in vitro Токсикология
in vitro Тестирование токсичности — это научный анализ токсического воздействия химических веществ на культивируемые бактерии или млекопитающих клетки . [1] Методы тестирования in vitro (буквально «в стекле») используются в первую очередь для выявления потенциально опасных химических веществ и/или для подтверждения отсутствия определенных токсических свойств на ранних стадиях разработки потенциально полезных новых веществ, таких как терапевтические лекарства , сельскохозяйственные химикаты и пищевые добавки.
Анализы in vitro на токсичность ксенобиотиков в последнее время тщательно рассматриваются ключевыми правительственными учреждениями (например, EPA; NIEHS/NTP; FDA), чтобы лучше оценить риски для человека. Ведется значительная работа по использованию систем in vitro для углубления механистического понимания токсического действия, а также по использованию человеческих клеток и тканей для определения токсических эффектов, специфичных для человека. [2]
Улучшение по сравнению с тестированием на животных
[ редактировать ]Большинство токсикологов считают, что методы тестирования токсичности in vitro могут быть более полезными, более длительными и экономически эффективными, чем токсикологические исследования на живых животных. [3] (которые называются методами in vivo или «в жизни»). Однако экстраполяция от in vitro к in vivo требует тщательного рассмотрения и является активной областью исследований.
Из-за нормативных ограничений и этических соображений поиск альтернатив испытаниям на животных получил новый импульс. Во многих случаях тесты in vitro лучше, чем тесты на животных, поскольку их можно использовать для разработки более безопасных продуктов. [4]
Агентство по охране окружающей среды США изучило 1065 химических и лекарственных веществ в своей программе ToxCast (часть CompTox Chemicals Dashboard ), используя моделирование диоксида кремния человека и анализ на основе плюрипотентных стволовых клеток для прогнозирования интоксикантов, вызывающих развитие in vivo, на основе изменений в клеточном метаболизме после химическое воздействие. Основные результаты анализа этого набора данных ToxCast_STM, опубликованного в 2020 году, включают: (1) 19% из 1065 химических веществ позволили предсказать токсичность для развития , (2) эффективность анализа достигла точности 79–82% с высокой специфичностью (> 84%), но умеренная чувствительность (<67%) по сравнению с моделями пренатальной токсичности для развития человека in vivo на животных, (3) чувствительность улучшалась по мере того, как к исследованиям на животных применялись более строгие требования к доказательствам, и (4) статистический анализ наиболее сильнодействующих химических веществ воздействие на определенные биохимические цели в ToxCast выявило положительные и отрицательные ассоциации с реакцией STM, что дает представление о механистических основах целевой конечной точки и ее биологической области. [5]
Примеры жизнеспособности клеток и других анализов цитотоксичности, используемых для in vitro . токсикологии
[ редактировать ]Существует множество методов анализа тестируемых веществ на цитотоксичность и другие клеточные реакции.
Анализ гемолиза
[ редактировать ]Анализ гемолиза проверяет склонность химических веществ, лекарств или медикаментов , а также любого медицинского устройства или материала, контактирующих с кровью, к лизису эритроцитов (эритроцитов). Лизис легко обнаруживается благодаря высвобождению гемоглобина . [6]
МТТ и МТС
[ редактировать ]Анализ МТТ часто используется для определения жизнеспособности клеток и был одобрен для использования международными организациями. Анализ МТТ включает два этапа введения анализа в химические вещества, а затем этап солюбилизации.
Колориметрический анализ MTS (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил ) -2-(4-сульфофенил)-2Hтетразолий) in vitro представляет собой обновленную версию проверенного метода MTT, MTS. Преимущество анализа состоит в его растворимости. Следовательно, стадия солюбилизации не требуется.
СПС
[ редактировать ]анализа АТФ Основное преимущество заключается в быстром получении результатов (в течение 15 минут) и требует лишь меньшего количества клеток-образцов. Анализ осуществляет лизис клеток, и следующая химическая реакция между анализом и содержанием АТФ в клетках приводит к люминесценции. Затем количество люминесценции измеряется фотометром и может быть переведено в числовые ячейки, поскольку
- Анализ АТФ предполагает, что внутри живых клеток все еще есть АТФ, и
- Регистрируемый уровень люминесценции пропорционален содержанию АТФ в клетках образца.
Нейтральный красный
[ редактировать ]Другой конечной точкой жизнеспособности клеток может быть поглощение нейтрального красного (NR). Нейтральный красный, слабый катионный краситель, проникает через клеточные мембраны путем недиффузии и накапливается межклеточно в лизосомах. Жизнеспособные клетки поглощают краситель NR, а поврежденные или мертвые клетки — нет.
Количественное определение цитокинов с помощью ELISA
[ редактировать ]Наборы ELISA можно использовать для изучения повышения и понижения регуляции провоспалительных медиаторов, таких как цитокины (IL-1, TNF-альфа, PGE2).
Измерение этих типов клеточных ответов может быть окном во взаимодействие тестируемого образца с тестовыми моделями (монослойные клеточные культуры, 3D-модели тканей, эксплантаты тканей).
Виды in vitro исследований
[ редактировать ]Вообще говоря, существует два разных типа исследований in vitro в зависимости от системы типов, разработанной для проведения эксперимента. Обычно используются два типа систем: а) система статических луночных планшетов и б) многокамерные перфузионные системы.
Статическая система луночных планшетов
[ редактировать ]Статические луночные планшеты или системы слоев являются наиболее традиционной и простой формой анализа, широко используемой для исследований in vitro. Эти анализы весьма полезны, поскольку они довольно просты и обеспечивают очень доступную среду тестирования для мониторинга химических веществ в культуральной среде, а также в клетках. Однако недостатком использования этих простых статических луночных анализов является то, что они не могут отображать клеточные взаимодействия и условия физиологического потока жидкости, происходящие внутри организма.
Многокамерные перфузионные системы
[ редактировать ]В настоящее время разрабатываются новые платформы тестирования для решения проблем, связанных с клеточными взаимодействиями. Эти новые платформы гораздо более сложны и основаны на многокамерных перфузионных системах. [7] Основная цель этих систем — более надежно воспроизводить механизмы in vivo, обеспечивая среду культуры клеток, близкую к ситуации in vivo. Каждый отсек в системе представляет собой определенный орган живого организма и, таким образом, каждый отсек имеет определенные характеристики и критерии. Каждый отсек в этих системах соединен трубками и насосами, через которые течет жидкость, имитируя кровоток в ситуации in vivo. Недостатком использования этих перфузионных систем является то, что побочные эффекты (влияние как биологических, так и небиологических компонентов системы на судьбу изучаемого химического вещества) больше по сравнению со статическими системами. Чтобы снизить воздействие небиологических компонентов системы, все отсеки выполнены из стекла, а соединительные трубки — из тефлона. Был предложен ряд кинетических моделей, позволяющих учесть эти неспецифические связывания, происходящие в этих системах in vitro. [8]
Чтобы решить биологические трудности, возникающие при использовании различных культур в условиях in vitro, необходимо модифицировать традиционные модели, используемые в колбах или планшетах с микролунками. При параллельном развитии микротехнологий и тканевой инженерии эти проблемы решаются с использованием новых соответствующих инструментов, называемых «микрофлюидными биочипами». [9]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Гаванджи С., Бахтари А., Фамурева А.С., Отман Э.М. (январь 2023 г.). «Цитотоксическая активность растительных лекарственных средств, оцененная in vitro: обзор» . Химия и биоразнообразие . 20 (2): 3–27. дои : 10.1002/cbdv.202201098 . ПМИД 36595710 . S2CID 255473013 .
- ^ «Токс21» . Источник: Агентство по охране окружающей среды США . Проверено 29 октября 2011 г.
- ^ Махони, Кэтрин; Эштон, Рэндольф С.; Бирк, Барбара; Бубис, Алан Р.; Калл, Том; Дастон, Джордж П.; Юарт, Лорна; Кнудсен, Томас Б.; Ману, Ирен; Маурер-Штро, Себастьян; Марджотта-Касалучи, Луиджи (июль 2020 г.). «Новые идеи неживотных подходов к прогнозированию системной токсичности при повторных дозах: отчет семинара EPAA Blue Sky» . Нормативная токсикология и фармакология . 114 : 104668. doi : 10.1016/j.yrtph.2020.104668 . ПМИД 32335207 .
- ^ «Видение и дорожная карта XXI века» . Источник: Национальная программа токсикологии . Проверено 29 октября 2011 г.
- ^ Зурлинден, Ти Джей; Сайли, Канзас; Раш, Н; Котия, П; Джадсон, РС; Хоук, Калифорния; Хантер, ES; Бейкер, Северная Каролина; Палмер, Дж.А.; Томас, РС; Кнудсон, ТБ (2020). «Профилирование библиотеки ToxCast с помощью анализа биомаркеров на основе линий стволовых клеток человека (H9) на токсичность для развития» . Токсикологические науки . 174 (2): 189–209. дои : 10.1093/toxsci/kfaa014 . ПМЦ 8527599 . ПМИД 32073639 .
- ^ Сэбё П.И., Бьорос М., Франзик Х., Хельгенсен Э., Бут Дж. (2 февраля 2023 г.). «Оптимизация анализа гемолиза для оценки цитотоксичности» . Межд. Дж. Мол. Наука . 24 (3): 2914. doi : 10.3390/ijms24032914 . ПМЦ 9917735 . ПМИД 36769243 .
- ^ Леклерк Э.; Сакаи Ю.; Фуджи Т. (2004). «Перфузионная культура гепатоцитов плода человека в микрофлюидной среде». Журнал биохимической инженерии . 20 (2–3): 143–148. дои : 10.1016/j.bej.2003.09.010 .
- ^ Уаттара Д.А.; Цой С.-Х.; Сакаи Ю.; Пери АРР; Брошо К. (2011). «Кинетическое моделирование клеточных анализов in vitro для характеристики неспецифических связываний и процессов ADME в статической и перфузируемой жидкостной системе». Письма по токсикологии . 205 (3): 310–319. дои : 10.1016/j.toxlet.2011.06.021 . ПМИД 21723928 .
- ^ Бодуэн Р.; Чорлу А.; Гриском Л.; Легале К.; Леклерк Э. (2007). «Тенденции в разработке микрофлюидных клеточных биочипов для борьбы с гепатотоксичностью in vitro». Токсикология in vitro . 21 (4): 535–544. дои : 10.1016/j.tiv.2006.11.004 . ПМИД 17188836 .
