Дайджест ограничений

Рестрикционный дайджест — это процедура, используемая в молекулярной биологии для подготовки ДНК к анализу или другой обработке. Иногда это называют фрагментацией ДНК , хотя этот термин используется и для других процедур. При рестрикционном расщеплении молекулы ДНК расщепляются по специфическим сайтам рестрикции длиной 4-12 нуклеотидов с помощью ферментов рестрикции, которые распознают эти последовательности.

Полученную переваренную ДНК очень часто избирательно амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), что делает ее более подходящей для аналитических методов, таких как электрофорез в агарозном геле и хроматография . Он используется в генетическом фингерпринтинге плазмид , субклонировании и RFLP-анализе .

Сайт ограничения

Определенный фермент рестрикции разрезает сегменты ДНК внутри определенной нуклеотидной последовательности в так называемом сайте рестрикции . Эти последовательности распознавания обычно имеют длину в четыре, шесть, восемь, десять или двенадцать нуклеотидов и обычно являются палиндромными (т.е. одна и та же нуклеотидная последовательность в направлении 5'-3'). Поскольку существует ограниченное количество способов расположить четыре нуклеотида, составляющие ДНК (аденин, тимин, гуанин и цитозин), в последовательность из четырех-двенадцати нуклеотидов, в любой длинной последовательности последовательности распознавания имеют тенденцию возникать случайно. Ферменты рестрикции, специфичные для сотен различных последовательностей, были идентифицированы и синтезированы для продажи в лаборатории, и в результате несколько потенциальных «сайтов рестрикции» появляются практически в любом интересующем гене или локусе на любой хромосоме. Более того, почти все искусственные плазмиды включают в себя (часто полностью синтетический) полилинкер (также называемый «сайтом множественного клонирования»), который содержит десятки последовательностей распознавания ферментов рестрикции в очень коротком сегменте ДНК. Это позволяет встроить практически любой конкретный фрагмент ДНК в плазмиду. векторы , которые можно эффективно «клонировать» путем встраивания в реплицирующиеся бактериальные клетки.

После рестрикционного расщепления ДНК можно проанализировать с помощью электрофореза в агарозном геле . При гель-электрофорезе образец ДНК сначала «загружается» на пластинку агарозного геля (буквально вносится пипеткой в ​​небольшие лунки на одном конце пластины). Затем гель подвергается воздействию электрического поля, которое притягивает к нему отрицательно заряженную ДНК. Молекулы движутся с разной скоростью (и, следовательно, оказываются на разных расстояниях) в зависимости от их суммарного заряда (более сильно заряженные частицы перемещаются дальше) и размера (более мелкие частицы перемещаются дальше). Поскольку ни одно из четырех нуклеотидных оснований не несет заряда, суммарный заряд становится незначительным, а размер является основным фактором, влияющим на скорость диффузии через гель. Чистый заряд ДНК создается сахарно-фосфатным остовом . В этом отличие от белков, в которых нет «основы», а суммарный заряд генерируется различными комбинациями и количеством заряженных аминокислот .

Возможное использование

Рестрикционный гидролизат чаще всего используется как часть процесса молекулярного клонирования фрагмента ДНК в вектор (такой как вектор клонирования или вектор экспрессии ). Вектор обычно содержит множественный сайт клонирования , где может быть обнаружено множество сайтов рестрикции, и чужеродный фрагмент ДНК может быть вставлен в вектор путем сначала разрезания сайтов рестрикции в векторе, а также фрагмента ДНК, с последующим лигированием фрагмента ДНК . в вектор.

Рестрикционные дайджесты также необходимы для выполнения любого из следующих аналитических методов:

• RFLP - Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
• AFLP - усиленный полиморфизм длины фрагмента
• STRP – Полиморфизм коротких тандемных повторов

Различные ферменты рестрикции

Существует множество типов рестриктаз, каждый из которых разрезает ДНК по-разному. Наиболее часто используемыми ферментами рестрикции являются эндонуклеазы рестрикции типа II ( см. в статье «Ферменты рестрикции примеры »). Некоторые из них разрезают последовательность из трех пар оснований, в то время как другие могут разрезать четыре, шесть и даже восемь пар оснований. Каждый фермент имеет особые свойства, которые определяют, насколько эффективно он может разрезать и при каких условиях. Большинство производителей, производящих такие ферменты, часто предоставляют специальный буферный раствор, содержащий уникальную смесь катионов и других компонентов, которые помогают ферменту расщеплять максимально эффективно. Различные ферменты рестрикции также могут иметь разные оптимальные температуры, при которых они функционируют.

Обратите внимание, что для эффективного расщепления ДНК сайт рестрикции не должен располагаться в самом конце фрагмента ДНК. Для эффективной работы ферментов рестрикции может потребоваться минимальное количество пар оснований между сайтом рестрикции и концом ДНК. Это число может варьироваться в зависимости от фермента, но для наиболее часто используемых ферментов рестрикции достаточно около 6–10 пар оснований.

См. также

• Электрофорез в агарозном геле
• секвенирование ДНК
• Генетическая дактилоскопия
• ПЦР
• Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

Внешние ссылки

• Биолаборатории Новой Англии – производитель ферментов рестрикции. Этот сайт содержит очень подробную информацию о многочисленных ферментах, их оптимальных температурах и последовательностях распознавания.
• ЛИСЫ