проводить тестирование на COVID-19 в местах оказания медицинской помощи» . Диагностика от технологических сетей . Проверено 31 июля 2020 г.
- ^ Алексеенко Алиса; Барретт, Донал; Пареха-Санчес, Йерма; Ховард, Ребекка Дж.; Страндбэк, Эмилия; Ампах-Корса, Генри; Ровшник, Уршка; Зунига-Велис, Сильвия; Кленов, Александр; Маллу, Джайшна; Йе, Шэнлун (19 января 2021 г.). «Прямое обнаружение SARS-CoV-2 с использованием некоммерческих реагентов RT-LAMP на термоинактивированных образцах» . Научные отчеты . 11 (1): 1820. Бибкод : 2021NatSR..11.1820A . дои : 10.1038/s41598-020-80352-8 . ISSN 2045-2322 . ПМЦ 7815738 . ПМИД 33469065 .
- ^ Лалли, Мэтью А.; Лангмаде, С. Джошуа; Чен, Сюйхуа; Фроник, Катрина С.; Сойер, Кристофер С.; Бурча, Лорен С.; Уилкинсон, Майкл Н.; Фултон, Роберт С.; Хайнц, Майкл; Бухсер, Уильям Дж.; Руководитель Ричард Д.; Митра, Роби Д.; Милбрандт, Джеффри (2020). «Быстрое обнаружение SARS-CoV-2 из слюны без экстракции с помощью колориметрической ЛАМПЫ». medRxiv 10.1101/2020.05.07.20093542 .
- ^ Нагура-Икеда, Маю; Имаи, Кадзуо; Табата, Сакико; Миёси, Кадзуясу; Мурахара, Нами; Мизуно, Цукаса; Хориучи, Мидори; Като, Кенто; Имото, Ёситака; Ивата, Маки; Мимура, Сатоши (24 августа 2020 г.). «Клиническая оценка самостоятельно собранной слюны с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR), прямой RT-qPCR, изотермической амплификации с обратной транскрипцией и петлей и быстрого теста на антиген для диагностики COVID-19» . Журнал клинической микробиологии . 58 (9). дои : 10.1128/JCM.01438-20 . ISSN 0095-1137 . ПМЦ 7448663 . ПМИД 32636214 .
- ^ Вайдья Н.К., Ван Ф.Б., Цзоу Х, Валь Л.М. (2012). «Динамика передачи недавно выявленного вируса BYD, вызывающего синдром падения утиных яиц» . ПЛОС ОДИН . 7 (4): e35161. Бибкод : 2012PLoSO...735161V . дои : 10.1371/journal.pone.0035161 . ПМЦ 3329443 . ПМИД 22529985 .
- ^ Цзян Т., Лю Дж., Дэн YQ, Су JL, Сюй LJ, Лю Чж., Ли XF, Ю XD, Чжу С.Ю., Гао Г.Ф., Цинь Э.Д., Цинь К.Ф. (декабрь 2012 г.). «Разработка методов RT-LAMP и RT-PCR в реальном времени для быстрого обнаружения нового утиного вируса BYD, подобного Тембусу». Арх. Вирол . 157 (12): 2273–80. дои : 10.1007/s00705-012-1431-7 . ПМИД 22865206 . S2CID 15573433 .
- ^ Цяо Дж, Ван Дж, Мэн Ц, Ван Г, Лю Ю, Хэ З, Ян Х, Чжан Цз, Цай Икс, Чен С (2013). «Быстрое обнаружение вируса Акабане с помощью нового анализа изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией (RT-LAMP)» . Вирол. Дж . 10 :288. дои : 10.1186/1743-422X-10-288 . ПМЦ 3848447 . ПМИД 24034624 .
- ^ Су, Чи-Вэнь; Ли, Цзяо-Юнь; Ли, Джеймс Чун-И; Джи, Дар-Дер; Ли, Шу-Ин; Дэниел, Барбара; Синдеркомб-Корт, Дениз; Линакр, Адриан; Се, Син-Мэй (01 июня 2015 г.). «Новое применение RT-LAMP в реальном времени для идентификации жидкостей организма: использование обнаружения ГББ в качестве модели» . Судебная медицина, медицина и патология . 11 (2): 208–215. дои : 10.1007/s12024-015-9668-6 . ISSN 1556-2891 . ПМИД 25877518 . S2CID 19288327 .
- ^ Сато, Тецуя; Куроки, Сейя; Огава, Кейта; Танака, Йорика; Мацумура, Кадзутоши; Ивасе, Сусуму (01 июля 2018 г.). «Разработка идентификации жидкостей организма на основе мРНК с использованием изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией» . Аналитическая и биоаналитическая химия . 410 (18): 4371–4378. дои : 10.1007/s00216-018-1088-5 . ISSN 1618-2650 . ПМИД 29696299 . S2CID 13823864 .
- ^ Перейти обратно: а б Келлнер, Макс Дж.; Росс, Джеймс Дж.; Шнабль, Якоб; Декенс, Маркус П.С.; Хайнен, Роберт; Гришковская Ирина; Бауэр, Бенедикт; Стадльманн, Йоханнес; Менендес-Ариас, Луис; Фриче-Поланц, Роберт; Трауготт, Марианна (23 июля 2020 г.). «Быстрый, высокочувствительный анализ открытого доступа для обнаружения SARS-CoV-2 для лабораторного и домашнего тестирования» . bioRxiv : 2020.06.23.166397. дои : 10.1101/2020.06.23.166397 . hdl : 10261/216969 . S2CID 220835822 .
- ^ Бокельманн, Лукас; Никель, Олаф; Маричич, Томислав; Паабо, Сванте; Мейер, Матиас; Борте, Стефан; Ризенберг, Стефан (06 августа 2020 г.). «Быстрое, надежное и дешевое массовое тестирование на SARS-CoV-2 в местах оказания медицинской помощи путем сочетания гибридизационного захвата с улучшенной колориметрической LAMP (Cap-iLAMP)». medRxiv 10.1101/2020.08.04.20168617 .