Jump to content

Лизат амебоцитов Limulus

Атлантический мечехвостик Limulus polyphemus

Лизат амебоцитов Limulus ( LAL ) представляет собой водный экстракт подвижных клеток крови ( амебоцитов ) атлантического мечехвоста Limulus polyphemus . ЛАЛ реагирует с бактериальными эндотоксинами, такими как липополисахариды (ЛПС), которые являются компонентами бактериальной капсулы , внешней мембраны клеточной оболочки грамотрицательных бактерий . Эта реакция лежит в основе LAL-теста , который широко используется для обнаружения и количественного определения бактериальных эндотоксинов .

аналогичный тест на лизат амебоцитов Tachypleus ( TAL ), основанный на местных мечехвостах Tachypleus gigas или Tachypleus tridentatus . В Азии вместо этого иногда используется [ 1 ] Анализ рекомбинантного фактора C (rFC) представляет собой замену LAL и TAL, основанную на аналогичной реакции. [ 2 ]

Американский медицинский исследователь Фред Банг сообщил в 1956 году, что грамотрицательные бактерии, даже если они убиты, заставят кровь мечехвоста превратиться в гель , разновидность полутвердой массы. Позже было признано, что клетки крови животных, подвижные клетки, называемые амебоцитами , содержат гранулы с фактором свертывания крови , известным как коагулоген ; он высвобождается за пределы клетки при контакте с бактериальными эндотоксинами. Считается, что после коагуляции и последующего гелеобразования полученный гель содержит бактериальные инфекции в полузакрытой системе кровообращения животного . [ 3 ] Современный анализ лизата привел к пониманию этой каскадной системы, в которой несколько ферментов последовательно работают над образованием геля. Точкой входа в процесс свертывания крови, индуцированного эндотоксином, является фактор свертывания крови Limulus C. [ 4 ]

В 1977 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило LAL для тестирования лекарств, продуктов и устройств, вступающих в контакт с кровью. До этой даты гораздо более медленный и более дорогой тест на кроликах . для этой цели использовался [ 5 ]

мечехвоста Мечехвоста собирают и удаляют кровь из перикарда ; некоторых крабов затем возвращают в воду, а других продают, чтобы съесть или использовать в качестве приманки. Компании, добывающие LAL из мечехвостов, до 2008 года заявляли, что уровень смертности был ниже 3%. [ 6 ] Исследование, проведенное Массачусетским отделом морского рыболовства в 2009 году, показало, что более ранние исследования показали, что смертность самцов составляет от 5 до 15%, а среди самок - 29%. Само исследование показало, что 22% самок немедленно возвращаются в воду, а 30% самок оставляются на ночь в целях коммерческой практики. [ 7 ] Клетки крови отделяются от сыворотки с помощью центрифугирования , а затем помещаются в дистиллированную воду, в результате чего они набухают и лопаются («лизируются»). При этом химические вещества высвобождаются изнутри клетки («лизат»), которые затем очищаются и подвергаются сублимационной сушке . Чтобы проверить образец на эндотоксины, его смешивают с лизатом и водой; эндотоксины присутствуют, если происходит коагуляция. [ 8 ]

ЛАЛ-тест

[ редактировать ]

Существует три основных методологии: гель-сгусток , турбидиметрический и хромогенный . Основным применением LAL является тестирование парентеральных фармацевтических препаратов и медицинских устройств, контактирующих с кровью или спинномозговой жидкостью . В США FDA опубликовало руководство по валидации теста LAL в качестве теста на эндотоксин для таких продуктов. [ 9 ]

LAL Каскад также запускается (1,3)-β-D-глюканом через другой фактор G. И бактериальные эндотоксины, и (1,3)-β-D-глюкан считаются патоген-ассоциированными молекулярными паттернами , или PAMP. , вещества, вызывающие воспалительные реакции у млекопитающих . [ 10 ]

Преодоление торможения и улучшения

[ редактировать ]

Одним из наиболее трудоемких аспектов тестирования эндотоксинов с использованием LAL является предварительная обработка образцов для преодоления ингибирования анализа, которое может помешать тесту LAL, что повлияет на выделение эндотоксина. Если тестируемый продукт вызывает меньшее, чем ожидалось, выделение эндотоксина, продукт ингибирует тест LAL. Продукты, которые дают более высокие, чем ожидалось, значения, улучшаются. Преодоление ингибирующих и улучшающих свойств продукта требуется FDA в рамках валидации теста LAL для использования при окончательном тестировании выпуска инъекционных препаратов и медицинских устройств. Прежде чем можно будет использовать LAL для высвобождения продукта, необходимо доказать правильность извлечения эндотоксина. [ 11 ]

Альтернативы

[ редактировать ]

Анализ рекомбинантного фактора C

[ редактировать ]

LAL-тест является основным источником зависимости от продуктов животного происхождения в биомедицинской промышленности и бросает вызов трем принципам науки в отношении использования животных в тестировании. С сообщениями о более высоком, чем ожидалось, уровне смертности [ 7 ] было сочтено более этичным разработать альтернативы тесту. [ 12 ] С 2003 года рекомбинантного коммерчески доступен заменитель белка для использования в тесте LAL. Названный анализом рекомбинантного фактора C (rFC), он основан на том же белке фактора свертывания крови C Limulus , но производится генетически модифицированными клетками насекомых (используемая конкретная последовательность фактора C не обязательно происходит от атлантического мечехвоста). [ 5 ]

Вместо имитации всего пути свертывания крови тесты RFC позволяют фактору C расщеплять синтетический флюорогенный субстрат, так что образец светится, когда эндотоксин активирует фактор. Поскольку (1,3)-β-D-глюкан не содержит фактора G, он не вызывает ложноположительных результатов . По состоянию на 2018 год имеющиеся данные показывают, что тест RFC не хуже теста LAL. [ 13 ]

Внедрение теста RFC шло медленно, и ситуация начала меняться в 2012 году, когда FDA США и министерство здравоохранения Европы признали его приемлемой альтернативой. Отсутствие упоминания о нем в фармакопеях оставалось проблемой, поскольку не существовало хорошего стандарта для проведения теста в производстве. [ 13 ] В 2016 году он был добавлен в Европейскую Фармакопею . [ 5 ] Патент на RFC также ограничил распространение до истечения срока его действия в 2018 году. [ 13 ]

1 июня 2020 года Фармакопея США (USP) решила отменить предложение о включении рекомбинантной технологии для тестирования эндотоксинов в главу 85 «Бактериальные эндотоксины» и начать разработку отдельной главы, в которой подробно рассматриваются использование, валидация и сопоставимость тесты на эндотоксины на основе рекомбинантных реагентов. Отдельная глава 1085.1, предназначенная только для рекомендаций, была предложена USP, хотя комментарии и отзывы, опубликованные 11 декабря 2020 года, показывают, что фармацевтические компании и FDA не поддерживают эту главу и запрашивают статус справочника. [ 14 ]

Тест активации моноцитов

[ редактировать ]

Тест активации моноцитов (MAT) — еще один предложенный метод проверки эндотоксинов на основе моноцитов в крови человека . Он измеряет высвобождение цитокинов из них из-за присутствия пирогенов , что по существу отражает процесс, посредством которого эти токсины вызывают лихорадку у людей (и кроликов, как в оригинальном тесте на пирогенность). [ 15 ] Протокол теста MAT с использованием культивируемых клеток описан в Европейской Фармакопее. [ 16 ]

Недавнее исследование с использованием генетически модифицированных моноцитов позволило значительно повысить чувствительность методов обнаружения на основе моноцитов за счет сокращения времени завершения анализа с более чем 20 часов до 2–3 часов. [ 17 ]

См. также

[ редактировать ]
  1. ^ Шэн Дж., Чжоу Дж., Пэн Ю., Чжу З., Чен Л. (1 января 2006 г.). «Использование лизата лизата тахиплеусных амебоцитов в реакции переливания» . Китайский журнал нозокомиологии (на китайском языке).
  2. ^ «Производители и сохранение эндотоксинов» . www.horseshoecrab.org . Проверено 10 марта 2020 г.
  3. ^ Грир С. «Фредерик Банг» . Школа общественного здравоохранения Дж. Х. Блумберга . Школа общественного здравоохранения Блумберга Джонса Хопкинса.
  4. ^ Иванага С. (май 2007 г.). «Биохимический принцип теста Лимулуса для выявления бактериальных эндотоксинов» . Труды Японской академии. Серия Б, Физические и биологические науки . 83 (4): 110–9. Бибкод : 2007PJAB...83..110I . дои : 10.2183/pjab.83.110 . ПМЦ   3756735 . ПМИД   24019589 .
  5. ^ Jump up to: а б с Чжан С. (9 мая 2018 г.). «Последние дни жатвы голубой крови» . Атлантика . Проверено 15 мая 2018 г.
  6. ^ «Авария: Повесть о двух видах — преимущества голубой крови» . ПБС. 10 июня 2008 г.
  7. ^ Jump up to: а б Лешен А.С., Коррейя С.Дж. (март 2010 г.). «Смертность самок мечехвоста (Limulus polyphemus) от биомедицинского кровотечения и обращения: последствия для управления рыболовством» (PDF) . Морское и пресноводное поведение и физиология . 43 (2): 135–47. дои : 10.1080/10236241003786873 . S2CID   35152647 . Архивировано из оригинала (PDF) 14 июня 2010 года.
  8. ^ «История лимулюса и эндотоксина» . Морская биологическая лаборатория . Архивировано из оригинала 28 октября 2008 года.
  9. ^ «Руководство для промышленности: Тестирование на пирогены и эндотоксины: вопросы и ответы» . Управление по контролю за продуктами и лекарствами США . Проверено 5 марта 2019 г.
  10. ^ Сэндл Т. (август 2013 г.). «Примеси фармацевтических продуктов: учитывая бета-глюканы» . Американский фармацевтический обзор . 16 (5 Дополнение S1): 16–19.
  11. ^ Уильямс К.Л., изд. (2007). Эндотоксины пирогены, LAL-тестирование и депирогенизация (3-е изд.). Нью-Йорк: Информа Здравоохранение. п. 342. ИСБН  978-1420020595 . Проверено 7 марта 2015 г. Прежде чем LAL можно будет использовать для высвобождения продукта, необходимо доказать правильность извлечения эндотоксина.
  12. ^ Горман, Ричард (2020). «Атлантические мечехвосты и тестирование эндотоксинов: перспективы альтернатив, устойчивых методов и 3R (замена, сокращение и уточнение)» . Границы морской науки . 7 . дои : 10.3389/fmars.2020.582132 . ISSN   2296-7745 . ПМЦ   7612741 . ПМИД   35591980 .
  13. ^ Jump up to: а б с Мэлони Т., Фелан Р., Симмонс Н. (октябрь 2018 г.). «Спасение мечехвоста: синтетическая альтернатива крови мечехвоста для обнаружения эндотоксинов» . ПЛОС Биология . 16 (10): e2006607. doi : 10.1371/journal.pbio.2006607 . ПМК   6200278 . ПМИД   30312293 .
  14. ^ https://www.uspnf.com/sites/default/files/usp_pdf/EN/USPNF/usp-nf-notices/1085-1-pf-comments-20201211.pdf [ только URL-адрес PDF ]
  15. ^ «Альтернативные методы тестирования эндотоксинов» . www.horseshoecrab.org .
  16. ^ «Тест активации моноцитов: от валидации до лабораторного тестирования GMP» . Американский фармацевтический обзор .
  17. ^ Соймен, Кловис HT; Томасиунайте, Урте; Леглер, Дэниел Ф.; Хаук, Кристоф Р. (2021). «Устранение отрицательной обратной связи в передаче сигналов TLR позволяет быстро и сверхчувствительно обнаруживать микробные загрязнения» . Научные отчеты . 11 (1): 24414. doi : 10.1038/s41598-021-03618-9 . ПМЦ   8709846 . ПМИД   34952917 .
[ редактировать ]
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 873d6ccf794a1e32985df159bc65af01__1705793640
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/87/01/873d6ccf794a1e32985df159bc65af01.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Limulus amebocyte lysate - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)