Пятно Хехста

Красители Хёхста относятся к семейству синих флуоресцентных красителей, используемых для окрашивания ДНК . ^[1]^[2] Эти бис-бензимиды были первоначально разработаны компанией Hoechst AG , которая пронумеровала все свои соединения так, что краситель Hoechst 33342 является 33 342-м соединением, производимым компанией. Существует три родственных красителя Hoechst: Hoechst 33258, Hoechst 33342 и Hoechst 34580. Красители Hoechst 33258 и Hoechst 33342 являются наиболее часто используемыми и имеют схожие возбуждения - спектры эмиссии .

Молекулярные характеристики

Оба красителя возбуждаются ультрафиолетовым светом с длиной волны около 350 нм , и оба излучают сине-голубой флуоресцентный свет в районе максимума спектра излучения при 461 нм. Максимальное излучение флуоресценции несвязанного красителя приходится на диапазон 510–540 нм. Пятна Хехста можно возбуждать ксеноновой или ртутно-дуговой лампой или ультрафиолетовым лазером . Существует значительный стоксов сдвиг между спектрами возбуждения и излучения, что делает красители Hoechst полезными в экспериментах, в которых несколько флуорофоров используются . Интенсивность флуоресценции красителей Hoechst также увеличивается с pH растворителя увеличением . ^[3]

Красители Hoechst растворимы в воде и органических растворителях, таких как диметилформамид или диметилсульфоксид . Концентрации могут достигать до 10 мг/мл. Водные растворы стабильны при температуре 2–6 °C в течение не менее шести месяцев в защищенном от света месте. Для длительного хранения растворы вместо этого замораживают при температуре -20 ° C или ниже. ^[3]

Красители связываются с малой бороздкой двухцепочечной ДНК, отдавая предпочтение последовательностям, богатым аденином и тимином . Хотя красители могут связываться со всеми нуклеиновыми кислотами, богатые АТ двухцепочечные цепи ДНК значительно усиливают флуоресценцию. ^[4] Красители Hoechst проницаемы для клеток и могут связываться с ДНК в живых или фиксированных клетках . Таким образом, эти пятна часто называют суправитальными , что означает, что живые клетки выдерживают обработку этими соединениями. Клетки, которые экспрессируют специфические переносчики АТФ-связывающей кассеты, белки- также могут активно выводить эти пятна из своей цитоплазмы . ^{[ нужна ссылка ]}

Приложения

Концентрация 0,1–12 мкг/мл обычно используется для окрашивания ДНК бактерий или клеток эукариот . Клетки окрашивают в течение 1–30 минут при комнатной температуре или 37 °C, а затем промывают для удаления несвязавшегося красителя. Зеленую флуоресценцию несвязанного красителя Хёхста можно наблюдать на образцах, окрашенных слишком большим количеством красителя или частично промытых. ^[3] Красители Hoechst часто используются в качестве заменителей другого красителя нуклеиновой кислоты, называемого DAPI .

Ключевые различия между красителями Hoechst и DAPI:

Красители Hoechst менее токсичны, чем DAPI, что обеспечивает более высокую жизнеспособность окрашенных клеток. ^[5]
Дополнительная этильная группа в некоторых красителях Hoechst (Hoechst 33342) делает их более проницаемыми для клеток. ^[6]
Существуют красители, окрашивающие ядра, которые обеспечивают жизнеспособность клеток после окрашивания. ^{[ нужна ссылка ]}

Hoechst 33342 и 33258 гасятся бромдезоксиуридином ( BrdU ), который обычно используется для обнаружения делящихся клеток. Hoechst 33342 демонстрирует в 10 раз большую клеточную проницаемость, чем H 33258. Клетки могут интегрировать BrdU во вновь синтезированную ДНК в качестве замены тимидина . Предполагается, что когда BrdU интегрируется в ДНК, бром деформирует малую бороздку, так что красители Hoechst не могут достичь своего оптимального сайта связывания. Связывание красителей Hoechst с BrdU-замещенной ДНК еще сильнее; однако флуоресценции не происходит. Красители Hoechst можно использовать с BrdU для мониторинга хода клеточного цикла . ^[7]^[8]

Красители Hoechst обычно используются для окрашивания геномной ДНК в следующих целях:

Флуоресцентная микроскопия и иммуногистохимия , часто с другими флуорофорами. ^[9]
Проточная цитометрия для подсчета или сортировки клеток. Примером может служить использование красителей Hoechst для анализа того, сколько клеток в популяции находится в какой фазе клеточного цикла. ^[10]
Обнаружение ДНК в присутствии РНК в агарозных гелях ^[11]
Автоматизированное определение ДНК ^[12]
Сортировка хромосом ^[11]

Отток Hoechst также используется для изучения гемопоэтических и эмбриональных стволовых клеток. Поскольку эти клетки способны эффективно отводить краситель, их можно обнаружить с помощью проточной цитометрии в так называемой боковой популяции . Это делается путем пропускания флуоресценции, излучаемой возбужденным хёхстом, через красный и синий фильтры и построения графика красного и синего хехста друг против друга. ^{[ нужна ссылка ]}

Токсичность и безопасность

Поскольку пятна Хехста связываются с ДНК, они мешают репликации ДНК во время деления клеток . Следовательно, они потенциально мутагены и канцерогенны , поэтому при обращении с ними и их утилизации следует соблюдать осторожность. Окраска Хехста используется для сортировки спермы у домашнего скота и человека. Его безопасность обсуждается. ^[13]^[14]

См. также

Ссылки

^ Латт, ЮАР; Стеттен, Г; Юргенс, Луизиана; Уиллард, ХФ; Шер, компакт-диск (июль 1975 г.). «Последние разработки в области обнаружения синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты с помощью флуоресценции 33258 Hoechst» . Журнал гистохимии и цитохимии . 23 (7): 493–505. дои : 10.1177/23.7.1095650 . ПМИД 1095650 .
^ Латт, ЮАР; Стеттен, Г. (январь 1976 г.). «Спектральные исследования 33258 Hoechst и родственных бисбензимидазольных красителей, полезных для флуоресцентного обнаружения синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты» . Журнал гистохимии и цитохимии . 24 (1): 24–33. дои : 10.1177/24.1.943439 . ПМИД 943439 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с «Пятна Хехста» (PDF) . Инвитрогрен (Молекулярные зонды). Архивировано из оригинала (PDF) 19 апреля 2009 г.
^ Португалия, Дж; Уоринг, MJ (28 февраля 1988 г.). «Назначение сайтов связывания ДНК для 4',6-диамидин-2-фенилиндола и бисбензимида (Hoechst 33258). Сравнительное исследование следов». Biochimica et Biophysical Acta (BBA) – Структура и экспрессия генов . 949 (2): 158–68. дои : 10.1016/0167-4781(88)90079-6 . ПМИД 2449244 .
^ BD Bioscience (2009). Методы анализа иммунной функции (PDF) (2-е изд.). Бектон, Дикинсон и компания.
^ Буцявичюс, Йонас; Лукинавичюс, Гражвидас; Герасимайте, Рута (18.04.2018). «Использование красителей Hoechst для окрашивания ДНК и не только» . Хемосенсоры . 6 (2): 18. doi : 10.3390/chemosensors6020018 . hdl : 21.11116/0000-0001-A4FE-8 . ISSN 2227-9040 .
^ Куббис, М; Рабинович, П.С. (январь 1983 г.). «Проточный цитометрический анализ факторов, влияющих на эффект тушения BrdUrd-Hoechst в культивируемых человеческих фибробластах и лимфоцитах» . Цитометрия . 3 (4): 276–81. дои : 10.1002/cyto.990030408 . ПМИД 6185287 .
^ Бреузегем, Ю.Ю.; Клегг, Р.М.; Лунтьенс, ФГ (1 февраля 2002 г.). «Специфичность базовых последовательностей связывания Hoechst 33258 и DAPI с пятью (A/T)4 сайтами ДНК с кинетическими данными для более чем одного высокоаффинного комплекса Hoechst 33258-AATT». Журнал молекулярной биологии . 315 (5): 1049–61. дои : 10.1006/jmbi.2001.5301 . ПМИД 11827475 .
^ Иэн Джонсон, Мишель Т. З. Спенс, изд. (2011). Справочник по молекулярным зондам: Руководство по флуоресцентным зондам и технологиям маркировки (11-е изд.). Инвитроген. ISBN 978-0-9829279-1-5 .
^ Куббис, М (1990). «Проточно-цитометрическое распознавание вызванного кластогеном повреждения хроматина в лимфоцитах G0/G1 путем нестехиометрического связывания флуорохрома Хехста» . Цитометрия . 11 (3): 386–94. дои : 10.1002/cyto.990110309 . ПМИД 1692786 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Мочарла, Р; Мочарла, Х; Ходс, Мэн (23 декабря 1987 г.). «Новый чувствительный метод флуорометрического окрашивания для обнаружения ДНК в препаратах РНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 15 (24): 10589. doi : 10.1093/nar/15.24.10589 . ПМЦ 339970 . ПМИД 2447564 .
^ Стерзель, В; Бедфорд, П; Эйзенбранд, Г. (июнь 1985 г.). «Автоматическое определение ДНК с использованием флуорохрома Hoechst 33258». Аналитическая биохимия . 147 (2): 462–7. дои : 10.1016/0003-2697(85)90299-4 . ПМИД 2409841 .
^ Эшвуд-Смит, MJ (1994). «Безопасность отбора спермы человека методом проточной цитометрии». Репродукция человека . 9 (5). Издательство Оксфордского университета : 757–759. doi : 10.1093/oxfordjournals.humrep.a138589 . ПМИД 7929716 .
^ Паррилла, я; Васкес, Х.М.; Куэльо, К; Гил, Массачусетс; Рока, Дж; Ди Берардино, защитник; Мартинес, Э.А. (2004). «Окрашивание Hoechst 33342 и воздействие ультрафиолетового лазера не вызывают генотоксических эффектов в сперматозоидах хряка, отсортированных методом проточной сортировки» . Размножение . 128 (5): 615–621. дои : 10.1530/rep.1.00288 . ПМИД 15509707 .

Внешние ссылки

[1] Латт, ЮАР; Стеттен, Г; Юргенс, Луизиана; Уиллард, ХФ; Шер, компакт-диск (июль 1975 г.). «Последние разработки в области обнаружения синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты с помощью флуоресценции 33258 Hoechst» . Журнал гистохимии и цитохимии . 23 (7): 493–505. дои : 10.1177/23.7.1095650 . ПМИД 1095650 .

[2] Латт, ЮАР; Стеттен, Г. (январь 1976 г.). «Спектральные исследования 33258 Hoechst и родственных бисбензимидазольных красителей, полезных для флуоресцентного обнаружения синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты» . Журнал гистохимии и цитохимии . 24 (1): 24–33. дои : 10.1177/24.1.943439 . ПМИД 943439 .

[Hoechst_Stains-3] Перейти обратно: ^а ^б ^с «Пятна Хехста» (PDF) . Инвитрогрен (Молекулярные зонды). Архивировано из оригинала (PDF) 19 апреля 2009 г.

[4] Португалия, Дж; Уоринг, MJ (28 февраля 1988 г.). «Назначение сайтов связывания ДНК для 4',6-диамидин-2-фенилиндола и бисбензимида (Hoechst 33258). Сравнительное исследование следов». Biochimica et Biophysical Acta (BBA) – Структура и экспрессия генов . 949 (2): 158–68. дои : 10.1016/0167-4781(88)90079-6 . ПМИД 2449244 .

[5] BD Bioscience (2009). Методы анализа иммунной функции (PDF) (2-е изд.). Бектон, Дикинсон и компания.

[6] Буцявичюс, Йонас; Лукинавичюс, Гражвидас; Герасимайте, Рута (18.04.2018). «Использование красителей Hoechst для окрашивания ДНК и не только» . Хемосенсоры . 6 (2): 18. doi : 10.3390/chemosensors6020018 . hdl : 21.11116/0000-0001-A4FE-8 . ISSN 2227-9040 .

[7] Куббис, М; Рабинович, П.С. (январь 1983 г.). «Проточный цитометрический анализ факторов, влияющих на эффект тушения BrdUrd-Hoechst в культивируемых человеческих фибробластах и лимфоцитах» . Цитометрия . 3 (4): 276–81. дои : 10.1002/cyto.990030408 . ПМИД 6185287 .

[8] Бреузегем, Ю.Ю.; Клегг, Р.М.; Лунтьенс, ФГ (1 февраля 2002 г.). «Специфичность базовых последовательностей связывания Hoechst 33258 и DAPI с пятью (A/T)4 сайтами ДНК с кинетическими данными для более чем одного высокоаффинного комплекса Hoechst 33258-AATT». Журнал молекулярной биологии . 315 (5): 1049–61. дои : 10.1006/jmbi.2001.5301 . ПМИД 11827475 .

[9] Иэн Джонсон, Мишель Т. З. Спенс, изд. (2011). Справочник по молекулярным зондам: Руководство по флуоресцентным зондам и технологиям маркировки (11-е изд.). Инвитроген. ISBN 978-0-9829279-1-5 .

[10] Куббис, М (1990). «Проточно-цитометрическое распознавание вызванного кластогеном повреждения хроматина в лимфоцитах G0/G1 путем нестехиометрического связывания флуорохрома Хехста» . Цитометрия . 11 (3): 386–94. дои : 10.1002/cyto.990110309 . ПМИД 1692786 .

[Morchala1987-11] Перейти обратно: ^а ^б Мочарла, Р; Мочарла, Х; Ходс, Мэн (23 декабря 1987 г.). «Новый чувствительный метод флуорометрического окрашивания для обнаружения ДНК в препаратах РНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 15 (24): 10589. doi : 10.1093/nar/15.24.10589 . ПМЦ 339970 . ПМИД 2447564 .

[12] Стерзель, В; Бедфорд, П; Эйзенбранд, Г. (июнь 1985 г.). «Автоматическое определение ДНК с использованием флуорохрома Hoechst 33258». Аналитическая биохимия . 147 (2): 462–7. дои : 10.1016/0003-2697(85)90299-4 . ПМИД 2409841 .

[ashwoodsmith1-13] Эшвуд-Смит, MJ (1994). «Безопасность отбора спермы человека методом проточной цитометрии». Репродукция человека . 9 (5). Издательство Оксфордского университета : 757–759. doi : 10.1093/oxfordjournals.humrep.a138589 . ПМИД 7929716 .

[Parilla-14] Паррилла, я; Васкес, Х.М.; Куэльо, К; Гил, Массачусетс; Рока, Дж; Ди Берардино, защитник; Мартинес, Э.А. (2004). «Окрашивание Hoechst 33342 и воздействие ультрафиолетового лазера не вызывают генотоксических эффектов в сперматозоидах хряка, отсортированных методом проточной сортировки» . Размножение . 128 (5): 615–621. дои : 10.1530/rep.1.00288 . ПМИД 15509707 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]