✖


Jump to content

Нецелевое редактирование генома

Add links

Нецелевое редактирование генома относится к неспецифическим и непреднамеренным генетическим модификациям, которые могут возникнуть в результате использования инженерных нуклеазных технологий, таких как: кластерные, регулярно расположенные короткие палиндромные повторы ( CRISPR ) - Cas9 , эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции ( TALEN ), мегануклеазы. и нуклеазы цинковых пальцев (ZFN). [1] Эти инструменты используют различные механизмы для связывания заранее определенной последовательности ДНК («мишени»), которую они расщепляют (или «разрезают»), создавая двухцепочечный хромосомный разрыв (DSB), который запускает механизмы репарации ДНК клетки (негомологичный конец). присоединение ( NHEJ ) и гомологичную рекомбинацию ( HR )) и приводит к сайт-специфическим модификациям. [2] Если эти комплексы не связываются с мишенью, что часто является результатом гомологичных последовательностей и/или толерантности к несоответствию, они будут расщеплять нецелевой DSB и вызывать неспецифические генетические модификации. [3] [4] [5] В частности, нецелевые эффекты состоят из непреднамеренных точковых мутаций . [6] удаления , [7] [8] вставки [5] инверсии, [5] и транслокации . [9] [8]

Дизайнерские системы нуклеаз, такие как CRISPR-cas9, становятся все более популярными исследовательскими инструментами благодаря своей простоте, масштабируемости и доступности. [10] [11] При этом часто встречаются нецелевые генетические модификации, которые могут изменить функцию интактных генов. Многочисленные исследования с использованием ранних агентов CRISPR-cas9 показали, что более 50% мутаций, индуцированных РНК-ориентированной эндонуклеазой, не происходили на цели. [3] [7] Направляющая РНК Cas9 (гРНК) распознает целевую последовательность ДНК длиной 20 п.н., с которой она связывается и расщепляет, «редактируя» последовательность ДНК. Однако связывание целевой последовательности может допускать несовпадения до нескольких пар оснований, а это означает, что часто существуют тысячи возможных сайтов связывания, что представляет собой несколько экспериментальных проблем и проблем безопасности. [12] [3] В исследовательской сфере нецелевые эффекты могут искажать переменные в биологических исследованиях, что приводит к потенциально вводящим в заблуждение и невоспроизводимым результатам. [2] В клинической сфере основные опасения связаны с нарушением жизненно важных кодирующих областей, что приводит к генотоксическим эффектам, таким как рак. [13] Соответственно, улучшение специфичности [14] [15] инструментов редактирования генома и обнаружения [9] [16] Нецелевые эффекты являются быстро развивающимися областями исследований. Такие исследования включают разработку дизайнерских нуклеаз. [17] и открытие, [18] программы и базы данных вычислительного прогнозирования, [19] [20] и высокопроизводительное секвенирование [9] [16] уменьшить и предвидеть возникновение мутаций. Многие инструменты проектирования нуклеаз все еще находятся в относительном зачаточном состоянии, и по мере того, как их молекулярные свойства и поведение in vivo станут лучше изучены, они станут все более точными и предсказуемыми.

Механизмы

[ редактировать ]

Система CRISPR-Cas9 работает как адаптивная иммунная система у бактерий и архей. [21] Когда вирус заражает бактерии, эта система включает сегменты вирусной ДНК в бактериальный геном. При второй инвазии транскрипты этих последовательностей направляют нуклеазную активность на комплементарную последовательность во вторгшемся вирусе, чтобы уничтожить ее. [22] [23] [24]

Чтобы экстраполировать этот метод на эукариоты и разработать метод редактирования генов, необходимы белок Cas9, РНК последовательности узнавания и трансактивирующая РНК. Слияние как специфичной последовательности распознавания CRISPR РНК (crRNA), так и трансактивирующей РНК (tracrRNA) обычно используется в экспериментах и ​​называется единой направляющей РНК (sgRNA). [25] Он выполняет обе функции: первые 20 нуклеотидов sgRNA комплементарны целевой последовательности ДНК (функция cr), тогда как последующие нуклеотиды являются частью мотива, примыкающего к протоспейсеру (PAM; tracr функция). [26] [27] [28]

Ненацеленное связывание нуклеазы происходит в результате частичного, но достаточного совпадения с целевой последовательностью. Механизмы нецелевого связывания можно сгруппировать в две основные формы: допуск несоответствия основания и несоответствие выпуклости. [29]

Базовый допуск на несоответствие

[ редактировать ]

Хотя специфичность Cas9, как полагают, контролируется 20-нуклеотидной sgRNA и PAM, нецелевые мутации все еще распространены и могут возникать при несовпадении до 3-5 пар оснований (из 20) между sgRNA и целевой последовательностью ДНК. [25] [30] Более того, вторичные структуры sgRNA также могут влиять на расщепление целевых и нецелевых сайтов. Как упоминалось выше, sgRNA состоит из последовательности (~20 нуклеотидов), которая комплементарна целевым последовательностям, за которой следует последовательность PAM, которая активирует активность эндонуклеазы . Хотя было показано, что 10-12 нуклеотидов, прилегающих к PAM (так называемая «затравочная последовательность»), достаточно для специфичности Cas9, Wu et al. показали, что в каталитически мертвом Cas9 для специфичности необходимы только 1-5 пар оснований зародышевой последовательности. [31] Позже это было доказано и другими исследованиями. На связывание белка Cas9 дополнительно влияет ряд механизмов:

  • Затравочная последовательность определяет частоту затравки плюс PAM в геноме и контролирует эффективную концентрацию комплекса sgRNA Cas9.
  • Семена, богатые урацилом, вероятно, будут иметь низкие уровни sgRNA и повышать специфичность, поскольку несколько урацилов в последовательности могут вызывать терминацию транскрипции sgRNA . [31] [32]
  • Несовпадения на 5'-конце crРНК более допустимы, поскольку важный сайт будет примыкать к матрице PAM. Одиночные и двойные несоответствия также допускаются в зависимости от того, как их разместить.
  • В недавнем исследовании Ren et al. наблюдали связь между эффективностью мутагенеза и содержанием GC в sgRNA. Для хорошего редактирования требуется как минимум 4–6 бит рядом с PAM. [33]
  • При выборе гРНК гуанин предпочтительнее цитозина как первое основание семени, соседнего с PAM, цитозин как первое основание в 5'-конце и аденин в середине последовательности. Эта конструкция основана на стабильности, связанной с образованием G-квадруплексов . [31] [32] [34]
  • ChIP et был выполнен Kim al. демонстрируя, что добавление очищенного Cas9 вместе с sgRNA вызывает незначительные нецелевые эффекты, что означает, что существует больше факторов, вызывающих эти эффекты. [35]

Важно отметить, что метилирование ДНК CpG-сайтов снижает эффективность связывания Cas9 и других факторов в клетках. Таким образом, существует эпигенетическая связь, которая будет более подробно изучена в будущем для редактирования эпигенома. [36]

Графическое объяснение выпуклости ДНК и РНК.

Вариации последовательности PAM также могут влиять на активность sgRNA, в свою очередь влияя на саму sgRNA. В обычно используемых системах Cas9 мотив PAM представляет собой 5'NGG3', где N представляет собой любой из четырех нуклеотидов ДНК. Требование последовательности PAM может вызвать проблемы со специфичностью, поскольку некоторые регионы будут иметь доступную целевую последовательность для осуществления желаемой генетической модификации. В отчете говорится, что 99,96% сайтов, которые ранее считались уникальными мишенями Cas9 в экзонах человека, могут иметь потенциальные нецелевые эффекты, содержащие NAG или NGG PAM и несовпадение одного основания в затравочной последовательности. [37]

Несоответствие выпуклости

[ редактировать ]

Как сайты вне мишени с отсутствующими основаниями (или делециями), так и сайты вне мишени с дополнительными основаниями (или вставками), называемые выпуклостью РНК и выпуклостью ДНК соответственно, влияют на специфичность Cas9 и активность расщепления. Лин и др. имитировали эти выпуклости, добавляя и удаляя основания из последовательности sgRNA так, что удаление оснований в sgRNA приводило к выпуклости РНК, а вставка основания приводила к выпуклости ДНК. [7] Изучая частоту мутаций с помощью NHEJ, они пришли к следующим результатам:

  • В случае чистых выпуклостей ДНК мутации хорошо переносились (т.е. активность расщепления Cas9 все еще преобладала). Области толерантности к выпуклости включали семь оснований из PAM и 5'- и 3'-концы затравочной последовательности. Это приводило к аналогичным или немного более высоким (в некоторых случаях) мутациям по сравнению с нулевыми выпуклостями.
  • В случае выпуклостей исключительно РНК более высокая активность Cas9 индуцировалась во многих положениях по сравнению с выпуклостями ДНК. Эта характеристика была объяснена тем фактом, что РНК более гибкая, чем ДНК, и, следовательно, имеет меньший штраф за связывание с выпуклостью РНК, что приводит к более высокой толерантности и большему количеству нецелевых мутаций. [38]
  • Более высокое содержание GC в последовательности sgRNA приводило к более высокой толерантности и, следовательно, к более высокой частоте нецелевых мутаций.
  • Выпуклости из 2-5 п.н. поразительно были более толерантными и вызывали мутации, чем одиночные выпуклости в 2 п.н.

Улучшения

[ редактировать ]
Визуальное изображение CRISPR-cas9 с использованием нуклеазы SpCas9 дикого типа.
Инженерные усовершенствования CRISPR-Cas9, которые уменьшают нецелевые эффекты за счет необходимой i) совместной локализации (никазы Cas9) и ii) димеризации (Fok1-dCas9).

Методы повышения специфичности

[ редактировать ]

Широко используемая нуклеаза Cas9 (SpCas9) Streptococcus pyogenes эффективна, однако она с высокой частотой индуцирует нежелательные нецелевые мутации. Было описано несколько методов инженерии и скрининга с целью уменьшения нецелевых мутаций по всему геному, включая мутации нуклеазы, модификацию последовательности мотива, примыкающего к протоспейсеру (PAM), усечение направляющей РНК (гРНК) и открытие новых нуклеаз. [39] Например, в 2013 г. Фу и др. сообщили, что при усечении гРНК с <20 п.н. в длину до 17 или 18 п.о. целевая специфичность нуклеазы увеличивалась до 5000 раз, а случаи несоответствия более 3 оснований редко, если вообще происходили. [14]

Никасы Cas9

[ редактировать ]

Нуклеазу spCas9 также можно мутировать различными способами для улучшения специфичности и контроля. Домены нуклеазы могут мутировать независимо друг от друга в так называемые никазы Cas9 . Эти нуклеазы имеют один активный и неактивный нуклеазный домен, в результате чего образуется комплекс, осуществляющий одноцепочечное расщепление. [4] Никазы Cas9 могут использоваться в тандеме (так называемые парные никазы), которые выполняют два одноцепочечных «разреза» на чередующихся цепях. [4] Используя эту стратегию, обе никасы Cas9 должны совместно локализовать, связать и расщепить свою цель, что резко снижает вероятность нецелевых инделей . [4] Кроме того, DSB, расщепленные парными никазами, имеют длинные выступы вместо тупых концов, что обеспечивает улучшенный контроль целевых вставок.

Fok1-dCas9 и нуклеазы димеризации

[ редактировать ]

Поскольку мономерные нуклеазы часто вызывают высокий уровень нецелевых эффектов, димеризация является привлекательной стратегией. В димерной системе обе нуклеазы должны связываться со своими отдельными мишенями или «полусайтами», а затем взаимодействовать и димеризоваться, чтобы инициировать расщепление, что значительно снижает вероятность нецелевых эффектов. Был разработан метод, который сочетает в себе надежность димеризационно-зависимых нуклеазных доменов FokI , используемых в ZFN и TALEN, с простотой CRISPR-cas9. [17] Нуклеаза FokI была первоначально обнаружена у Flavobacterium okeanokoites и расщепляет ДНК только при активации димеризации. По сути, исследователи объединили эту нуклеазу с комплексом CRISPR с неактивной нуклеазой Cas9 (Fok1-dCas9). [17] ГРНК направляет комплекс CRISPR к целевому сайту, но «разрез» осуществляется димеризованным Fok1. Подсчитано, что стратегия Fok1-dCas9 снижает обнаруживаемые нецелевые эффекты в 10 000 раз, что делает ее эффективной для приложений, требующих высокоточного и специфического редактирования генома. [17] [40]

Нуклеазная мутация

[ редактировать ]

Помимо мишени гРНК, Cas9 требует связывания со специфической последовательностью PAM из 2–6 нуклеотидов. В обычно используемых системах SpCas9 мотив PAM представляет собой 5' NGG 3', где N представляет собой любой из четырех нуклеотидов ДНК. Требование последовательности PAM может привести к ограничениям специфичности, поскольку в некоторых регионах не будет доступной целевой последовательности для осуществления желаемой генетической модификации. Последовательность PAM можно редактировать, добавляя неканонические мотивы NAG и NGA, что не только повышает специфичность, но и снижает нецелевые эффекты. [41] Мутант D1135E, по-видимому, изменяет специфичность PAM. Мутант D1135E снижает нецелевые эффекты и повышает специфичность SpCas9. [41] Дополнительный вариант, SpCas9-HF1 , также приводит к благоприятному улучшению специфичности Cas9. [42] Идентифицировано несколько комбинаций замен, которые, как известно, образуют неспецифические контакты ДНК (N497A, R661A, Q695A и Q926A). [42] Четверная замена этих остатков (позже названная SpCas9-HF1) имеет чрезвычайно низкий уровень нецелевых эффектов, как было обнаружено в экспериментах GUIDE-seq . [42] Такие варианты, как SpCas9-HF1 и D1135E, а также другие подобные им, можно комбинировать, тестировать и легко добавлять к существующим векторам SpCas9, чтобы снизить частоту нецелевых мутаций. Кроме того, многие из перечисленных выше инженерных стратегий можно объединить для создания все более надежных и надежных инструментов редактирования нуклеаз под управлением РНК. Направленную эволюцию также можно использовать для снижения нуклеазной активности на определенных целевых последовательностях, что приводит к появлению таких вариантов, как SpartaCas (содержащих мутации D23A, T67L, Y128V и D1251G по сравнению с SpCas9 дикого типа). [43]

CRISPRi и CRISPRa

[ редактировать ]

CRISPR-интерференция ( CRISPRi ) и активация CRISPR ( CRISPRa ). Также были разработаны [44] Эти системы могут точно изменять транскрипцию генов на уровне ДНК, не вызывая необратимых генетических изменений. [44] Более того, воздействуя непосредственно на ДНК, они, как правило, более специфичны и предсказуемы по сравнению с РНКи . [45] Хотя CRISPRi/a не может заменить редактирование генома во всех экспериментах, в некоторых случаях они могут выступать в качестве эффективной альтернативы. CRISPRi и CRISPRa используют деактивированный фермент Cas9 (dCas9), который не может разрезать ДНК, но может доставлять активаторы и репрессоры транскрипции для модуляции желаемой экспрессии генов с высокой точностью. [44] В настоящее время нецелевые эффекты CRISPRi минимальны и демонстрируют сниженную реакцию и чувствительность к несовпадениям отдельных оснований. [44] Важно отметить, что когда неизбежно возникают неспецифические эффекты, они обратимы, зависят от времени и менее разрушительны, чем редактирование ДНК, что делает их эффективными альтернативами, которые могут ограничить нецелевое бремя, когда это возможно. CRISPR-cas13b с использованием системы CRISPR-Cas типа IV (в отличие от широко используемого типа II) может нацеливать и редактировать определенные последовательности РНК. [46] Такая платформа редактирования РНК способна специфически редактировать мРНК и, следовательно, трансляцию белков, не изменяя ДНК. Это многообещающая технология, которая в случае успеха уменьшит бремя необратимых нецелевых мутаций.

Обнаружение

[ редактировать ]

Несмотря на то, что можно принять осторожные меры, чтобы избежать нецелевых мутаций, и даже если это удастся, необходимо провести подтверждающий скрининг, чтобы выявить непреднамеренные мутации. В настоящее время существует множество предвзятых и объективных методов такого скрининга и только два метода in vitro . Все это перечислено ниже:

Целевое, экзомное и полногеномное секвенирование.

[ редактировать ]

В случае обычного целевого секвенирования предвзятый подход даст результаты только для предполагаемой области захвата, что затрудняет поиск, поскольку на экране не появляются неожиданные мутации. Хотя это просто и дешево, но после добавления новых целевых сайтов оно становится трудоемким и дорогим. Секвенирование экзома использует захват экзома для получения кодирующих белков областей генома. Он объективен, однако не приводит к целевым мутациям в некодирующей области генома. В случае секвенирования всего генома весь геном проверяется на наличие нецелевых мутаций. В настоящее время этот метод является дорогостоящим, и, как и секвенирование экзома, для формирования выводов по всему геному также требуется эталонный геном. [47]

БЛАГОСЛОВИТЬ

[ редактировать ]
Обзор различных методов обнаружения нецелевых мутаций путем редактирования генома. A) BLESS B) GUIDE-seq C) HTGTS D) Digenome-Seq

BLESS — это самый простой способ обнаружить и количественно оценить нецелевые мутации путем скрининга DSB в геноме. Этот метод основан на прямом разрыве метки in situ , обогащении стрептавидином. Разработан в 2013 году, [48] BLESS осуществляется путем лигирования концов DSB биотином, т.е. биотинилирования. За этим следует разделение/сбор указанных лигированных концов с использованием стрептавидина. Связанная последовательность добавляется к биотинилированным последовательностям, и эта окончательная смесь затем секвенируется для определения положения нецелевой мутации. Будучи беспристрастным по своей природе, BLESS дает информацию о месте мутации в геноме, а не о белках, участвующих или связанных с DSB. Однако BLESS может обнаружить только мутации во время эксперимента, а не те, которые образовались ранее и были исправлены. [49]

ЛАМ-ХТГТС

[ редактировать ]

Опосредованная линейная амплификация — высокопроизводительное полногеномное транслокационное секвенирование, или LAM-HTGTS, — это метод, разработанный для отслеживания событий транслокации, вызванных объединением DSB. [50] Этот метод, разработанный для обнаружения нецелевых мутаций в TALEN и CRISPR-Cas9, основан на репарации ДНК путем соединения концов в DSB. Как только нуклеаза добавляется, она продолжает вызывать мутации как на цели, так и за ее пределами. Наряду с этим существует последовательность приманок, которая также расщепляется. Следовательно, если другой DSB встречается на хромосоме, отличной от хромосомы последовательности приманки, обе они соединяются, что приводит к транслокации. Поскольку последовательность приманки известна, эту транслоцированную последовательность амплифицируют с помощью праймеров. В случае отсутствия транслокации существует сайт рестрикции, внутри которого расщепляется, чтобы предотвратить амплификацию только последовательности-приманки. Затем амплифицированную ДНК секвенируют для изучения крупных геномных перестроек, вызванных нецелевыми мутациями. Одним из недостатков является то, что он основан на одновременном присутствии наживки и другого DSB.

GUIDE-Seq

[ редактировать ]

Другим подходом к обнаружению нецелевых мутаций из-за активности нуклеазы является метод GUIDE-Seq . GUIDE-seq или объективная идентификация DSB по всему геному, обеспечиваемая секвенированием, основана на включении двухцепочечных олигодезоксинуклеотидов (dsODN) в DSB через NHEJ. За его амплификацией следует секвенирование. Поскольку для секвенирования dsODN будут использоваться два праймера, будут амплифицированы области, фланкирующие DSB вместе с DSB. Таким образом, позволяя картировать нецелевую мутацию. Этот метод был применен для идентификации всех ранее известных нецелевых сайтов, а также новых с частотой всего 0,03%. Однако, как и BLESS, GUIDE-seq может обнаруживать только DSB, присутствующие на момент исследования.

Дигеном-Seq

[ редактировать ]

Один из современных методов in vitro , Digenome-Seq, использует свойство Cas9 расщеплять геном для получения объективного профиля всего генома. В этом методе Cas9 добавляется к гДНК, а побочные эффекты изучаются с помощью высокопроизводительного секвенирования. Поскольку фрагменты образуются за счет одной и той же нуклеазы, концы этих фрагментов могут быть сопоставлены совмещенными. Два больших преимущества заключаются в том, что его можно использовать для одновременного изучения до 10 гРНК и можно идентифицировать мишени с частотой всего 0,01%. [9] Однако основным преимуществом является то, что этот метод применяется in vitro, т.е. DSB, введенные Cas9, не будут обрабатываться механизмом репарации ДНК (в отличие от BLESS и GUIDE-seq) и, таким образом, будут включать все возможные нецелевые мутанты. Однако это также может привести к большому количеству ложных срабатываний. [51]

CIRCLE-Seq

[ редактировать ]

Последним дополнением к методам in vitro обнаружения нецелевых мутаций является CIRCLE-seq. Лицензия Beacon Genomics (вместе с GUIDE-seq), [52] Цель CIRCLE-seq — устранить недостатки Digenome-seq, такие как необходимость большого размера выборки и глубины считывания (~ 400 миллионов считываний), а также высокий фон, который затрудняет идентификацию событий низкочастотного расщепления. [53] Он использует независимую от ферментов рестрикции стратегию для создания и выбора преобразования случайно расщепленной ДНК. При расщеплении целевая ДНК образует стволовую петлю, к которой можно добавить адаптеры для секвенирования. Хотя это оказалось возможным, другая возможность привела к кратной разнице в обнаружении. Во втором случае последовательность расщепляется с помощью Cas9, и когда она снова расщепляется на половине сайта, становится доступным круговой разрез (что и послужило причиной названия CIRCLE-seq). Почти все сайты, идентифицированные с помощью циркуляризации, содержат как линейные обнаруженные сайты, так и более новые, что позволяет предположить, что CIRCLE-seq не делает смещения между разрывами, а также получает сильные низкочастотные разрывы. Кроме того, это помогает секвенировать сайт разрыва с обеих сторон расщепления по сравнению с другими методами, которые имеют только одну сторону считывания.

Библиотеки целей со штрих-кодом

[ редактировать ]

Нуклеазы, такие как Cas9, также могут быть заражены in vitro с помощью рандомизированных библиотек мишеней. [54] Связывание адаптера для количественного определения расщепленных и нерасщепленных членов библиотеки позволяет объективно измерить профиль специфичности нуклеазы. Измерение расщепления библиотек мишеней со штрих-кодом (BLT) с помощью SpCas9 показало, что профили специфичности были специфичными для направляющей и зависят от направляющей последовательности, а также от самой нуклеазы. Непредвзятые профили специфичности, основанные на каждом конкретном комплексе Cas9-гРНК, могут затем использоваться для создания специфичных для направляющих прогностических моделей расщепления in vitro .

Значение

[ редактировать ]

Генная терапия

[ редактировать ]

Для того чтобы технологии редактирования генов могли совершить скачок к безопасному и широкому использованию в клинике, необходимо, чтобы скорость нецелевых модификаций стала устаревшей. Безопасность лечения генной терапией вызывает первостепенное беспокойство, особенно во время клинических испытаний, когда нецелевые модификации могут заблокировать дальнейшую разработку продукта-кандидата. [55] Пожалуй, самым известным примером современной генной терапии является CAR-T-терапия, которая используется для лечения В-клеточной лимфомы . Чтобы ограничить скорость нецелевого расщепления, в терапии используется высокоспецифичный и точно настроенный TALEN, который, как доказано, практически не имеет фонового нецелевого взаимодействия. [55] CAR-T Иммунотерапия — это процедура ex vivo , что означает, что иммунные клетки пациента (в данном случае Т-клетки ) извлекаются и редактируются с помощью дизайнерских нуклеаз. [55] Хотя разработка системы TALEN является дорогостоящей и трудоемкой, исследовательские и инженерные модификации резко ограничили уровень нецелевого взаимодействия. Тем не менее, пациенты, получающие лечение, по-прежнему находятся под частым наблюдением и будут наблюдаться в течение следующих 15 лет, чтобы можно было проанализировать и принять во внимание нецелевые эффекты и иммуногенные реакции по мере того, как новые методы генной терапии доводятся до клинических испытаний. [56]

Испытания аутологичных Т-хелперов, модифицированных CCR5 ZFN

[ редактировать ]

I/II фазы В клиническое исследование включили 12 пациентов с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД) для проверки безопасности и эффективности введения ZFN-модифицированных аутологичных Т-хелперов. [57] Посредством целенаправленных делеций специальный ZFN отключает ген рецептора 5 хемокинов CC ( CCR5 ), который кодирует корецептор, используемый вирусом ВИЧ для проникновения в клетку. [58] В результате высокой степени гомологии последовательностей между рецепторами хемокинов CC этот ZFN также расщепляет CCR2 , что приводит к нецелевым делециям ~15 т.п.н. и геномным перестройкам. [58] [59] Влияние этих модификаций CCR2 до сих пор неизвестно, и на сегодняшний день не зарегистрировано никаких побочных эффектов. Однако известно, что CCR2 играет множество важных ролей в нервной и метаболической системах. [60] [61]

Генные Драйвы

[ редактировать ]

Генные драйвы с использованием CRISPR-cas9 в настоящее время тестируются и предлагаются в качестве стратегии по устранению инвазивных видов и переносчиков болезней. Генетически модифицируя организм для экспрессии эндогенной эндонуклеазы, специфичной для последовательности, можно расщепить мишень (например, ген фертильности) на противоположной хромосоме. [62] DSB в мишени приводит к гомологичной репарации, которая эффективно делает организм гомозиготным по желаемой целевой последовательности. Эта стратегия, известная как стремление к самонаведению, может подавить популяцию, воздействуя на критический ген или вызывая рецессивную стерильность. Однако, если бы такая система была выпущена в дикую природу, система CRISPR-cas9 продолжала бы функционировать неопределенно долго. С каждым последующим поколением нецелевые мутации становились все более вероятными, и влияние этих мутаций на вид было бы стохастическим. Нецелевые мутации могут отключить подавляющие свойства генного драйва, сохраняя при этом экспрессию эндонуклеазы. В такой ситуации будет повышен риск потока генов между целевым видом и другими видами, что может привести к нежелательным результатам. [63]

Споры

[ редактировать ]

Более широкое использование редактирования генома и его возможное применение в клинической практике вызвали споры вокруг истинного нецелевого бремени этих технологий.

Шефер и др. 2017 год

[ редактировать ]

30 мая 2017 года в журнале Nature Methods была опубликована двухстраничная корреспондентская статья, в которой сообщалось о необычно большом количестве нецелевых SNV и инделей после секвенирования мышей, которые ранее участвовали в эксперименте по восстановлению генов in vivo . [64] Предыдущий эксперимент, проведенный той же группой, успешно восстановил зрение слепым мышам линии ( rd1 ) путем коррекции мутации Y347X в гене Pde6b с помощью системы CRISPR-cas9. [65] После завершения эксперимента у двух генетически скорректированных мышей секвенировали весь геном и сравнили его с контрольными и известными геномами мышей. Было обнаружено более 1600 SNV и 128 инделей, из которых 1397 SNV и 117 инделей были общими для двух отредактированных мышей, что позволяет предположить, что нецелевые эффекты не были случайными. Алгоритмы, пытавшиеся предсказать расположение этих нецелевых мутаций, не увенчались успехом для подавляющего большинства локусов. Для сравнения: исследование секвенирования всего экзома, проведенное в 2016 году, выявило 19 SNV и 3 инделя у 5 отредактированных мышей, в то время как Schaefer et al. обнаружили 115 экзонных SNV и 9 инделей всего у двух отредактированных мышей. [66] Многие эксперты не согласились с статьей и раскритиковали ее в журнальных статьях. [66] и социальных сетях, что позволяет предположить, что в первоначальной статье использовались необычные методы CRISPR, а размер выборки был слишком мал для значимости (n = 2). Nature Methods опубликовала две редакционные заметки к статье: [67] и позже отказался от него. [68] Тем не менее, показатели отклонения от цели постоянно обнаруживаются более часто in vivo по сравнению с экспериментами на клеточных культурах, и считается, что они особенно распространены у людей. [3] [7]

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Коста-младший, Бейчек Б.Е., МакГи Дж.Э., Фогель А.И., Бримакомб К.Р., Кеттелер Р. (2004). «Редактирование генома с использованием сконструированных нуклеаз и их использование в геномном скрининге». В Ситтампаламе Г.С., Кусенсе Н.П., Бримакомбе К., Гроссмане А., Аркине М., Олде Д. и др. (ред.). Руководство по проведению анализа . Бетесда (MD): Eli Lilly & Company и Национальный центр развития трансляционных наук. ПМИД   29165977 .
  2. ^ Jump up to: а б Конг Л, Чжан Ф (2015). «Геномная инженерия с использованием системы CRISPR-Cas9». Хромосомный мутагенез . Методы молекулярной биологии. Том. 1239. стр. 197–217. дои : 10.1007/978-1-4939-1862-1_10 . hdl : 1721.1/102943 . ISBN  978-1-4939-1861-4 . ПМЦ   3969860 . ПМИД   25408407 .
  3. ^ Jump up to: а б с д Фу Й., Фоден Дж.А., Хайтер С., Мэдер М.Л., Рейон Д., Йонг Дж.К., Сандер Дж.Д. (сентябрь 2013 г.). «Высокочастотный нецелевой мутагенез, индуцированный нуклеазами CRISPR-Cas в клетках человека» . Природная биотехнология . 31 (9): 822–6. дои : 10.1038/nbt.2623 . ПМЦ   3773023 . ПМИД   23792628 .
  4. ^ Jump up to: а б с д Чо С.В., Ким С., Ким Ю, Квеон Дж., Ким Х.С., Пэ С., Ким Дж.С. (январь 2014 г.). «Анализ нецелевых эффектов РНК-управляемых эндонуклеаз и никаз, полученных из CRISPR/Cas» . Геномные исследования . 24 (1): 132–41. дои : 10.1101/гр.162339.113 . ПМЦ   3875854 . ПМИД   24253446 .
  5. ^ Jump up to: а б с Верес А., Госис Б.С., Дин К., Коллинз Р., Рагавендран А., Бранд Х., Эрдин С., Коуэн К.А., Тальковски М.Е., Мусунуру К. (июль 2014 г.). «Низкая частота нецелевых мутаций в отдельных клонах стволовых клеток человека, нацеленных на CRISPR-Cas9 и TALEN, обнаруженная с помощью полногеномного секвенирования» . Клеточная стволовая клетка . 15 (1): 27–30. дои : 10.1016/j.stem.2014.04.020 . ПМЦ   4082799 . ПМИД   24996167 .
  6. ^ Ван Х., Ян Х., Шивалила К.С., Давлати М.М., Ченг А.В., Чжан Ф., Джениш Р. (май 2013 г.). «Одноэтапное создание мышей, несущих мутации в нескольких генах, с помощью геномной инженерии, опосредованной CRISPR/Cas» . Клетка . 153 (4): 910–8. дои : 10.1016/j.cell.2013.04.025 . ПМЦ   3969854 . ПМИД   23643243 .
  7. ^ Jump up to: а б с д Лин Ю, Крэдик Т.Дж., Браун М.Т., Дешмукх Х., Ранджан П., Сарод Н., Уайл Б.М., Вертино П.М., Стюарт Ф.Дж., Бао Дж. (июнь 2014 г.). «Системы CRISPR/Cas9 обладают нецелевой активностью с вставками или делециями между последовательностями целевой ДНК и направляющей РНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (11): 7473–85. дои : 10.1093/nar/gku402 . ПМК   4066799 . ПМИД   24838573 .
  8. ^ Jump up to: а б Крэдик Т.Дж., Файн Э.Дж., Антико С.Дж., Бао Дж. (ноябрь 2013 г.). «Системы CRISPR/Cas9, нацеленные на гены β-глобина и CCR5, обладают значительной нецелевой активностью» . Исследования нуклеиновых кислот . 41 (20): 9584–92. дои : 10.1093/нар/gkt714 . ПМЦ   3814385 . ПМИД   23939622 .
  9. ^ Jump up to: а б с д Ким Д., Пэ С., Пак Дж., Ким Э., Ким С., Ю Х.Р., Хван Дж., Ким Джи, Ким Дж.С. (март 2015 г.). «Digenome-seq: полногеномное профилирование нецелевых эффектов CRISPR-Cas9 в клетках человека». Природные методы . 12 (3): 237–43, 1 стр. после 243. doi : 10.1038/nmeth.3284 . ПМИД   25664545 . S2CID   22626843 .
  10. ^ Махфуз М.М., Пиатек А., Стюарт К.Н. (октябрь 2014 г.). «Геномная инженерия с помощью систем TALEN и CRISPR/Cas9: проблемы и перспективы» . Журнал биотехнологии растений . 12 (8): 1006–14. дои : 10.1111/pbi.12256 . ПМИД   25250853 .
  11. ^ Пенниси Э. (август 2013 г.). «Увлечение CRISPR». Наука . 341 (6148): 833–6. Бибкод : 2013Sci...341..833P . дои : 10.1126/science.341.6148.833 . ПМИД   23970676 .
  12. ^ Сюй П.Д., Ландер Э.С., Чжан Ф. (июнь 2014 г.). «Разработка и применение CRISPR-Cas9 для генной инженерии» . Клетка . 157 (6): 1262–78. дои : 10.1016/j.cell.2014.05.010 . ПМЦ   4343198 . ПМИД   24906146 .
  13. ^ Ид А, Махфуз М.М. (октябрь 2016 г.). «Редактирование генома: путь CRISPR/Cas9 от стенда до клиники» . Экспериментальная и молекулярная медицина . 48 (10): е265. дои : 10.1038/emm.2016.111 . ПМК   5099421 . ПМИД   27741224 .
  14. ^ Jump up to: а б Фу Ю, Сандер Дж. Д., Рейон Д., Касио В. М., Йонг Дж. К. (март 2014 г.). «Улучшение специфичности нуклеазы CRISPR-Cas с использованием укороченных направляющих РНК» . Природная биотехнология . 32 (3): 279–284. дои : 10.1038/nbt.2808 . ПМЦ   3988262 . ПМИД   24463574 .
  15. ^ Стендедж-Бейер К., Чжан Ц, Ван Икс (ноябрь 2015 г.). «Направленное крупномасштабное удаление бактериальных геномов с помощью CRISPR-никаз» . ACS Синтетическая биология . 4 (11): 1217–25. дои : 10.1021/acsynbio.5b00132 . ПМЦ   4655420 . ПМИД   26451892 .
  16. ^ Jump up to: а б Цай С.К., Нгуен Н.Т., Малагон-Лопес Дж., Топкар В.В., Арье М.Дж., Йонг Дж.К. (июнь 2017 г.). «CIRCLE-seq: высокочувствительный скрининг in vitro для выявления нецелевых нуклеаз CRISPR-Cas9 по всему геному» . Природные методы . 14 (6): 607–614. дои : 10.1038/nmeth.4278 . ПМЦ   5924695 . ПМИД   28459458 .
  17. ^ Jump up to: а б с д Цай С.К., Вивекенс Н., Хайтер С., Фоден Дж.А., Тапар В., Рейон Д., Гудвин М.Дж., Ари М.Дж., Йонг Дж.К. (июнь 2014 г.). «Димерные CRISPR-РНК-ориентированные нуклеазы FokI для высокоспецифичного редактирования генома» . Природная биотехнология . 32 (6): 569–76. дои : 10.1038/nbt.2908 . ПМК   4090141 . ПМИД   24770325 .
  18. ^ Унгерер Дж., Пакраси Х.Б. (декабрь 2016 г.). «Cpf1 — универсальный инструмент для редактирования генома CRISPR различных видов цианобактерий» . Научные отчеты . 6 : 39681. Бибкод : 2016NatSR...639681U . дои : 10.1038/srep39681 . ПМК   5175191 . ПМИД   28000776 .
  19. ^ Сингх Р., Куску С., Куинлан А., Ци Ю, Адли М. (октябрь 2015 г.). «Информация о связывании Cas9-хроматина позволяет более точно прогнозировать отклонения от цели CRISPR» . Исследования нуклеиновых кислот . 43 (18): е118. дои : 10.1093/нар/gkv575 . ПМЦ   4605288 . ПМИД   26032770 .
  20. ^ Цай С.К., Чжэн З., Нгуен Н.Т., Либерс М., Топкар В.В., Тапар В., Вивекенс Н., Хайтер С., Иафрате А.Дж., Ле Л.П., Арье М.Дж., Йонг Дж.К. (февраль 2015 г.). «GUIDE-seq обеспечивает полногеномное профилирование нецелевого расщепления нуклеазами CRISPR-Cas» . Природная биотехнология . 33 (2): 187–197. дои : 10.1038/nbt.3117 . ПМК   4320685 . ПМИД   25513782 .
  21. ^ Хорват П., Баррангу Р. (январь 2010 г.). «CRISPR/Cas, иммунная система бактерий и архей». Наука . 327 (5962): 167–70. Бибкод : 2010Sci...327..167H . дои : 10.1126/science.1179555 . ПМИД   20056882 . S2CID   17960960 .
  22. ^ Гасюнас Г., Баррангу Р., Хорват П., Сикснис В. (сентябрь 2012 г.). «Рибонуклеопротеиновый комплекс Cas9-crRNA опосредует специфическое расщепление ДНК для адаптивного иммунитета у бактерий» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 109 (39): E2579-86. дои : 10.1073/pnas.1208507109 . ПМЦ   3465414 . ПМИД   22949671 .
  23. ^ Джинек М., Чилински К., Фонфара И., Хауэр М., Дудна Дж.А., Шарпантье Э. (август 2012 г.). «Программируемая ДНК-эндонуклеаза, управляемая двойной РНК, в адаптивном бактериальном иммунитете» . Наука . 337 (6096): 816–21. Бибкод : 2012Sci...337..816J . дои : 10.1126/science.1225829 . ПМК   6286148 . ПМИД   22745249 .
  24. ^ Чжан XH, Ти LY, Ван XG, Хуан QS, Ян Ш (ноябрь 2015 г.). «Нецелевые эффекты в генной инженерии с использованием CRISPR/Cas9» . Молекулярная терапия: нуклеиновые кислоты . 4 (11): е264. дои : 10.1038/mtna.2015.37 . ПМЦ   4877446 . ПМИД   26575098 .
  25. ^ Jump up to: а б Конг Л., Ран Ф.А., Кокс Д., Лин С., Барретто Р., Хабиб Н., Сюй П.Д., Ву Х, Цзян В., Марраффини Л.А., Чжан Ф (февраль 2013 г.). «Мультиплексная геномная инженерия с использованием систем CRISPR/Cas» . Наука . 339 (6121): 819–23. Бибкод : 2013Sci...339..819C . дои : 10.1126/science.1231143 . ПМЦ   3795411 . ПМИД   23287718 .
  26. ^ Мохика Ф.Д., Диес-Вильясеньор К., Гарсиа-Мартинес Х., Альмендрос К. (март 2009 г.). «Короткие последовательности мотивов определяют цели прокариотической защитной системы CRISPR» . Микробиология . 155 (Часть 3): 733–40. дои : 10.1099/mic.0.023960-0 . ПМИД   19246744 .
  27. ^ Штернберг С.Х., Реддинг С., Джинек М., Грин ЕС, Дудна Дж.А. (март 2014 г.). «Опрос ДНК с помощью CRISPR-РНК-ориентированной эндонуклеазы Cas9» . Природа . 507 (7490): 62–7. Бибкод : 2014Natur.507...62S . дои : 10.1038/nature13011 . ПМК   4106473 . ПМИД   24476820 .
  28. ^ Андерс С., Нивонер О., Дюрст А., Джинек М. (сентябрь 2014 г.). «Структурные основы PAM-зависимого распознавания целевой ДНК эндонуклеазой Cas9» . Природа . 513 (7519): 569–73. Бибкод : 2014Natur.513..569A . дои : 10.1038/nature13579 . ПМК   4176945 . ПМИД   25079318 .
  29. ^ Лин Ю, Крэдик Т.Дж., Браун М.Т., Дешмукх Х., Ранджан П., Сарод Н., Уайл Б.М., Вертино П.М., Стюарт Ф.Дж., Бао Дж. (июнь 2014 г.). «Системы CRISPR/Cas9 обладают нецелевой активностью с вставками или делециями между последовательностями целевой ДНК и направляющей РНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (11): 7473–85. дои : 10.1093/nar/gku402 . ПМК   4066799 . ПМИД   24838573 .
  30. ^ Сюй П.Д., Скотт Д.А., Вайнштейн Дж.А., Ран Ф.А., Конерманн С., Агарвала В., Ли Ю, Файн Э.Дж., Ву Икс, Шалем О., Крэдик Т.Дж., Марраффини Л.А., Бао Г., Чжан Ф. (сентябрь 2013 г.). «Специфичность воздействия на ДНК РНК-ориентированных нуклеаз Cas9» . Природная биотехнология . 31 (9): 827–32. дои : 10.1038/nbt.2647 . ПМЦ   3969858 . ПМИД   23873081 .
  31. ^ Jump up to: а б с Ву X, Скотт Д.А., Криз А.Дж., Чиу А.С., Сюй П.Д., Дадон Д.Б., Ченг А.В., Тревино А.Е., Конерманн С., Чен С., Джениш Р., Чжан Ф., Шарп П.А. (июль 2014 г.). «Полногеномное связывание эндонуклеазы CRISPR Cas9 в клетках млекопитающих» . Природная биотехнология . 32 (7): 670–6. дои : 10.1038/nbt.2889 . ПМЦ   4145672 . ПМИД   24752079 .
  32. ^ Jump up to: а б Ван Т., Вэй Джей Джей, Сабатини Д.М., Ландер Э.С. (январь 2014 г.). «Генетические скрининги клеток человека с использованием системы CRISPR-Cas9» . Наука . 343 (6166): 80–4. Бибкод : 2014Sci...343...80W . дои : 10.1126/science.1246981 . ПМК   3972032 . ПМИД   24336569 .
  33. ^ Рен X, Ян Z, Сюй J, Сунь J, Мао D, Ху Y, Ян SJ, Цяо ХХ, Ван X, Ху Q, Дэн П, Лю LP, Цзи JY, Ли JB, Ni JQ (ноябрь 2014 г.). «Повышенная специфичность и эффективность системы CRISPR/Cas9 с оптимизированными параметрами sgRNA у дрозофилы» . Отчеты по ячейкам . 9 (3): 1151–62. дои : 10.1016/j.celrep.2014.09.044 . ПМК   4250831 . ПМИД   25437567 .
  34. ^ Морено-Матеос М.А., Вейнар С.Э., Бодуан Ж.Д., Фернандес Ж.П., Мис Е.К., Хоха М.К., Хиральдез А.Дж. (октябрь 2015 г.). «CRISPRscan: разработка высокоэффективных sgRNA для нацеливания на CRISPR-Cas9 in vivo» . Природные методы . 12 (10): 982–8. дои : 10.1038/nmeth.3543 . ПМЦ   4589495 . ПМИД   26322839 .
  35. ^ Ким С., Ким Д., Чо С.В., Ким Дж., Ким Дж.С. (июнь 2014 г.). «Высокоэффективное редактирование генома под контролем РНК в клетках человека посредством доставки очищенных рибонуклеопротеинов Cas9» . Геномные исследования . 24 (6): 1012–9. дои : 10.1101/гр.171322.113 . ПМК   4032847 . ПМИД   24696461 .
  36. ^ Куску С., Арслан С., Сингх Р., Торп Дж., Адли М. (июль 2014 г.). «Полногеномный анализ выявляет характеристики нецелевых сайтов, связанных эндонуклеазой Cas9». Природная биотехнология . 32 (7): 677–83. дои : 10.1038/nbt.2916 . ПМИД   24837660 . S2CID   29285105 .
  37. ^ Мали П., Аах Дж., Стрэнджс П.Б., Эсвелт К.М., Моосбернер М., Косури С., Ян Л., Черч ГМ (сентябрь 2013 г.). «Активаторы транскрипции CAS9 для скрининга целевой специфичности и парные никазы для совместной геномной инженерии» . Природная биотехнология . 31 (9): 833–8. дои : 10.1038/nbt.2675 . ПМЦ   3818127 . ПМИД   23907171 .
  38. ^ Альбертс Б., Джонсон А., Льюис Дж., Рафф М., Робертс К., Уолтер П. (2007). Молекулярная биология клетки . Нью-Йорк: Garland Science. {{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  39. ^ Кадам У.С., Шелаке Р.М., Чавхан Р.Л., Супрасанна П. (2018). «Опасения по поводу нецелевой активности эндонуклеаз, редактирующих геном». Физиология и биохимия муравьев . 131 : 22–30. Бибкод : 2018PlPB..131...22K . дои : 10.1016/j.plaphy.2018.03.027 . ПМИД   29653762 . S2CID   4846191 .
  40. ^ Вивекенс Н., Топкар В.В., Хайтер С., Йонг Дж.К., Цай С.К. (июль 2015 г.). «Димерные CRISPR-РНК-ориентированные нуклеазы FokI-dCas9, управляемые усеченными гРНК, для высокоспецифичного редактирования генома» . Генная терапия человека . 26 (7): 425–31. дои : 10.1089/hum.2015.084 . ПМК   4509490 . ПМИД   26068112 .
  41. ^ Jump up to: а б Кляйнстивер Б.П., Прев М.С., Цай С.К., Топкар В.В., Нгуен Н.Т., Чжэн З., Гонсалес А.П., Ли З., Петерсон Р.Т., Йе Дж.Р., Арье М.Дж., Йонг Дж.К. (июль 2015 г.). «Сконструированные нуклеазы CRISPR-Cas9 с измененными специфичностями PAM» . Природа . 523 (7561): 481–5. Бибкод : 2015Natur.523..481K . дои : 10.1038/nature14592 . ПМК   4540238 . ПМИД   26098369 .
  42. ^ Jump up to: а б с Кляйнстивер Б.П., Паттанаяк В., Прев М.С., Цай С.К., Нгуен Н.Т., Чжэн З., Йонг Дж.К. (январь 2016 г.). «Высокоточные нуклеазы CRISPR-Cas9 без обнаруживаемых нецелевых эффектов в масштабе всего генома» . Природа . 529 (7587): 490–5. Бибкод : 2016Natur.529..490K . дои : 10.1038/nature16526 . ПМЦ   4851738 . ПМИД   26735016 .
  43. ^ Черчионе, Дерек; Лавлак, Кэтрин; Тиллотсон, Эрик Л.; Харбински, Фред; ДаСильва, Джен; Келли, Чейз П.; Кестон-Смит, Элиза; Фернандес, Сесилия А.; Майер, Вик Э.; Джаярам, ​​Харихаран; Стейнберг, Барретт Э. (16 апреля 2020 г.). «Библиотеки SMOOT и направленная фаговая эволюция Cas9 для снижения нецелевой активности» . ПЛОС ОДИН . 15 (4): e0231716. Бибкод : 2020PLoSO..1531716C . дои : 10.1371/journal.pone.0231716 . ПМК   7161989 . ПМИД   32298334 .
  44. ^ Jump up to: а б с д Гилберт Л.А., Хорлбек М.А., Адамсон Б., Виллалта Дж.Е., Чен Ю., Уайтхед Э.Х., Гимарайнш К., Пэннинг Б., Плох Х.Л., Бассик М.С., Ци Л.С., Кампманн М., Вайсман Дж.С. (октябрь 2014 г.). «CRISPR-опосредованный контроль репрессии и активации генов в масштабе генома» . Клетка . 159 (3): 647–61. дои : 10.1016/j.cell.2014.09.029 . ПМЦ   4253859 . ПМИД   25307932 .
  45. ^ Ларсон М.Х., Гилберт Л.А., Ван X, Лим В.А., Вайсман Дж.С., Ци Л.С. (ноябрь 2013 г.). «CRISPR-интерференция (CRISPRi) для последовательно-специфического контроля экспрессии генов» . Протоколы природы . 8 (11): 2180–96. дои : 10.1038/nprot.2013.132 . ПМЦ   3922765 . ПМИД   24136345 .
  46. ^ Кокс Д.Б., Гутенберг Дж.С., Абудайе О.О., Франклин Б., Келлнер М.Дж., Йонг Дж., Чжан Ф. (ноябрь 2017 г.). «Редактирование РНК с помощью CRISPR-Cas13» . Наука . 358 (6366): 1019–1027. Бибкод : 2017Sci...358.1019C . дои : 10.1126/science.aaq0180 . ПМЦ   5793859 . ПМИД   29070703 .
  47. ^ Зишевски Дж., Фишер Р., Бортези Л. (2017). «Обнаружение целевых и нецелевых мутаций, генерируемых CRISPR/Cas9 и другими нуклеазами, специфичными для последовательностей» . Достижения биотехнологии . 35 (1): 95–104. doi : 10.1016/j.biotechadv.2016.12.003 . ПМИД   28011075 .
  48. ^ Крозетто Н., Митра А., Сильва М.Дж., Биенко М., Дохер Н., Ван К., Карача Е., Чиарле Р., Скшипчак М., Гинальски К., Пасеро П., Ровицка М., Дикич И. (апрель 2013 г.). «Картирование двухцепочечных разрывов ДНК с нуклеотидным разрешением методом секвенирования следующего поколения» . Природные методы . 10 (4): 361–5. дои : 10.1038/nmeth.2408 . ПМК   3651036 . ПМИД   23503052 .
  49. ^ Цай С.К., Йонг Дж.К. (май 2016 г.). «Определение и улучшение полногеномных особенностей нуклеаз CRISPR-Cas9» . Обзоры природы Генетика . 17 (5): 300–12. дои : 10.1038/nrg.2016.28 . ПМЦ   7225572 . ПМИД   27087594 .
  50. ^ Маллин Х., Хестерикова М., Рейтер Р., Уорд Т.Р. (май 2016 г.). «Разработка библиотеки и протокол скрининга искусственных металлоферментов на основе биотин-стрептавидиновой технологии». Протоколы природы . 11 (5): 835–52. дои : 10.1038/нпрот.2016.019 . ПМИД   27031496 . S2CID   22365528 .
  51. ^ Fu BX, St Onge RP, Fire AZ, Smith JD (июнь 2016 г.). «Отличные закономерности толерантности к несоответствию Cas9 in vitro и in vivo» . Исследования нуклеиновых кислот . 44 (11): 5365–77. дои : 10.1093/nar/gkw417 . ПМЦ   4914125 . ПМИД   27198218 .
  52. ^ «Пресс-релиз CIRCLE-Seq» . beacongenomics.com . Проверено 01 марта 2018 г.
  53. ^ Цай С.К., Нгуен Н.Т., Малагон-Лопес Дж., Топкар В.В., Арье М.Дж., Йонг Дж.К. (июнь 2017 г.). «CIRCLE-seq: высокочувствительный скрининг in vitro для выявления нецелевых нуклеаз CRISPR-Cas9 по всему геному» . Природные методы . 14 (6): 607–614. дои : 10.1038/nmeth.4278 . ПМЦ   5924695 . ПМИД   28459458 .
  54. ^ Хьюстон, Николас К.; Тыко, Джош; Тиллотсон, Эрик Л.; Уилсон, Кристофер Дж.; Майер, Вик Э.; Джаярам, ​​Харихаран; Стейнберг, Барретт Э. (1 июня 2019 г.). «Идентификация направляющих внутренних детерминант специфичности Cas9» . Журнал CRISPR . 2 (3): 172–185. дои : 10.1089/crispr.2019.0009 . ISSN   2573-1599 . ПМК   6694761 . ПМИД   31225747 .
  55. ^ Jump up to: а б с Гаутрон А.С., Жюйера А., Гайо В., Филхол Ж.М., Дессез Э., Дюклер А., Дюшато П., Пуаро Л. (декабрь 2017 г.). «Точная и предсказуемая настройка направленного редактирования генов TALEN для улучшения адоптивной иммунотерапии Т-клеток» . Молекулярная терапия: нуклеиновые кислоты . 9 : 312–321. дои : 10.1016/j.omtn.2017.10.005 . ПМЦ   5684446 . ПМИД   29246309 .
  56. ^ Левин Б.Л., Мискин Дж., Воннакотт К., Кейр С. (март 2017 г.). «Глобальное производство CAR-T-клеточной терапии» . Молекулярная терапия: методы и клиническое развитие . 4 : 92–101. дои : 10.1016/j.omtm.2016.12.006 . ПМЦ   5363291 . ПМИД   28344995 .
  57. ^ Тебас П., Стейн Д., Тан В.В., Фрэнк И., Ван С.К., Ли Дж., Спратт С.К., Суроски Р.Т., Гидлин М.А., Никол Г., Холмс М.С., Грегори П.Д., Андо Д.Г., Калос М., Коллман Р.Г., Биндер-Шолль Г., Плеса Дж., Хван В.Т., Левин Б.Л., Джун CH (март 2014 г.). «Редактирование гена CCR5 в аутологичных CD4 Т-клетках людей, инфицированных ВИЧ» . Медицинский журнал Новой Англии . 370 (10): 901–10. дои : 10.1056/NEJMoa1300662 . ПМК   4084652 . ПМИД   24597865 .
  58. ^ Jump up to: а б Ли Х.Дж., Ким Э., Ким Дж.С. (январь 2010 г.). «Направленные хромосомные делеции в клетках человека с использованием нуклеаз цинковых пальцев» . Геномные исследования . 20 (1): 81–9. дои : 10.1101/гр.099747.109 . ПМЦ   2798833 . ПМИД   19952142 .
  59. ^ Ли Х.Дж., Квеон Дж., Ким Э, Ким С., Ким Дж.С. (март 2012 г.). «Направленные хромосомные дупликации и инверсии в геноме человека с использованием нуклеаз цинковых пальцев» . Геномные исследования . 22 (3): 539–48. дои : 10.1101/гр.129635.111 . ПМК   3290789 . ПМИД   22183967 .
  60. ^ Боринг Л., Гослинг Дж., Клири М., Чаро И.Ф. (август 1998 г.). «Снижение образования повреждений у мышей CCR2-/- показывает роль хемокинов в инициировании атеросклероза». Природа . 394 (6696): 894–7. Бибкод : 1998Natur.394..894B . дои : 10.1038/29788 . ПМИД   9732872 . S2CID   4396768 .
  61. ^ Эль Хури Дж., Тофт М., Хикман С.Э., Минс ТК, Терада К., Геула С., Ластер А.Д. (апрель 2007 г.). «Дефицит Ccr2 ухудшает накопление микроглии и ускоряет прогрессирование болезни Альцгеймера». Природная медицина . 13 (4): 432–8. дои : 10.1038/нм1555 . ПМИД   17351623 . S2CID   18276692 .
  62. ^ Чампер Дж., Бухман А., Акбари ОС (март 2016 г.). «Обман эволюции: создание генных двигателей для манипулирования судьбой диких популяций» . Обзоры природы Генетика . 17 (3): 146–59. дои : 10.1038/nrg.2015.34 . ПМИД   26875679 .
  63. ^ Уэббер Б.Л., Рагу С., Эдвардс О.Р. (август 2015 г.). «Мнение: Является ли генный привод на основе CRISPR серебряной пулей биоконтроля или глобальной угрозой для природы?» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 112 (34): 10565–7. дои : 10.1073/pnas.1514258112 . ПМЦ   4553820 . ПМИД   26272924 .
  64. ^ Шефер К.А., Ву В.Х., Колган Д.Ф., Цанг С.Х., Бассук А.Г., Махаджан В.Б. (май 2017 г.). «Неожиданные мутации после редактирования CRISPR-Cas9 in vivo» . Природные методы . 14 (6): 547–548. дои : 10.1038/nmeth.4293 . ПМК   5796662 . ПМИД   28557981 . (Отозвано, см. doi : 10.1038/nmeth.4293 , Часы втягивания )
  65. ^ Ву В.Х., Цай Ю.Т., Юстус С., Ли Т.Т., Чжан Л., Линь К.С., Бассук А.Г., Махаджан В.Б., Цанг Ш.Х. (август 2016 г.). «Восстановление CRISPR выявляет причинную мутацию в доклинической модели пигментного ретинита» . Молекулярная терапия . 24 (8): 1388–94. дои : 10.1038/mt.2016.107 . ПМК   5023380 . ПМИД   27203441 .
  66. ^ Jump up to: а б Уилсон С.Дж., Феннелл Т., Ботмер А., Мэдер М.Л., Рейон Д., Котта-Рамусино С., Фернандес К.А., Марко Э., Баррера Л.А. (10 июля 2017 г.). «Экспериментальный план и интерпретация данных в статье «Неожиданные мутации после редактирования CRISPR Cas9 in vivo» Шефера и др. недостаточны для подтверждения выводов, сделанных авторами». bioRxiv   10.1101/153338 .
  67. ^ «Спорная статья CRISPR получила второе редакционное примечание» . Часы втягивания.
  68. ^ Накадзима К., Кадзуно А.А., Келсо Дж., Наканиси М., Такуми Т., Като Т. (октябрь 2016 г.). «Секвенирование экзома у нокинных мышей, созданное с использованием системы CRISPR/Cas» . Научные отчеты . 6 : 34703. Бибкод : 2016NatSR...634703N . дои : 10.1038/srep34703 . ПМК   5048150 . ПМИД   27698470 .
[ редактировать ]
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Off-target_genome_editing&oldid=1233373780"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 9e58f33c3018ebe5411f305250295f59__1720454700
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/9e/59/9e58f33c3018ebe5411f305250295f59.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Off-target genome editing - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)