Пора-С

Pore-C — это геномный метод. ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]}^{[ 3 ]} который использует захват конформации хроматина (3C) и Oxford Nanopore Technologies (ONT) секвенирование длинного считывания для характеристики трехмерной (3D) структуры хроматина . Чтобы охарактеризовать конкатемеры , создатели Pore-C разработали алгоритм для идентификации выравниваний, которые присвоены рестрикционному фрагменту ; конкатемеры с более чем двумя связанными фрагментами считаются высшим порядком. ^{[ 2 ]} Pore-C пытается улучшить предыдущие технологии 3C, такие как Hi-C и SPRITE, не требуя амплификации ДНК перед секвенированием. ^{[ 2 ]} Эта технология была разработана как более простой и легко масштабируемый метод захвата структуры хроматина более высокого порядка и картирования областей контакта хроматина. Кроме того, Pore-C можно использовать для визуализации эпигеномных взаимодействий благодаря способности секвенирования длинного чтения ONT обнаруживать метилирование ДНК . Приложения этой технологии включают анализ комбинаторных взаимодействий хроматина, генерацию сборок масштаба хромосом de novo , визуализацию областей, связанных с многолокусными гистоновыми телами, а также обнаружение и разрешение структурных вариантов . ^{[ 2 ]}

Фон

Хотя ДНК внутри эукариотических каждой клетки клеток линейна, она также сложно сложена и упакована, чтобы соответствовать ядру . ^{[ 4 ]}^{[ 5 ]} Таким образом, определенные части генома могут находиться ближе в физическом пространстве, чем можно было бы предположить, основываясь только на последовательности ДНК. 3D-геном относится к тому, как ДНК пространственно организована внутри клеток. ^{[ 4 ]}^{[ 5 ]} Трехмерные структуры, обнаруженные в геноме, включают активный и неактивный хроматин, петли хроматина и топологически связанные домены (TAD). Эти структуры регулируют экспрессию генов . В геномных и эпигеномных исследованиях структуру хроматина чаще всего визуализируют методами 3С, ^{[ 5 ]} которые количественно оценивают взаимодействие между локусами для построения трехмерной карты. Фундаментальный метод 3C используется для количественной оценки взаимодействий между парами геномных локусов. Методы, основанные на этой технике, такие как анализы 4C, 5C и Hi-C , позволяют количественно оценивать парные взаимодействия между несколькими локусами. ^{[ 6 ]} Другие варианты, такие как ChIP -loop. ^{[ 6 ]} и ЧИА-ПЭТ , ^{[ 7 ]} объедините 3C с анализами иммунопреципитации , чтобы обнаружить взаимодействия, опосредованные интересующим белком. Все эти методы включают этап амплификации, чаще всего с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Ограничением большинства современных 3D-анализов хроматина является то, что они менее полезны для классификации взаимодействий между более чем двумя локусами, и Pore-C был разработан, чтобы заполнить этот пробел в технологии. ^{[ 2 ]} Кроме того, отсутствие необходимости в ПЦР-амплификации упрощает рабочий процесс, поэтому Pore-C задуман как более простой и легко масштабируемый, чем предыдущие методы. Pore-C также можно использовать в популяциях клеток для характеристики полиморфизма топологии в определенных локусах. ^{[ 2 ]}

Методология

Многие методы характеристики трехмерного генома представляют собой вариации технологии 3C. ^{[ 5 ]} Как и другие технологии на основе 3C, ^{[ 5 ]} Pore-C стремится охарактеризовать архитектуру трехмерного генома, определяя, какие геномные локусы находятся в непосредственной пространственной близости (в пределах ~ 200 нм). ^{[ 2 ]} Подобно предыдущим методам на основе 3C, ^{[ 5 ]} Pore-C основан на сшивании, расщеплении рестриктазами , бесконтактном лигировании, обратном сшивании и стадиях деградации белка. ^{[ 2 ]} Однако Pore-C отличается от многих предыдущих методов последующим использованием секвенирования длинного чтения ONT, которое облегчает разрешение многосторонних контактов хромосом и одновременное обнаружение метилирования ДНК. ^{[ 2 ]}^{[ 3 ]}

Сшивание ДНК с белком

Во-первых, чтобы сохранить трехмерную структуру генома от деградации на последующих этапах, ДНК сшивается с ДНК-ассоциированными белками, такими как гистоны . ^{[ 2 ]}Формальдегид используется для сшивания, поскольку он соединяет ДНК с белками ковалентными связями, временно фиксируя трехмерный геном на месте. ^{[ 8 ]} В частности, после серии промываний фосфатно-солевым буфером (PBS) клетки осаждают центрифугированием, а затем ресуспендируют в растворе формальдегида и PBS. После короткого инкубационного периода добавляют глицин , чтобы остановить реакцию сшивки. ^{[ 8 ]}^{[ 2 ]} Гася избыток формальдегида, глицин предотвращает завершение реакции, тем самым максимизируя эффективность последующих стадий и обеспечивая обратимость реакции сшивки. ^{[ 8 ]}

Переваривание рестриктазами и бесконтактное лигирование

Сшивка создает петли ДНК, каждая из которых возникает из отдельного локуса. ^{[ 5 ]} Чтобы уловить долгосрочные взаимодействия между удаленными локусами, потенциально из разных хромосом, эти петли сначала разрезаются, а затем снова соединяются вместе на основе близости. Хотя фрагменты, происходящие из одной и той же петли, могут повторно отжигаться вместе, иногда фрагменты из отдельных петель лигируются вместе, создавая таким образом химерные последовательности. ^{[ 5 ]} Разрезание и повторное соединение ДНК достигается за счет расщепления ферментами рестрикции in situ и стадий бесконтактного лигирования соответственно. В частности, эндонуклеаза рестрикции разрезает ДНК, образуя свободные концы, тогда как лигаза Т4 используется для соединения фрагментов. ^{[ 5 ]} В конечном итоге эти шаги приводят к тому, что геномные локусы, расположенные близко друг к другу в физическом пространстве, соединяются вместе на смежных сегментах ДНК, называемых конкатемерами. ^{[ 2 ]}

Обращение перекрестных связей, деградация белков и очистка ДНК

Далее, чтобы выделить ДНК для секвенирования, необходимо отделить и разрушить белки, связанные с ДНК. ^{[ 5 ]} Сначала добавляют протеиназу К, додецилсульфат натрия (ДСН; детергент), Твин-20 и воду, не содержащую нуклеазы. ^{[ 2 ]} Затем реакцию нагревают до 56 °C в термоциклере для оптимальной кинетики реакции. Протеиназа К разрушает белки, а ДСН действует как денатурирующий агент, разрушающий структуру белка. ^{[ 9 ]}^{[ 10 ]} Эта реакция приводит к разрыву ковалентных связей между ДНК и белком и устраняет потенциальное загрязнение белка. ^{[ 5 ]} Затем ДНК выделяют и очищают, обычно используя фенол-хлороформовую экстракцию с последующим осаждением этанолом. ^{[ 2 ]}

Выбор размера, подготовка библиотеки и секвенирование длительного считывания.

Конкатемеры Pore-C подвергаются отбору по размеру перед подготовкой библиотеки и секвенированием длинного считывания ONT. ^{[ 2 ]} Благодаря выбору размера Pore-C способен обнаруживать взаимодействия высокого порядка, которые определяются как конкатемеры, содержащие более двух фрагментов ДНК. В частности, выбор размера Pore-C обогащает последовательности ДНК размером более 1,5 т.п.н., тем самым отфильтровывая более короткие конкатемеры, которые вряд ли будут содержать более двух фрагментов. ^{[ 2 ]} Для секвенирования длинного считывания ONT было разработано множество методов выбора размера. ^{[ 11 ]} Например, в литературе по Pore-C использовался выбор размера по твердофазной обратимой иммобилизации (SPRI). ^{[ 2 ]}^{[ 3 ]} После выбора размера выполняется подготовка библиотеки для секвенирования длинного считывания ONT, обычно с использованием набора для лигирования, предоставляемого ONT. Ключевые этапы включают восстановление ДНК и лигирование адаптера. ^{[ 2 ]}^{[ 3 ]} Впоследствии ДНК загружается в проточные ячейки для секвенирования, где каждый конкатемер подается через пору с помощью моторного белка. ^{[ 2 ]}^{[ 11 ]} Азотистые основания ДНК считываются путем характерного для них нарушения электрического тока. ^{[ 11 ]}

Биоинформатический анализ

В целом, биоинформационные подходы, примененные к данным Pore-C, позволяют сделать вывод о парных и многосторонних контактах между локусами. ^{[ 2 ]} Поскольку конкатемеры в Pore-C содержат последовательности ДНК, происходящие из разных областей генома, согласование считываний секвенирования с эталонным геномом является сложной задачей. Одним из решений этой проблемы является создание биоинформационного конвейера, использующего жадный кусочный алгоритм. ^{[ 2 ]} Дальнейший анализ результатов Pore-C зависит от исследования и других типов данных. ^{[ 3 ]}

Приложения

Pore-C — относительно новый метод, поэтому его применение еще не оценено в полной мере. ^{[ 2 ]} Преимущество Pore-C по сравнению с предыдущими методами заключается в его способности обнаруживать взаимодействия между более чем двумя геномными локусами. Такие взаимодействия высокого порядка позволяют изучать клеточные процессы, такие как регуляция экспрессии генов, на более системном уровне. ^{[ 2 ]}^{[ 3 ]} С помощью статистических методов данные Pore-C можно использовать для идентификации кооперативных взаимодействий, при которых взаимодействия высокого порядка наблюдаются с частотой, большей, чем сумма их ожидаемых парных контактов. ^{[ 2 ]} Кроме того, используя длинные чтения ONT, Pore-C может обнаруживать метилирование ДНК, тем самым предоставляя дополнительный уровень эпигенетической информации для анализа. ^{[ 2 ]} В будущем Pore-C может быть применен для изучения того, как трехмерный геном меняется во время процессов развития, таких как клеточная дифференциация. ^{[ 3 ]} Кроме того, Pore-C может применяться для изучения рака, где трехмерный геном часто подвергается структурной перестройке, что может привести к аберрантной транскрипции генов посредством таких процессов, как захват энхансера. ^{[ 2 ]}

Использовать

Преимущества

Pore-C имеет более высокую эффективность и точность по сравнению с предыдущими методами. ^{[ 1 ]}
Отсутствие этапа амплификации, который требуется в других методах захвата конформации хроматина, упрощает протокол эксперимента. Кроме того, при обнаружении метилирования ДНК не требуется конверсия бисульфита (как требуется в Mmethyl-HiC).
Pore-C может обнаруживать больше взаимодействий более высокого порядка, чем Hi-C и другие предыдущие методы. ^{[ 1 ]} потому что конкатемеры могут охватывать несколько хромосом и обнаруживать дистальные взаимодействия. Ранее эти взаимодействия были недостаточно изучены из-за ограничений предыдущих методов.
Поскольку длинное секвенирование ONT может обнаружить метилирование ДНК, Pore-C может быть расширен для характеристики эпигенетических взаимодействий и их связи с топологией хроматина.

Ограничения

Технология секвенирования Oxford Nanopore является дорогостоящей. ^{[ 12 ]} и поэтому Pore-C обходится дороже по сравнению с другими методами захвата конформации хроматина.
Пропускная способность Pore-C относительно низкая по сравнению с другими методами, особенно из-за того, что связанные с ДНК белки закупоривают поры секвенирования. Это может привести к снижению эффективности, особенно в сочетании с относительно высокой стоимостью одного запуска. Однако недавняя работа ^{[ 12 ]} показало, что производительность можно увеличить, обрабатывая фрагменты ДНК протеазами для уменьшения засорения.
Поскольку Pore-C основан на технологии длинного считывания ONT, на него распространяются те же ограничения. Например, более длинные чтения могут быть менее точными по сравнению с более короткими чтениями. ^{[ нужна ссылка ]}
Поскольку Pore-C является более новым методом, он относительно непроверен и не тестировался в той же степени, что и другие методы захвата конформации хроматина. ^{[ нужна ссылка ]}

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б ^с Улаханнан, Нета; Пендлтон, Мэтью; Дешпанде, Адитья; Швенк, Стефан; Бер, Джули М. (07.11.2019). «Нанопоровое секвенирование конкатемеров ДНК выявляет особенности структуры хроматина более высокого порядка» . bioRxiv : 833590. doi : 10.1101/833590 . S2CID 209606104 . Проверено 9 марта 2023 г.
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж ^к ^л ^м ^н ^тот ^п ^д ^р ^с ^т ^в ^v ^В ^х ^и ^С Дешпанде, Адитья; Улаханнан, Нета; Пендлтон, Мэтью; Дай, Сяогуан; Ли, Линн (30 мая 2022 г.). «Нанопоровое секвенирование конкатемеров ДНК выявляет особенности структуры хроматина более высокого порядка» . Природная биотехнология . 40 (10): 1488–1499. дои : 10.1038/s41587-022-01289-z . ПМИД 35637420 . S2CID 249217259 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г Дотсон, Габриель; Чен, Джан; Линдсли, Стивен; Чикало, Энтони; Дилворт, Сэм (20 сентября 2022 г.). «Расшифровка многосторонних взаимодействий в геноме человека» . Природные коммуникации . 13 (1): 5498. Бибкод : 2022NatCo..13.5498D . дои : 10.1038/s41467-022-32980-z . ПМЦ 9489732 . ПМИД 36127324 .
^ Jump up to: ^а ^б Хафнер, Антонина; Беттигер, Алистер (14 сентября 2022 г.). «Пространственная организация транскрипционного контроля» . Обзоры природы Генетика . 24 (1): 53–68. дои : 10.1038/s41576-022-00526-0 . ПМИД 36104547 . S2CID 252282267 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж ^к Паттон МакКорд, Рэйчел; Каплан, Ноам; Джорджетти, Лука (27 января 2020 г.). «Захват конформации хромосом и не только: к интегративному взгляду на структуру и функцию хромосом. Пространственная организация контроля транскрипции» . Молекулярная клетка . 77 (4): 688–708. doi : 10.1016/j.molcel.2019.12.021 . ПМЦ 7134573 . ПМИД 32001106 .
^ Jump up to: ^а ^б де Вит, Эльцо; де Лаат, Воутер (1 января 2012 г.). «Десятилетие технологий 3C: взгляд на ядерную организацию» . Генс Дев . 26 (1): 11–24. дои : 10.1186/1471-2164-15-S12-S11 . ПМЦ 3258961 . ПМИД 22215806 .
^ Ли, Голян; Цай, Люян; Чанг, Хуэйдан; Хун, Пинг; Чжоу, Цянвэй (19 декабря 2014 г.). «Анализ взаимодействия хроматина с использованием технологии и применения секвенирования парных концевых меток (ChIA-PET)» . БМК Геномика . 15 (12): С11. дои : 10.1186/1471-2164-15-S12-S11 . ПМК 4303937 . ПМИД 25563301 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с Хоффман, Элизабет А.; Фрей, Брайан Л.; Смит, Ллойд М.; Обл, Дэвид Т. (2015). «Сшивка формальдегидом: инструмент для изучения хроматиновых комплексов» . Журнал биологической химии . 290 (44): 26404–26411. дои : 10.1074/jbc.R115.651679 . ПМЦ 4646298 . ПМИД 26354429 .
^ Вебер, Клаус; Кутер, Дэвид Дж. (1971). «Обратимая денатурация ферментов додецилсульфатом натрия» . Журнал биологической химии . 246 (14): 4504–4509. дои : 10.1016/S0021-9258(18)62040-X . ПМИД 5106387 .
^ МакКинли, член парламента; Болтон, округ Колумбия; Прусинер, С.Б. (1983). «Устойчивый к протеазе белок является структурным компонентом приона скрепи» . Клетка . 1 (1): 57–62. дои : 10.1016/0092-8674(83)90207-6 . ПМИД 6414721 . S2CID 34383066 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с Ван, Юнхао; Чжао, Юэ; Боллас, Одри; Ван, Юру; Ау, Кин Фай (08.11.2021). «Технология секвенирования нанопор, биоинформатика и приложения» . Природная биотехнология . 39 (11): 1348–1365. дои : 10.1038/s41587-021-01108-x . ПМЦ 8988251 . ПМИД 34750572 .
^ Jump up to: ^а ^б Чжун, Цзя-Юн; Ню, Лунцзянь; Линь, Чжо-Бин; Бай, Синь; Чен, Ин; Ло, Фэн; Хоу, Чуньхуэй; Сяо, Чуан-Ле (2023). «Высокопроизводительная Pore-C выявляет одноаллельную топологию и специфичность типа клеток трехмерного сворачивания генома» . Природные коммуникации . 14 (1): 1250. Бибкод : 2023NatCo..14.1250Z . дои : 10.1038/s41467-023-36899-x . ПМЦ 9988853 . ПМИД 36878904 .

[Ulahannan2019-1] Jump up to: ^а ^б ^с Улаханнан, Нета; Пендлтон, Мэтью; Дешпанде, Адитья; Швенк, Стефан; Бер, Джули М. (07.11.2019). «Нанопоровое секвенирование конкатемеров ДНК выявляет особенности структуры хроматина более высокого порядка» . bioRxiv : 833590. doi : 10.1101/833590 . S2CID 209606104 . Проверено 9 марта 2023 г.

[Deshpande2022-2] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж ^к ^л ^м ^н ^тот ^п ^д ^р ^с ^т ^в ^v ^В ^х ^и ^С Дешпанде, Адитья; Улаханнан, Нета; Пендлтон, Мэтью; Дай, Сяогуан; Ли, Линн (30 мая 2022 г.). «Нанопоровое секвенирование конкатемеров ДНК выявляет особенности структуры хроматина более высокого порядка» . Природная биотехнология . 40 (10): 1488–1499. дои : 10.1038/s41587-022-01289-z . ПМИД 35637420 . S2CID 249217259 .

[Dotson2022-3] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г Дотсон, Габриель; Чен, Джан; Линдсли, Стивен; Чикало, Энтони; Дилворт, Сэм (20 сентября 2022 г.). «Расшифровка многосторонних взаимодействий в геноме человека» . Природные коммуникации . 13 (1): 5498. Бибкод : 2022NatCo..13.5498D . дои : 10.1038/s41467-022-32980-z . ПМЦ 9489732 . ПМИД 36127324 .

[Hafner2023-4] Jump up to: ^а ^б Хафнер, Антонина; Беттигер, Алистер (14 сентября 2022 г.). «Пространственная организация транскрипционного контроля» . Обзоры природы Генетика . 24 (1): 53–68. дои : 10.1038/s41576-022-00526-0 . ПМИД 36104547 . S2CID 252282267 .

[McCord2020-5] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж ^к Паттон МакКорд, Рэйчел; Каплан, Ноам; Джорджетти, Лука (27 января 2020 г.). «Захват конформации хромосом и не только: к интегративному взгляду на структуру и функцию хромосом. Пространственная организация контроля транскрипции» . Молекулярная клетка . 77 (4): 688–708. doi : 10.1016/j.molcel.2019.12.021 . ПМЦ 7134573 . ПМИД 32001106 .

[deWit2012-6] Jump up to: ^а ^б де Вит, Эльцо; де Лаат, Воутер (1 января 2012 г.). «Десятилетие технологий 3C: взгляд на ядерную организацию» . Генс Дев . 26 (1): 11–24. дои : 10.1186/1471-2164-15-S12-S11 . ПМЦ 3258961 . ПМИД 22215806 .

[Li2014-7] Ли, Голян; Цай, Люян; Чанг, Хуэйдан; Хун, Пинг; Чжоу, Цянвэй (19 декабря 2014 г.). «Анализ взаимодействия хроматина с использованием технологии и применения секвенирования парных концевых меток (ChIA-PET)» . БМК Геномика . 15 (12): С11. дои : 10.1186/1471-2164-15-S12-S11 . ПМК 4303937 . ПМИД 25563301 .

[Hoffman2015-8] Jump up to: ^а ^б ^с Хоффман, Элизабет А.; Фрей, Брайан Л.; Смит, Ллойд М.; Обл, Дэвид Т. (2015). «Сшивка формальдегидом: инструмент для изучения хроматиновых комплексов» . Журнал биологической химии . 290 (44): 26404–26411. дои : 10.1074/jbc.R115.651679 . ПМЦ 4646298 . ПМИД 26354429 .

[Weber1971-9] Вебер, Клаус; Кутер, Дэвид Дж. (1971). «Обратимая денатурация ферментов додецилсульфатом натрия» . Журнал биологической химии . 246 (14): 4504–4509. дои : 10.1016/S0021-9258(18)62040-X . ПМИД 5106387 .

[McKinley1983-10] МакКинли, член парламента; Болтон, округ Колумбия; Прусинер, С.Б. (1983). «Устойчивый к протеазе белок является структурным компонентом приона скрепи» . Клетка . 1 (1): 57–62. дои : 10.1016/0092-8674(83)90207-6 . ПМИД 6414721 . S2CID 34383066 .

[Wang2021-11] Jump up to: ^а ^б ^с Ван, Юнхао; Чжао, Юэ; Боллас, Одри; Ван, Юру; Ау, Кин Фай (08.11.2021). «Технология секвенирования нанопор, биоинформатика и приложения» . Природная биотехнология . 39 (11): 1348–1365. дои : 10.1038/s41587-021-01108-x . ПМЦ 8988251 . ПМИД 34750572 .

[Xiao2022-12] Jump up to: ^а ^б Чжун, Цзя-Юн; Ню, Лунцзянь; Линь, Чжо-Бин; Бай, Синь; Чен, Ин; Ло, Фэн; Хоу, Чуньхуэй; Сяо, Чуан-Ле (2023). «Высокопроизводительная Pore-C выявляет одноаллельную топологию и специфичность типа клеток трехмерного сворачивания генома» . Природные коммуникации . 14 (1): 1250. Бибкод : 2023NatCo..14.1250Z . дои : 10.1038/s41467-023-36899-x . ПМЦ 9988853 . ПМИД 36878904 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]