Аминоаллилнуклеотид
Аминоаллилнуклеотид — нуклеотид с модифицированным основанием, содержащим аллиламин . Они используются при пост-мечении нуклеиновых кислот путем флуоресцентного обнаружения на микрочипах . Они реагируют с группой сложного эфира N-гидроксисукцинимида , которая помогает прикрепить флуоресцентный краситель к первичной аминогруппе нуклеотида. Эти нуклеотиды известны как 5-(3-аминоаллил ) -нуклеотиды, поскольку аминоаллильная группа обычно присоединена к углероду 5 пиримидинового кольца урацила или цитозина . Первичная аминогруппа в аминоаллильном фрагменте является алифатической и, следовательно, более реакционноспособной по сравнению с аминогруппами, которые непосредственно присоединены к кольцам ( ароматическим ) оснований. Общие названия аминоаллилнуклеозидов первоначально сокращаются до аа- или АА- для обозначения аминоаллила. 5-углеродный сахар указывается со строчной буквой «d» или без нее, обозначающей дезоксирибозу , если она включена, или рибозу, если нет. Наконец, азотистое основание и количество фосфатов указываются (т.е. аа-УТФ = аминоаллилуридинтрифосфат ).
История
[ редактировать ]
Целью объединения флуоресценции и нуклеиновых кислот было создание неизотопной метки , которую можно было бы обнаружить при изучении ДНК или РНК . Этот тип маркировки позволяет ученым изучать ДНК или РНК в их структуре, функциях или образовании с другими нуклеиновыми кислотами. [2] Первая базовая модификация флуоресцентного мечения произошла в 1971 году с помощью 4-тиоуридина и 4-тиоурацила . [3] Это исследование наряду с другими, которые включали различные типы прямого и непрямого мечения с помощью аналогов , добавления с помощью ферментов или других методов, сделало мечение нуклеотидов намного более безопасным для ученых при изучении ДНК. [2]
По мере того, как инструменты и технологии в области микрочипов ДНК становятся все более совершенными , для дальнейших научных исследований потребуются более совершенные реагенты и методы. Было показано, что флуоресцентное мечение Cy3 является более недостаточным и искажает результаты; Вместо этого был выбран метод включения аминоаллилнуклеотидов. Использование аминоаллильных нуклеотидов в качестве непрямой флуоресцентной метки, по-видимому, сводило на нет проблемы чувствительности, наблюдаемые при мечении цианином . [4]
Синтез
[ редактировать ]Аминоаллилнуклеозиды , можно синтезировать путем сочетания Хека как показано на изображении ниже. [5]
На изображении выше слева показан модифицированный нуклеозид с йодом (йод добавляется посредством электрофильного галогенирования ) у пятого углерода пиримидинового кольца. Его образование может быть связано с реакцией с аллиламином, и различные реагенты посредством Хек-сочетания способны удалить галогеновую группу из основания и добавить аллиламин с образованием аминоаллильного нуклеозида, показанного справа. [5] Продукт справа затем используется в молекулярной биологии при синтезе РНК. [4] [6] [7]
Другие реакции включают использование синтеза в одном реакторе с другими галогенами . [8]
Реакция
[ редактировать ]Первичный амин аминоаллильного нуклеотида реагирует с аминореактивными красителями. [9] такие как цианин и запатентованные красители [10] [11] которые содержат реакционноспособную уходящую группу, например, сукцинимидиловый эфир ( NHS ). Аминные группы, непосредственно присоединенные к кольцу основания, не затрагиваются. Эти нуклеотиды используются для маркировки ДНК. [4] [6] [10] [11] [12]
Использование
[ редактировать ]Аминоаллильные NTP используются для непрямого мечения ДНК в ПЦР , трансляции ника , удлинении праймеров и синтезе кДНК . [13] Эти меченые NTP полезны из-за их применения в лабораториях молекулярной биологии, где они не имеют возможности работать с радиоактивными материалами. Например, 5-(3-аминоаллил)-уридин (AA-UTP) более эффективен для мечения ДНК с высокой плотностью, чем предварительное мечение ДНК. После ферментативного добавления NTP можно добавить флуоресцентные красители с аминным реагентом для обнаружения молекулы ДНК. [7] При включении в молекулы ДНК или РНК с помощью ДНК/РНК- полимеразы 5-(3-аминоаллил)-UTP обеспечивает реакционноспособную группу для присоединения других химических групп. Таким образом, модифицированная аминоаллилом ДНК или РНК может быть помечена любым соединением, имеющим реагирующую с амином группу.aa-NTP, включенные в ДНК/РНК в сочетании с реагентами для связывания вторичных красителей, могут использоваться для матричного анализа. [6]
кДНК в целях обнаружения использует аминоаллильное мечение. Хотя прямое мечение dNTP является самым быстрым и дешевым методом флуоресцентного мечения, оно невыгодно, поскольку последовательность позволяет использовать только один модифицированный нуклеотид. Еще одним недостатком прямого мечения являются громоздкие нуклеотиды, однако это можно преодолеть путем непрямого мечения с использованием аминоаллильных модифицированных нуклеотидов. [14] Самый простой способ проверить успешность маркировки — это цвет. Хорошая маркировка приведет к появлению видимого синего (Cy5) или красного (Cy3) цвета в конечном материале. [15]
Другой процесс, в котором используется аминоаллильная маркировка, - это NASBA (амплификация на основе последовательностей нуклеиновых кислот), высокочувствительный метод амплификации РНК. В этом конкретном случае модифицированные aaUTP РНК были помечены флуоресцентным рынком Cy3. NASBA в сочетании с маркировкой аминоаллил-UTP очень полезна во многих различных областях микробной диагностики, включая мониторинг окружающей среды , обнаружение биологических угроз, мониторинг промышленных процессов и клиническую микробиологию. [16] Микрочип ДНК - это еще один метод, в котором конкретно используется AA-NTP, что делает тестирование микрочипа ДНК более быстрым и дешевым. [12]
Постсинтетическая маркировка позволяет избежать проблем, возникающих при прямом ферментативном включении Cy-меченных dNTP, за счет создания зондов с одинаковой эффективностью маркировки. При непрямом мечении модифицированные амином NTP включаются во время обратной транскрипции , амплификации РНК или ПЦР . Аминоаллил-НТФ вводятся во время полимеризации с такой же эффективностью, как и немодифицированные НТФ. [17] [18]
Проблемы с маркировкой:Аминовая группа в аминоаллил-модифицированном нуклеотиде реагирует с красителями, такими как цианиновый ряд, или другими запатентованными красителями. Проблема возникает, когда красители реагируют с буферными агентами , необходимыми для правильного хранения нуклеотидов. Однако для решения этой проблемы можно использовать карбонатный буфер. [19]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Хоган, Дэниел Дж.; Риордан, Дэниел П.; Гербер, Андре П.; Хершлаг, Даниэль; Браун, Патрик О. (2008). «Различные РНК-связывающие белки взаимодействуют с функционально связанными наборами РНК, что указывает на наличие обширной системы регуляции» . ПЛОС Биология . 6 (10): е255. doi : 10.1371/journal.pbio.0060255 . ПМЦ 2573929 . ПМИД 18959479 .
- ^ Jump up to: а б Крика, ЖЖ; Фортина, П. (апрель 2009 г.). «Аналитическое происхождение: «первые» во флуоресцентном мечении нуклеозидов, нуклеотидов и нуклеиновых кислот» . Клиническая химия . 55 (4): 670–83. дои : 10.1373/clinchem.2008.116152 . ПМИД 19233914 .
- ^ Секрист III, Джон А.; Хорхе Р. Баррио; Нельсон Дж. Леонард (3 декабря 1971 г.). «Прикрепление флуоресцентной метки к 4-тиоурацилу и 4-тиуридину». Связь с биохимическими и биофизическими исследованиями . 45 (5): 1262–1270. дои : 10.1016/0006-291x(71)90154-9 . ПМИД 4332594 .
- ^ Jump up to: а б с Фаррелл, Роберт (22 июля 2010 г.). Методологии РНК: Лабораторное руководство по выделению и характеристике . Эльзевир. п. 597. ИСБН 9780080454764 .
- ^ Jump up to: а б Реддингтон, Марк; Дэниел Каннингэн-Брайант (12 января 2011 г.). «Удобный синтез (Е)-5-аминоаллил-2'-дезоксицитидина и некоторых родственных производных». Буквы тетраэдра . 52 (2): 181–183. дои : 10.1016/j.tetlet.2010.10.137 .
- ^ Jump up to: а б с Биосистемы, прикладные. «Модифицированный нуклеотид 5-(3-аминоаллил)-UTP» (PDF) .
- ^ Jump up to: а б Биотехнология, Трилинк. «Модифицированные нуклеотиды» (PDF) . Архивировано из оригинала (PDF) 23 февраля 2017 г. Проверено 22 апреля 2014 г.
- ^ Коре, Анилкумар Р.; Бо Ян; Баласубраманиан Шринивасан (13 ноября 2013 г.). «Синтез (E)-5-[3-аминоаллил]-уридин-5'-трифосфата с участием фтора». Буквы тетраэдра . 54 (46): 6264–6266. дои : 10.1016/j.tetlet.2013.09.026 .
- ^ ДеРизи, Джозеф. «Протокол связывания амино-аллильного красителя» (PDF) . Проверено 9 апреля 2014 г.
- ^ Jump up to: а б AnaSpec, Inc. «Брошюра о Hiyte Fluor» (PDF) . Архивировано из оригинала (PDF) 13 апреля 2014 года . Проверено 9 апреля 2014 г.
- ^ Jump up to: а б технологии жизни. «Аминоаллил дУТФ» . Проверено 24 марта 2014 г.
- ^ Jump up to: а б Сян, CC; Кожич О.А.; Чен, М; Инман, Дж. М.; Фан, QN; Чен, Ю; Браунштейн, MJ (июль 2002 г.). «Амин-модифицированные случайные праймеры для мечения зондов для микрочипов ДНК». Природная биотехнология . 20 (7): 738–42. дои : 10.1038/nb0702-738 . ПМИД 12089562 .
- ^ Биотехнология, Трилинк. «Метка ДНК» .
- ^ Джибриэль, Абдулла (17 апреля 2012 г.). «Доступные варианты маркировки образцов нуклеиновых кислот методами обнаружения на основе микрочипов ДНК» . Брифинги по функциональной геномике . II (4): 311–318. дои : 10.1093/bfgp/els015 . ПМИД 22510454 .
- ^ Грин, Майкл. «Молекулярное клонирование. Лабораторное руководство» . Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор.
- ^ Отт, Шелер; Барри Глинн (2009). «Флуоресцентное мечение амплифицированных NASBA молекул тмРНК для применения в микрочипах». БМК Биотехнология .
- ^ 'т Хоэн, Пенсильвания; де Корт, Ф; ван Оммен, Дж.Дж.; ден Даннен, JT (1 марта 2003 г.). «Флуоресцентное мечение кРНК для применения в микрочипах» . Исследования нуклеиновых кислот . 31 (5): е20. дои : 10.1093/нар/gng020 . ПМК 149842 . ПМИД 12595569 .
- ^ Капоши-Новак, П; Ли, Дж. С.; Микаэлян А; Патель, В; Торгейрссон, СС (октябрь 2004 г.). «Анализ олигонуклеотидных микрочипов кДНК-мишеней, меченных аминоаллилом, в результате линейной амплификации РНК» . БиоТехники . 37 (4): 580, 582–6, 588. doi : 10.2144/04374ST02 . ПМИД 15517970 .
- ^ Саунди, П; Уилер, К.; Латам, Х. (2001). «Приготовление высокофлуоресцентных, равномерно меченных зондов для гибридизации микрочипов с использованием аминоаллильного метода с набором для постмаркировки CyScribe». Новости науки о жизни . 9 : 17–19.
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Пример протокола Холли Беннет и Джо ДеРизи был создан в Rosetta Informatics и модифицирован Крисом Зайделом. [1]
- ^ Зейдел, Крис. «Приготовление флуоресцентного зонда» . Проверено 24 марта 2014 г.