Реконструкция наследственной последовательности
Реконструкция предковой последовательности ( ASR ) – также известная как предкового гена реконструкция / воскрешение / последовательности – это метод, используемый при изучении молекулярной эволюции . Этот метод использует родственные последовательности для реконструкции «предкового» гена на основе множественного выравнивания последовательностей . [1]
Этот метод можно использовать для «воскрешения» наследственных белков, и он был предложен в 1963 году Лайнусом Полингом и Эмилем Цукеркандлом . [2] В случае с ферментами этот подход получил название палеоэнзимологии (англ. palaeoenzymology). Некоторые первые попытки были предприняты в 1980-х и 1990-х годах под руководством лаборатории Стивена А. Беннера , демонстрируя потенциал этого метода. [3] Благодаря совершенствованию алгоритмов и более совершенным методам секвенирования и синтеза, в начале 2000-х годов этот метод получил дальнейшее развитие, что позволило воскресить большее разнообразие и гораздо более древние гены. [4] За последнее десятилетие воскрешение наследственных белков развилось как стратегия выявления механизмов и динамики эволюции белков. [5]
Принципы [ править ]
В отличие от традиционных эволюционных и биохимических подходов к изучению белков, т. е. так называемого горизонтального родственных белков сравнения гомологов с разных концов древа жизни ; ASR исследует статистически предполагаемые наследственные белки в узлах дерева – вертикально ( см. диаграмму справа). Этот подход дает доступ к свойствам белков, которые могли временно возникнуть в ходе эволюции и недавно использовались как способ сделать вывод о потенциальном давлении отбора , которое привело к созданию современных последовательностей. ASR использовался для исследования причинной мутации, которая привела к неофункционализации белка после дупликации, сначала определяя, что указанная мутация была расположена между предками «5» и «4» на диаграмме (иллюстративно), с помощью функциональных анализов. [6] В области биофизики белков ASR также использовался для изучения развития термодинамических и кинетических ландшафтов белка в течение эволюционного времени, а также путей сворачивания белка путем объединения многих современных аналитических методов, таких как HX/MS . [7] Подобные идеи обычно делаются на основе нескольких предков, реконструированных на протяжении филогении (ссылаясь на предыдущую аналогию), путем изучения узлов все выше и выше (все дальше и дальше назад в эволюционном времени) на древе жизни. [8]
Большинство исследований ASR проводятся in vitro и выявили свойства наследственных белков, которые кажутся эволюционно желательными, такие как повышенная термостабильность, каталитическая активность и каталитическая распущенность. Эти данные были признаны артефактами алгоритмов ASR, а также показательными иллюстрациями окружающей среды древней Земли - часто исследования ASR должны дополняться обширными средствами контроля (обычно альтернативными экспериментами ASR) для уменьшения алгоритмических ошибок. Не все изученные белки ASR демонстрируют так называемое «наследственное превосходство». [9] Зарождающаяся область « эволюционной биохимии » получила поддержку благодаря недавнему увеличению количества исследований ASR, использующих предков в качестве способа проверки приспособленности организма в определенных клеточных контекстах – эффективно проверяя наследственные белки in vivo . [8] Из-за присущих такого рода исследованиям ограничений – в первую очередь из-за отсутствия подходящих древних геномов, в которые можно было бы вписать этих предков, небольшого репертуара хорошо классифицированных лабораторных модельных систем и неспособности имитировать древнюю клеточную среду; очень мало исследований ASR in vivo было проведено . Несмотря на вышеупомянутые препятствия, предварительные сведения об этом направлении исследований из статьи 2015 года показали, что наблюдаемое «наследственное превосходство» in vitro не было воспроизведено in vivo для данного белка. [10] ASR представляет собой один из немногих механизмов для изучения биохимии докембрийской эпохи жизни (> 541 млн лет назад ) и поэтому часто используется в « палеогенетике »; действительно, Цукеркандль и Полинг изначально предполагали, что ASR станет отправной точкой области, которую они назвали «палеобиохимией».
Методология [ править ]
Несколько родственных гомологов интересующего белка выбираются и выравниваются с помощью множественного выравнивания последовательностей (MSA), при этом строится « филогенетическое дерево » со статистически выведенными последовательностями в узлах ветвей. Именно эти последовательности являются так называемыми «предками» — процесс синтеза соответствующей ДНК, трансформации ее в клетку и производства белка — это так называемая «реконструкция». Родовые последовательности обычно рассчитываются по методу максимального правдоподобия , однако байесовские также реализуются методы. Поскольку предки выводятся из филогении, топология и состав филогении играют важную роль в выходных последовательностях ASR. Учитывая, что ведется много дискуссий и споров о том, как строить филогении - например, являются ли термофильные бактерии базальными или производными в бактериальной эволюции - во многих статьях ASR конструируется несколько филогений с различной топологией и, следовательно, с разными последовательностями ASR. Затем эти последовательности сравниваются, и часто несколько (~ 10) экспрессируются и изучаются на каждый филогенетический узел. ASR не претендует на воссоздание фактической последовательности древнего белка/ДНК, а скорее на последовательность, которая, вероятно, будет похожа на ту, которая действительно находилась в узле. Это не считается недостатком ASR, поскольку оно вписывается в нейтральная сетевая модель эволюции белков, согласно которой в эволюционных узлах (узлах) в существующей популяции организмов существовала популяция генотипически различных, но фенотипически сходных белковых последовательностей. Следовательно, возможно, что ASR будет генерировать одну из последовательностей нейтральной сети узла, и хотя она может не представлять генотип последнего общего предка современных последовательностей, она, вероятно, представляет фенотип. [8] Это подтверждается современными наблюдениями о том, что многие мутации в некаталитическом/функциональном участке белка вызывают незначительные изменения в биофизических свойствах. Следовательно, ASR позволяет исследовать биофизические свойства белков прошлого и свидетельствует о древней генетике.
Методы максимального правдоподобия (ML) работают путем создания последовательности, в которой остаток в каждой позиции, по прогнозам, с наибольшей вероятностью займет указанную позицию с помощью используемого метода вывода - обычно это оценочная матрица (аналогичная тем, которые используются в BLAST или MSA). ) рассчитано на основе существующих последовательностей. Альтернативные методы включают максимальную экономию (MP), которая создает последовательность на основе модели эволюции последовательности - обычно идея о том, что минимальное количество изменений нуклеотидной последовательности представляет собой наиболее эффективный путь эволюции и по бритве Оккама, является наиболее вероятной. МП часто считают наименее надежным методом реконструкции, поскольку он, возможно, слишком упрощает эволюцию до степени, неприменимой в масштабе миллиарда лет.
Другой метод предполагает учет неопределенности остатков – так называемые байесовские методы – эта форма ASR иногда используется в дополнение к методам ML, но обычно дает более неоднозначные последовательности. В ASR термин «неоднозначность» относится к положениям остатков, в которых нельзя предсказать четкую замену - часто в этих случаях создается несколько последовательностей ASR, охватывающих большую часть неоднозначностей и сравниваемых друг с другом. ML ASR часто требует дополнительных экспериментов, чтобы показать, что полученные последовательности представляют собой нечто большее, чем просто консенсус входных последовательностей. Это особенно необходимо при соблюдении «Наследственного превосходства». [7] Одно из объяснений тенденции повышения термостабильности состоит в том, что ML ASR создает согласованную последовательность нескольких различных параллельных механизмов, развившихся для придания второстепенной термостабильности белкам на протяжении всей филогении, что приводит к аддитивному эффекту, приводящему к «превосходной» наследственной термостабильности. [11]
Выражение консенсусных последовательностей и параллельного ASR с помощью методов, не связанных с ML, часто требуется для развенчания этой теории в каждом эксперименте. Еще одна проблема, возникающая при использовании методов МО, заключается в том, что оценочные матрицы получены на основе современных последовательностей, а частоты определенных аминокислот, наблюдаемые сегодня, могут не совпадать с частотами в докембрийской биологии, что приводит к искаженному выводу о последовательностях. В нескольких исследованиях были предприняты попытки построить древние оценочные матрицы с помощью различных методологий и сравнить полученные последовательности и биофизические свойства их белков. Хотя эти модифицированные последовательности приводят к несколько иным последовательностям ASR, наблюдаемые биофизические свойства, по-видимому, не отличаются от экспериментальной ошибки. [12] Из-за «целостного» характера ASR и огромной сложности, возникающей при рассмотрении всех возможных источников экспериментальной ошибки, экспериментальное сообщество считает, что окончательным измерением надежности ASR является сравнение нескольких альтернативных реконструкций ASR одного и того же узла и выявление сходных биофизических свойств. Хотя этот метод не предлагает надежной статистической и математической меры надежности, он основан на фундаментальной идее, используемой в ASR, о том, что отдельные аминокислотные замены не вызывают значительных изменений биофизических свойств белка – арендатор, который должен соблюдаться, чтобы уметь преодолеть эффект неоднозначности вывода. [13]
Кандидаты, используемые для ASR, часто выбираются на основе конкретного изучаемого свойства, например, термостабильности. [9] Выбирая последовательности с любого конца диапазона свойств (например, психрофильные белки и термофильные белки), но внутри семейства белков, ASR можно использовать для исследования конкретных изменений последовательностей, которые привели к наблюдаемому биофизическому эффекту, например, к стабилизирующим взаимодействиям. Рассмотрим на диаграмме: если последовательность «А» кодирует белок, который оптимально функционален при нейтральных значениях pH, а «D» — в кислых условиях, то изменения последовательности между «5» и «2» могут проиллюстрировать точное биофизическое объяснение этой разницы. Поскольку эксперименты ASR могут извлечь предков, возраст которых, вероятно, составляет миллиарды лет, часто происходят десятки, если не сотни изменений последовательности между самими предками, предками и существующими последовательностями – из-за этого такие эволюционные исследования последовательностей и функций могут потребовать много работы и рациональное направление. [1] [6] [14]
Воскресшие белки [ править ]
Существует множество примеров предковых белков, которые были реконструированы с помощью вычислений, экспрессированы в линиях живых клеток и – во многих случаях – очищены и биохимически изучены.
- Лаборатория Торнтона, в частности, возродила несколько наследственных рецепторов гормонов (примерно 500 млн лет назад). [4] [15] [16] и сотрудничал с лабораторией Стивенса, чтобы воскресить древние V-АТФазы. субъединицы [17] из дрожжей (800Ма).
- Лаборатория Marqusee недавно опубликовала несколько исследований, касающихся эволюционной биофизической истории E. coli рибонуклеазы H1 . [9] [18]
Другими примерами являются предковые зрительные пигменты у позвоночных. [19] ферменты дрожжей, расщепляющие сахара (800 Ма); [20] ферменты бактерий , обеспечивающие устойчивость к антибиотикам (2–3 Ga ); [21] рибонуклеазы, участвующие в пищеварении жвачных животных; алкогольдегидрогеназы ферментации (Adhs), участвующие в дрожжевой ( ~85 млн лет); [13] и RuBisCO в пасленовых . [22]
«Возраст» реконструированной последовательности определяется с использованием модели молекулярных часов , и часто используются несколько моделей. [7] [23] Этот метод датирования часто калибруется с использованием геологических моментов времени (таких как компоненты древнего океана или BIF ), и хотя эти часы предлагают единственный метод определения возраста очень древнего белка, они имеют широкий диапазон погрешностей, и их трудно защитить от противоположных данных. С этой целью «возраст» ASR на самом деле следует использовать только как ориентировочный признак, а часто его вообще игнорируют для измерения количества замен между предковыми и современными последовательностями (основа, на которой рассчитываются часы). [9] При этом использование часов позволяет сравнивать наблюдаемые биофизические данные белка ASR с геологической или экологической средой в данный момент. Например, исследования ASR бактериальных EF-Tus (белков, участвующих в трансляции , которые, вероятно, редко подвергаются HGT и обычно имеют Tms ~ 2C выше, чем Tenv) указывают на более жаркую докембрийскую Землю, что очень близко соответствует геологическим данным о температурах древнего земного океана. на основе кислорода-18 . изотопного уровня [12] Исследования ASR дрожжевых Adh показывают, что появление субфункционализированных Adh для метаболизма этанола (а не только для выведения отходов) возникло в то же время, что и появление мясистых фруктов в кембрийском периоде, и что до этого появления Adh служил для выделения этанола в качестве побочного продукта. избытка пирувата . [13] Использование часов также, возможно, указывает на то, что зарождение жизни произошло до того, как указывают самые ранние молекулярные окаменелости (> 4,1 млрд лет), но, учитывая спорную надежность молекулярных часов, к таким наблюдениям следует относиться с осторожностью. [23] [24]
Тиоредоксин [ править ]
Одним из примеров является реконструкция ферментов тиоредоксина в организмах возрастом до 4 миллиардов лет. [25] Хотя химическая активность этих реконструированных ферментов была очень похожа на активность современных ферментов, их физические свойства показали значительно повышенную термическую и кислотную стабильность. Эти результаты были интерпретированы как предположение о том, что древняя жизнь могла развиваться в океанах, которые были намного более горячими и кислыми, чем сегодня. [25]
Значение [ править ]
Эти эксперименты решают различные важные вопросы эволюционной биологии: происходит ли эволюция маленькими шагами или большими скачками; обратима ли эволюция; как развивается сложность ? Показано, что небольшие мутации в аминокислотной последовательности рецепторов гормонов определяют важное изменение их предпочтений к гормонам. Эти изменения означают огромные шаги в эволюции эндокринной системы . Таким образом, очень небольшие изменения на молекулярном уровне могут иметь огромные последствия. Лаборатория Торнтона также смогла доказать, что эволюция необратима, изучая глюкокортикоидный рецептор . Этот рецептор был изменен в результате семи мутаций рецептора кортизола, но обращение этих мутаций не вернуло исходный рецептор. Это указывает на то, что эпистаз играет важную роль в эволюции белков – наблюдение, которое в сочетании с наблюдениями за несколькими примерами параллельной эволюции подтверждает упомянутую выше модель нейтральной сети. [8] Другие более ранние нейтральные мутации действовали как храповик и делали изменения в рецепторе необратимыми. [26] Эти различные эксперименты с рецепторами показывают, что в процессе эволюции белки сильно дифференцируются, и это объясняет, как может развиваться сложность. Более пристальный взгляд на различные наследственные рецепторы гормонов и на различные гормоны показывает, что на уровне взаимодействия между отдельными аминокислотными остатками и химическими группами гормонов возникают очень небольшие, но специфические изменения. Знание об этих изменениях может, например, привести к синтезу гормональных эквивалентов, способных имитировать или ингибировать действие гормона, что может открыть возможности для новых методов лечения.
Учитывая, что ASR выявил тенденцию к древней термостабильности и ферментативной распущенности, ASR представляет собой ценный инструмент для инженеров белков , которым часто нужны эти черты (производящие эффекты, иногда превосходящие нынешние, рационально используемые инструменты). [11] ASR также обещает «воскресить» фенотипически подобные «древние организмы», что, в свою очередь, позволит эволюционным биохимикам исследовать историю жизни. Сторонники ASR, такие как Беннер, заявляют, что благодаря этим и другим экспериментам к концу текущего столетия в биологии будет достигнут уровень понимания, аналогичный тому, который возник в классической химии в прошлом веке. [13]
Ссылки [ править ]
- ^ Перейти обратно: а б Торнтон Дж.В. (май 2004 г.). «Воскресение древних генов: экспериментальный анализ вымерших молекул». Обзоры природы. Генетика . 5 (5): 366–375. дои : 10.1038/nrg1324 . ПМИД 15143319 . S2CID 205482979 .
- ^ Полинг Л., Цукеркандл Э (1963). «Химическая палеогенетика: исследования молекулярного восстановления вымерших форм жизни» . Acta Chemica Scandinavica . 17 : С9–С16. ]
- ^ Джерманн Т.М., Опиц Дж.Г., Стэкхаус Дж., Беннер С.А. (март 1995 г.). «Реконструкция эволюционной истории суперсемейства парнокопытных рибонуклеаз». Природа . 374 (6517): 57–59. Бибкод : 1995Natur.374...57J . дои : 10.1038/374057a0 . ПМИД 7532788 . S2CID 4315312 .
- ^ Перейти обратно: а б Торнтон Дж.В., Need E, Crews D (сентябрь 2003 г.). «Возрождение предкового стероидного рецептора: древнее происхождение передачи сигналов эстрогена». Наука . 301 (5640): 1714–1717. Бибкод : 2003Sci...301.1714T . дои : 10.1126/science.1086185 . ПМИД 14500980 . S2CID 37628350 .
- ^ Пирсон Х (март 2012 г.). «Доисторические белки: воскрешение мертвых» . Природа . 483 (7390). Лондон: 390–3. дои : 10.1038/483390a . ПМИД 22437590 .
- ^ Перейти обратно: а б Андерсон Д.П., Уитни Д.С., Хансон-Смит В., Возница А., Камподонико-Бернетт В., Волкман Б.Ф. и др. (январь 2016 г.). «Эволюция древней функции белка, участвующей в организованной многоклеточности у животных» . электронная жизнь . 5 : е10147. дои : 10.7554/eLife.10147 . ПМЦ 4718807 . ПМИД 26740169 .
- ^ Перейти обратно: а б с Уиллер Л.К., Лим С.А., Маркузи С., Хармс М.Дж. (июнь 2016 г.). «Термостабильность и специфичность древних белков» . Современное мнение в области структурной биологии . 38 : 37–43. дои : 10.1016/j.sbi.2016.05.015 . ПМК 5010474 . ПМИД 27288744 .
- ^ Перейти обратно: а б с д Хармс М.Дж., Торнтон Дж.В. (август 2013 г.). «Эволюционная биохимия: выявление исторических и физических причин свойств белков» . Обзоры природы. Генетика . 14 (8): 559–571. дои : 10.1038/nrg3540 . ПМЦ 4418793 . ПМИД 23864121 .
- ^ Перейти обратно: а б с д Лим С.А., Харт К.М., Хармс М.Дж., Маркизи С. (ноябрь 2016 г.). «Эволюционная тенденция к кинетической стабильности траектории сворачивания РНКаз H» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 113 (46): 13045–13050. дои : 10.1073/pnas.1611781113 . ПМЦ 5135364 . ПМИД 27799545 .
- ^ Хоббс Дж.К., Прентис Э.Дж., Груссен М., Аркус В.Л. (октябрь 2015 г.). «Реконструированные предковые ферменты снижают пригодность современных бактерий, несмотря на их благоприятные биохимические свойства». Журнал молекулярной эволюции . 81 (3–4): 110–120. Бибкод : 2015JMolE..81..110H . дои : 10.1007/s00239-015-9697-5 . hdl : 1721.1/105120 . ПМИД 26349578 . S2CID 18833850 .
- ^ Перейти обратно: а б Риссо В.А., Гавира Х.А., Санчес-Руис Х.М. (июнь 2014 г.). «Термостабильные и беспорядочные докембрийские белки». Экологическая микробиология . 16 (6): 1485–1489. дои : 10.1111/1462-2920.12319 . hdl : 10481/87187 . ПМИД 25009840 .
- ^ Перейти обратно: а б Гошер Э.А., Говиндараджан С., Ганеш ОК (февраль 2008 г.). «Тенденция палеотемпературы докембрийской жизни, выведенная на основе воскресших белков». Природа . 451 (7179): 704–707. Бибкод : 2008Natur.451..704G . дои : 10.1038/nature06510 . ПМИД 18256669 . S2CID 4311053 .
- ^ Перейти обратно: а б с д Либерлес Д.А., изд. (26 июля 2007 г.). Реконструкция наследственной последовательности . Оксфорд, Нью-Йорк: Издательство Оксфордского университета. ISBN 978-0-19-929918-8 .
- ^ Рисунок 1 из ссылки Хармс М.Дж., Торнтон Дж.В. (август 2013 г.). «Эволюционная биохимия: выявление исторических и физических причин свойств белков» . Обзоры природы. Генетика . 14 (8): 559–571. дои : 10.1038/nrg3540 . ПМЦ 4418793 . ПМИД 23864121 .
- ^ Эйк Г.Н., Колуччи Дж.К., Хармс М.Дж., Ортлунд Э.А., Торнтон Дж.В. (2012). «Эволюция минимальной специфичности и беспорядочных связей в рецепторах стероидных гормонов» . ПЛОС Генетика . 8 (11): e1003072. дои : 10.1371/journal.pgen.1003072 . ПМЦ 3499368 . ПМИД 23166518 .
- ^ Хармс М.Дж., Эйк Г.Н., Госвами Д., Колуччи Дж.К., Гриффин П.Р., Ортлунд Э.А., Торнтон Дж.В. (июль 2013 г.). «Биофизические механизмы мутаций с большим эффектом в эволюции рецепторов стероидных гормонов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 110 (28): 11475–80. дои : 10.1073/pnas.1303930110 . ПМЦ 3710831 . ПМИД 23798447 .
- ^ Финниган Г.К., Хэнсон-Смит В., Стивенс Т.Х., Торнтон Дж.В. (январь 2012 г.). «Эволюция повышенной сложности в молекулярной машине» . Природа . 481 (7381): 360–364. Бибкод : 2012Natur.481..360F . дои : 10.1038/nature10724 . ПМЦ 3979732 . ПМИД 22230956 .
- ^ Харт К.М., Хармс М.Дж., Шмидт Б.Х., Эля С., Торнтон Дж.В., Маркузи С. (ноябрь 2014 г.). «Дрейф термодинамической системы в эволюции белков» . ПЛОС Биология . 12 (11): e1001994. дои : 10.1371/journal.pbio.1001994 . ПМК 4227636 . ПМИД 25386647 .
- ^ Ши Ю, Ёкояма С (июль 2003 г.). «Молекулярный анализ эволюционного значения ультрафиолетового зрения у позвоночных» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 100 (14): 8308–8313. Бибкод : 2003PNAS..100.8308S . дои : 10.1073/pnas.1532535100 . ПМК 166225 . ПМИД 12824471 .
- ^ Вурдекерс К., Браун К.А., Ваннесте К., ван дер Занде Э., Воет А., Маере С., Верстрепен К.Дж. (2012). «Реконструкция наследственных метаболических ферментов раскрывает молекулярные механизмы, лежащие в основе эволюционных инноваций посредством дупликации генов» . ПЛОС Биология . 10 (12): e1001446. дои : 10.1371/journal.pbio.1001446 . ПМК 3519909 . ПМИД 23239941 .
- ^ Риссо В.А., Гавира Х.А., Мехия-Кармона Д.Ф., Гоше Э.А., Санчес-Руис Х.М. (февраль 2013 г.). «Гиперстабильность и беспорядочность субстратов при лабораторном воскрешении докембрийских β-лактамаз». Журнал Американского химического общества . 135 (8): 2899–2902. дои : 10.1021/ja311630a . hdl : 11336/22624 . ПМИД 23394108 . S2CID 207092445 .
- ^ Лин, Мят Т.; Салихович, Хайди; Кларк, Фрэнсис К.; Хэнсон, Морин Р. (15 апреля 2022 г.). «Повышение эффективности Rubisco за счет воскрешения его предков из семейства пасленовых» . Достижения науки . 8 (15): eabm6871. doi : 10.1126/sciadv.abm6871 . ПМК 9012466 . ПМИД 35427154 .
- ^ Перейти обратно: а б Баттистуцци Ф.У., Фейджао А., Хеджес С.Б. (ноябрь 2004 г.). «Геномная временная шкала эволюции прокариот: понимание происхождения метаногенеза, фототрофии и колонизации суши» . Эволюционная биология BMC . 4:44 . дои : 10.1186/1471-2148-4-44 . ПМЦ 533871 . ПМИД 15535883 .
- ^ Белл Э.А. , Бёнке П., Харрисон Т.М., Мао В.Л. (ноябрь 2015 г.). «Потенциально биогенный углерод сохранился в цирконе возрастом 4,1 миллиарда лет» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 112 (47): 14518–14521. Бибкод : 2015PNAS..11214518B . дои : 10.1073/pnas.1517557112 . ПМЦ 4664351 . ПМИД 26483481 .
- ^ Перейти обратно: а б Перес-Хименес Р., Инглес-Прието А., Чжао З.М., Санчес-Ромеро И., Алегре-Себоллада Х., Косури П. и др. (май 2011 г.). «Одномолекулярная палеоэнзимология исследует химию возрожденных ферментов» . Структурная и молекулярная биология природы . 18 (5): 592–596. дои : 10.1038/nsmb.2020 . ПМК 3087858 . ПМИД 21460845 .
- ^ Бриджэм Дж.Т., Ортлунд Э.А., Торнтон Дж.В. (сентябрь 2009 г.). «Эпистатический храповик ограничивает направление эволюции глюкокортикоидных рецепторов» . Природа . 461 (7263): 515–519. Бибкод : 2009Natur.461..515B . дои : 10.1038/nature08249 . ПМК 6141187 . ПМИД 19779450 .