Оптическое секционирование

(а) Оптически срезанные флуоресцентные изображения пыльцевого зерна . (б) Комбинированное изображение. (в) Комбинированное изображение группы пыльцевых зерен.

Оптическое сечение — это процесс, с помощью которого микроскоп соответствующей конструкции может создавать четкие изображения фокальных плоскостей глубоко внутри толстого образца. Это используется для уменьшения необходимости получения тонких срезов с использованием таких инструментов, как микротом . Используется множество различных методов получения оптических срезов, а несколько методов микроскопии специально разработаны для улучшения качества оптических срезов.

Хорошее оптическое разделение, часто называемое хорошей глубиной или разрешением по z, популярно в современной микроскопии, поскольку оно позволяет трехмерную реконструкцию образца по изображениям, снятым в разных фокальных плоскостях.

Оптические срезы в традиционных световых микроскопах

См. также: Глубина резкости.

В идеальном микроскопе только свет из фокальной плоскости может достигать детектора (обычно наблюдателя или ПЗС-матрицы ), создавая четкое изображение плоскости образца, на котором фокусируется микроскоп. К сожалению, микроскоп не обладает такой специфичностью, и свет от источников за пределами фокальной плоскости также достигает детектора; может находиться значительное количество материала и, следовательно, паразитный сигнал в толстом образце между фокальной плоскостью и линзой объектива .

Без каких-либо модификаций микроскопа, то есть с помощью простого широкопольного светового микроскопа , качество оптических срезов определяется той же физикой, что и эффект глубины резкости в фотографии . Для объектива с высокой числовой апертурой , эквивалентной широкой диафрагме , глубина резкости мала ( неглубокий фокус ) и обеспечивает хорошее оптическое разрезание. с большим увеличением Объективы обычно имеют более высокую числовую апертуру (и, следовательно, лучшее оптическое сечение), чем объективы с низким увеличением. Объективы с масляной иммерсией обычно имеют еще большую числовую апертуру, что обеспечивает улучшение оптического сечения.

Разрешение в направлении глубины (« разрешение z») стандартного широкопольного микроскопа зависит от числовой апертуры и длины волны света и может быть аппроксимировано как:

$D_{z}={\frac {\lambda n}{(\mathrm {NA} )^{2}}}$ где λ — длина волны, n — показатель преломления иммерсионной среды объектива, а NA — числовая апертура.

Для сравнения, поперечное разрешение можно аппроксимировать как:

$D_{x}=D_{y}={\frac {0.61\lambda }{\mathrm {NA} }}$

Методы улучшения оптических срезов

Световая микроскопия светлого поля

Помимо увеличения числовой апертуры, существует несколько методов улучшения оптических срезов в световой микроскопии светлого поля. Большинство микроскопов с масляно-иммерсионными объективами достигают пределов числовой апертуры, возможных из-за ограничений рефракции .

Основная статья: дифференциально-интерференционный контраст

Дифференциальный интерференционный контраст (ДИК) обеспечивает небольшое улучшение оптических срезов. В DIC образец эффективно освещается двумя слегка смещенными источниками света, которые затем интерферируют, создавая изображение, возникающее в результате разности фаз двух источников. Поскольку смещение источников света невелико, единственная разница в фазе возникает из-за материала, расположенного близко к фокальной плоскости.

Флуоресцентная микроскопия

В флуоресцентной микроскопии объекты, находящиеся вне фокальной плоскости, мешают изображению только в том случае, если они освещены и флуоресцируют. Это добавляет дополнительный способ улучшения оптического сечения, делая освещение специфичным только для фокальной плоскости.

Основная статья: конфокальная микроскопия

Конфокальная микроскопия использует точку сканирования или точки света для освещения образца. В сочетании с точечным отверстием в сопряженной фокальной плоскости это позволяет фильтровать свет от источников за пределами фокальной плоскости и улучшать оптическое разделение.

Основная статья: Световая листовая флуоресцентная микроскопия

Флуоресцентная микроскопия на основе светового листа освещает образец возбуждающим светом под углом 90° к направлению наблюдения, т.е. освещается только фокальная плоскость с использованием лазера, который фокусируется только в одном направлении (световой лист). Этот метод эффективно уменьшает расфокусированный свет и может, кроме того, привести к небольшому улучшению продольного разрешения по сравнению с эпифлуоресцентной микроскопией.

Основные статьи: микроскопия двухфотонного возбуждения и многофотонный флуоресцентный микроскоп.

Методы двух- и многофотонного возбуждения используют тот факт, что флуорофоры могут возбуждаться не только одним фотоном правильной энергии , но также несколькими фотонами, которые вместе обеспечивают правильную энергию. Дополнительный « концентрационный » эффект, требующий одновременного взаимодействия нескольких фотонов с флуорофором, дает стимуляцию только очень близко к фокальной плоскости. Эти методы обычно используются в сочетании с конфокальной микроскопией.

Дальнейшие усовершенствования в области оптического секционирования находятся в стадии активной разработки, в основном они основаны на методах обхода дифракционного предела света. Примеры включают однофотонную интерферометрию через две линзы объектива, позволяющую получить чрезвычайно точную информацию о глубине одного флуорофора. и трехмерная микроскопия со структурированным освещением .

Оптические срезы обычных широкопольных микроскопов можно значительно улучшить с помощью деконволюции - метода обработки изображений, позволяющего удалить размытие изображения в соответствии с измеренной или рассчитанной функцией рассеяния точки .

Клиринговые агенты

Оптическое разделение можно улучшить за счет использования просветляющих агентов с высоким показателем преломления (>1,4), таких как бензиловый спирт/бензилбензоат (BABB) или бензиловый эфир. которые делают образцы прозрачными и, следовательно, позволяют наблюдать внутренние структуры.

Другой

В несветовых микроскопах оптические срезы развиты слабо.

Рентгеновские и электронные микроскопы обычно имеют большую глубину резкости (плохое оптическое получение срезов), поэтому получение тонких срезов образцов все еще широко используется.

Хотя схожая физика управляет процессом фокусировки, Сканирующие зондовые микроскопы и сканирующие электронные микроскопы обычно не обсуждаются в контексте получения оптических срезов, поскольку эти микроскопы взаимодействуют только с поверхностью образца.

Микроскопия полного внутреннего отражения — это метод флуоресцентной микроскопии, который намеренно ограничивает наблюдение верхней или нижней поверхностями образца, но с чрезвычайно высоким разрешением по глубине.

Теоретически и экспериментально было продемонстрировано, что 3D-изображение с использованием комбинации фокального сечения и наклона обеспечивает исключительное 3D-разрешение в больших полях зрения.

Альтернативы

Основными альтернативами оптическому сечению являются:

• Изготовление тонких срезов образца, например, используемых в гистологии .
• Томография , которая особенно хорошо развита для просвечивающей электронной микроскопии .