Пространственно-модулированное освещение Vertico
Пространственно-модулированное освещение Vertico ( Vertico-SMI ) является самым быстрым [ нужна ссылка ] световой микроскоп для 3D-анализа целых клеток в нанометровом диапазоне. Он основан на двух технологиях, разработанных в 1996 году: SMI (пространственно-модулированное освещение) и SPDM (спектральная прецизионная дальняя микроскопия). Эффективное оптическое разрешение этого оптического наноскопа достигло около 5 нм в 2D и 40 нм в 3D, что значительно превышает предел разрешения λ/2 (около 200 нм для синего света), применимый к стандартной микроскопии с использованием пропускания или отражения естественного света. (в отличие от структурированного освещения или флуоресценции ) в соответствии с пределом разрешения Аббе [1] Этот предел (также известный как предел Рэлея ) был определен Эрнстом Аббе в 1873 году и определяет достижимый предел разрешения микроскопов, использующих традиционные методы.
Микроскоп Vertico-SMI был разработан командой под руководством Кристофа Кремера , заслуженного исследователя. [2] в Гейдельбергском университете и основан на сочетании светооптических методов локализационной микроскопии (SPDM, спектральная прецизионная дистанционная микроскопия ) и структурированного освещения (SMI, пространственно-модулированное освещение ).
С марта 2008 года многие стандартные флуоресцентные красители, такие как красители GFP и флуоресцентные Alexa , можно использовать с так называемой локализационной микроскопией SPDMphymod (физически модифицируемые флуорофоры), для которой для нановизуализации достаточно только одной длины волны лазера подходящей интенсивности.
Конфигурация
[ редактировать ]SMI означает особый тип лазерного оптического освещения ( пространственно-модулированное освещение ), а Vertico отражает вертикальное расположение оси микроскопа, что делает возможным анализ фиксированных клеток , а также живых клеток с оптическим разрешением ниже 10 нанометров (1 нанометр = 1). нм = 1 × 10 −9 м).
Особенностью этой технологии по сравнению с методами фокусировки, такими как микроскопия 4Pi , является экспозиция в широком поле, которая позволяет отображать целые клетки в наномасштабе. Такое 3D-экспонирование целой клетки с типичным размером объекта 20 × 20 мкм требует всего 2 минуты. Широкоугольная экспозиция означает, что весь объект освещается и обнаруживается одновременно.
Пространственно модулированное освещение
[ редактировать ]
SMI-микроскопия представляет собой легкий оптический процесс так называемой функции рассеяния точки - инженерии. Это процессы, которые изменяют функцию рассеяния точки (PSF) микроскопа подходящим образом, чтобы либо увеличить оптическое разрешение, чтобы максимизировать точность измерения расстояний до флуоресцентных объектов, которые малы по сравнению с длиной волны освещающего света, либо чтобы извлечь другие структурные параметры в нанометровом диапазоне.
Микроскоп SMI, разрабатываемый в Физическом институте Кирхгофа при Гейдельбергском университете, достигает этого следующим образом: Интенсивность освещения в пределах диапазона объекта не является равномерной, в отличие от обычных флуоресцентных микроскопов с широким полем зрения, а точно модулируется в пространстве за счет использования двух противоположных интерферирующих лазерных лучей вдоль оси. Принцип пространственно модулированного волнового поля был разработан в 1993 году Бэйли и др. Подход SMI-микроскопии, используемый в приложении Heidelberg, перемещает объект высокоточными шагами через волновое поле или само волновое поле перемещается относительно объекта за счет фазового сдвига. Это приводит к улучшению осевого размера и разрешения по расстоянию. [3] [4]
SMI можно комбинировать с другими технологиями сверхвысокого разрешения, например, с 3D LIMON или LSI- TIRF в качестве интерферометра полного внутреннего отражения с латерально структурированным освещением. Этот метод SMI позволил получить светооптические изображения распределения автофлуорофоров в срезах тканей глаза человека с непревзойденным оптическим разрешением. Использование трех различных длин волн возбуждения (488, 568 и 647 нм) позволяет собирать спектральную информацию о сигнале автофлуоресценции. Его использовали для исследования тканей глаза человека, пораженных дегенерацией желтого пятна AMD. [5]
СПДМ: локализационная микроскопия
[ редактировать ]
Единственный крошечный источник света может быть обнаружен гораздо лучше, чем разрешение микроскопа: хотя свет создает размытое пятно, компьютерные алгоритмы можно использовать для точного расчета центра размытого пятна с учетом функции рассеяния точки . микроскопа, шумовые свойства детектора и т.д. Однако этот подход не работает, когда источников слишком много, расположенных близко друг к другу: все источники размываются.
SPDM (спектральная прецизионная дальняя микроскопия) — это семейство методов флуоресцентной микроскопии , которые позволяют обойти эту проблему, измеряя одновременно всего несколько источников, так что каждый источник «оптически изолирован» от других (т. е. отделен более чем расстоянием между ними). разрешение микроскопа обычно ~200-250 нм). [6] [7] [8] Затем можно использовать описанный выше метод (нахождение центра каждого размытого пятна).
Если молекулы имеют множество различных спектров (спектры поглощения и/или спектры излучения), то можно одновременно наблюдать свет всего нескольких молекул, используя соответствующие источники света и фильтры. Молекулы также можно различать более тонкими способами, основываясь на времени жизни флуоресценции и других методах. [6]
Структурное разрешение, достижимое с использованием SPDM, может быть выражено через наименьшее измеримое расстояние между двумя определяемыми их пространственным положением точечными частицами с различными спектральными характеристиками («топологическое разрешение»). Моделирование показало, что при подходящих условиях, касающихся точности локализации, плотности частиц и т. д., «топологическое разрешение» соответствует « пространственной частоте », которая в терминах классического определения эквивалентна значительно улучшенному оптическому разрешению.
SPDM - это локализационная микроскопия, которая обеспечивает эффективное оптическое разрешение, в несколько раз превышающее обычное оптическое разрешение (около 200-250 нм), представленное полушириной основного максимума функции изображения эффективной точки. Применяя подходящие лазерно-оптические прецизионные процессы, положение и расстояния, значительно меньшие, чем полуширина функции рассеяния точки (обычно 200–250 нм), могут быть измерены с нанометровой точностью между целями с разными спектральными характеристиками. [6] Важной областью применения являются геномные исследования (изучение функциональной организации генома ) . Еще одна важная область применения — исследование структуры мембран.
Одной из важнейших основ локализационной микроскопии в целом является первая экспериментальная работа по локализации флуоресцентных объектов в наномасштабе (3D) в 1996 г. [9] а также теоретическое и экспериментальное доказательство точности локализации с использованием видимого света в диапазоне 1 нм - основа микроскопии локализации лучше, чем 1/100 длины волны. [10] [11]
SPDMphymod: стандартные флуоресцентные красители в режиме мигания, такие как GFP.
[ редактировать ]
Только за последние два года в наноскопических исследованиях стали использоваться молекулы, которые излучают одну и ту же спектральную частоту света (но с разными спектральными характеристиками, основанными на характеристиках мигания), но которые можно включать и выключать с помощью света, что необходимо для точности спектра. дистанционная микроскопия. Объединив многие тысячи изображений одной и той же клетки, стало возможным использовать прецизионные лазерные оптические измерения для записи изображений локализации со значительно улучшенным оптическим разрешением. Применение этих новых процессов наноскопии до недавнего времени казалось очень трудным, поскольку предполагалось, что только специально изготовленные молекулы можно включать и выключать подходящим образом с помощью света.
В марте 2008 года лаборатория Кристофа Кремера обнаружила, что это также возможно для многих стандартных флуоресцентных красителей, таких как GFP , красителей Alexa и молекул флуоресцеина, при условии наличия определенных фотофизических условий. Используя эту так называемую технологию SPDMphymod (физически модифицируемые флуорофоры), для нановизуализации достаточно одной длины волны лазера подходящей интенсивности. Напротив, в других локализационных микроскопах требуются две длины волны лазера, когда используются специальные фотопереключаемые/фотоактивируемые флуоресцентные молекулы. [12]
Ген GFP был введен и экспрессирован во многих прокариотических и эукариотических клетках, а Нобелевская премия по химии 2008 года была присуждена Мартину Чалфи , Осаму Шимомуре и Роджеру Ю. Циену за открытие и разработку зеленого флуоресцентного белка. Открытие возможности использования этих стандартных флуоресцентных молекул расширяет возможности применения метода SPMD во многих областях исследований в области биофизики , клеточной биологии и медицины .
Стандартные флуоресцентные красители, уже успешно используемые с технологией SPDMphymod: GFP, RFP, YFP, Alexa 488, Alexa 568, Alexa 647, Cy2, Cy3, Atto 488 и флуоресцеин.
ЛИМОН: 3D-микроскопия сверхвысокого разрешения
[ редактировать ]LIMON (Световая микроскопическая наноразмерная микроскопия) была изобретена в 2001 году в Гейдельбергском университете и сочетает в себе локализационную микроскопию и пространственно-модулированное освещение с трехмерной микроскопией сверхвысокого разрешения.
Создание 3D-изображений с использованием Vertico-SMI становится возможным благодаря сочетанию SMI и SPDM, при котором сначала применяется процесс SMI, а затем процесс SPDM. Процесс SMI определяет центр частиц и их распространение в направлении оси микроскопа. Хотя центр частиц/молекул можно определить с точностью 1–2 нм, разброс вокруг этой точки можно определить до осевого диаметра прибл. 30-40 нм.
Впоследствии латеральное положение отдельных частиц/молекул определяется с помощью SPDM, достигая точности в несколько нанометров. В настоящее время SPDM достигает 16 кадров/сек с эффективным разрешением 10 нм в 2D (плоскость объекта); около 2000 таких кадров объединяются с данными SMI (время сбора данных около 10 секунд) для получения трехмерного изображения высочайшего разрешения (эффективное оптическое 3D-разрешение около 40-50 нм). С более быстрой камерой можно ожидать еще более высоких скоростей (до нескольких сотен кадров в секунду, в разработке). Использование подходящих красителей должно обеспечить еще более эффективное оптическое 3D-разрешение. [13]
Путем объединения SPDMphymod с SMI (оба изобретены в лаборатории Кристофа Кремера в 1996 году) была достигнута трехмерная двухцветная реконструкция пространственного расположения кластеров Her2/neu и Her3. Положения белковых кластеров во всех трех направлениях удалось определить с точностью около 25 нм. [14]
Использование микроскопии сверхвысокого разрешения в промышленности.
[ редактировать ]Несмотря на использование в биомедицинских лабораториях, технологии сверхвысокого разрешения могут служить важным инструментом в фармацевтических исследованиях. Они могут быть особенно полезны при определении и оценке целей. Например, биомолекулярные машины (БММ) представляют собой сложнейшие наноструктуры, состоящие из нескольких крупных молекул и отвечающие за основные функции в клетках организма. В зависимости от функционального состояния они имеют определенную трехмерную структуру. Примерами биомолекулярных машин являются нуклеосомы, которые позволяют ДНК, двухметровому носителю генетической информации, сворачиваться в клетках тела на пространстве всего в несколько миллионных миллиметра в диаметре. Следовательно, ДНК может служить центром информации и управления.
Используя LIMON 3D в сочетании с комплексным мечением LIMON, впервые можно сделать видимыми скрытые белки или нуклеиновые кислоты комплекса 3D-молекул так называемых биомолекулярных машин, не разрушая комплекс. До сих пор проблема в большинстве случаев заключалась в том, что для детального анализа входящих в него отдельных макромолекул приходилось разрушать комплекс. В качестве альтернативы для визуализации трехмерной структуры таких комплексов использовались виртуальные компьютерные модели или дорогостоящие методы ядерного магнитного резонанса. [15]
Литература
[ редактировать ]- ^ Рейманн, Дж; Бэддели, Д; Гункель, М; Леммер, П; Штадтер, В; Джегу, Т; Риппе, К; Кремер, К; Бирк, Ю (2008). «Высокоточный структурный анализ субъядерных комплексов в фиксированных и живых клетках с помощью микроскопии с пространственно-модулированным освещением (SMI)» . Хромосомные исследования . 16 (3): 367–82. дои : 10.1007/s10577-008-1238-2 . ПМИД 18461478 .
- ^ «Физико-астрономический факультет» .
- ^ Хайнцманн Р., Кремер К. (1999). «Микроскопия с латеральным модулированным возбуждением: улучшение разрешения за счет использования дифракционной решетки ». Учеб. ШПИОН . 3568 : 185–196. Бибкод : 1999SPIE.3568..185H . дои : 10.1117/12.336833 . S2CID 128763403 .
- ^ Патент США 7 342 717: Кристоф Кремер, Майкл Хаусманн, Иоахим Брэдл, Бернхард Шнайдер Волновой полевой микроскоп с функцией распределения точки обнаружения , дата приоритета 10 июля 1997 г.
- ^ Бест Дж, Амбергер Р, Баддели Д, Ах Т, Дитмар С, Хайнцманн Р, Кремер С (2011). «Микроскопия структурированного освещения автофлуоресцентных агрегатов в тканях человека». Микрон . 42 (4): 330–335. дои : 10.1016/j.micron.2010.06.016 . ПМИД 20926302 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Перейти обратно: а б с Леммер П., Гункель М., Баддели Д., Кауфманн Р., Урих А., Вейланд Ю., Рейманн Дж., Мюллер П., Хаусманн М., Кремер С. (2008). «SPDM: световая микроскопия с разрешением одиночной молекулы в наномасштабе» (PDF) . Прикладная физика Б. 93 (1): 1–12. Бибкод : 2008ApPhB..93....1L . дои : 10.1007/s00340-008-3152-x . S2CID 13805053 .
- ^ А. М. ван Ойен; Дж. Кёлер; Дж. Шмидт; М Мюллер; Г. Дж. Бракенхофф (31 июля 1998 г.). «Трёхмерное сверхразрешение посредством спектрально-селективной визуализации» (PDF) . Письма по химической физике . 292 (1–2): 183–187. Бибкод : 1998CPL...292..183В . дои : 10.1016/S0009-2614(98)00673-3 . hdl : 11370/0aff5aa7-7a2f-4ffb-aff8-2f6a8b425b02 .
- ^ Борнфлет; Зецлер; Эйлс; Кремер (1 февраля 1998 г.). «Высокоточные измерения расстояний и сохраняющая объем сегментация объектов вблизи и ниже предела разрешения в трехмерной конфокальной флуоресцентной микроскопии». Журнал микроскопии . 189 (2): 118–136. дои : 10.1046/j.1365-2818.1998.00276.x . S2CID 73578516 .
- ^ Брэдл Дж., Ринке Б., Эса А., Эдельманн П., Кригер Х., Шнайдер Б., Хаусманн М., Кремер К. (1996). Биджио, Ирвинг Дж; Грундфест, Уоррен С; Шнекенбургер, Герберт; Сванберг, Катарина; Виалле, Пьер М. (ред.). «Сравнительное исследование точности трехмерной локализации в традиционной конфокальной лазерной сканирующей и акситомографической флуоресцентной световой микроскопии». Учеб. ШПИОН . Оптическая биопсия и микроскопические методы. 2926 : 201–206. Бибкод : 1996SPIE.2926..201B . дои : 10.1117/12.260797 . S2CID 55468495 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Хайнцманн Р., Мюнх Х., Кремер К. (1997). «Высокоточные измерения в эпифлуоресцентной микроскопии - моделирование и эксперимент». Клеточное зрение . 4 : 252–253.
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Патент США 6,424,421: Кристоф Кремер, Михаэль Хаусманн, Иоахим Брэдл, Бернд Ринке. Метод и устройства для измерения расстояний между структурами объектов , дата приоритета 23 декабря 1996 г.
- ^ Мануэль Гункель, Фабиан Эрдель, Карстен Риппе, Пол Леммер, Райнер Кауфманн, Кристоф Хёрманн, Роман Амбергер и Кристоф Кремер (2009): Двухцветная локализационная микроскопия клеточных наноструктур . В: Биотехнологический журнал, 2009, 4, 927–938. ISSN 1860-6768
- ^ Баддели Д., Батрам С., Вейланд Ю., Кремер С., Бирк У.Дж.: Анализ наноструктур с использованием микроскопии с пространственно-модулированным освещением . В: Протоколы природы 2007; 2: 2640–2646
- ^ Кауфманн Райнер, Мюллер Патрик, Хильденбранд Георг, Хаусманн Михаэль, Кремер Кристоф (2010). «Анализ кластеров мембранных белков Her2/neu в различных типах клеток рака молочной железы с использованием локализационной микроскопии». Журнал микроскопии . 242 (1): 46–54. дои : 10.1111/j.1365-2818.2010.03436.x . ПМИД 21118230 . S2CID 2119158 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Микроскопия сверхвысокого разрешения для фармацевтической промышленности: выданы патенты на сложную 3D-маркировку. Архивировано 9 января 2012 г. на Wayback Machine.
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Суперразрешение GFP
- Список публикаций по оптической наноскопии
- пресс-релиз Гейдельбергского университета
| Освещение и контрастные методы |
|  |
|---|---|---|
| Флуоресцентные методы | ||
| субдифракция предельные методы | ||
