Рекомбинация
Рекомбинация ( инженерия генная , опосредованная рекомбинацией ) [ 1 ] — это метод генетической и молекулярной биологии, основанный на системах гомологичной рекомбинации , в отличие от более старого/более распространенного метода использования ферментов рестрикции и лигаз для объединения последовательностей ДНК в определенном порядке. Рекомбинация широко используется в бактериальной генетике, при создании целевых векторов для условного нокаута мышей и для модификации ДНК любого источника, часто содержащейся в бактериальной искусственной хромосоме (BAC), а также в других приложениях.
Разработка
[ редактировать ]Несмотря на то, что методы рекомбинации были разработаны на бактериях, большая часть вдохновения для методов рекомбинации возникла из методов, впервые разработанных на Saccharomyces cerevisiae. [ 2 ] где линейная плазмида использовалась для нацеливания на гены или клонирования генов с хромосомы. Кроме того, рекомбинация с одноцепочечными олигонуклеотидами (олигонуклеотидами) была впервые показана у Saccharomyces cerevisiae . [ 3 ] Было обнаружено, что рекомбинация происходит с олигонуклеотидами длиной всего 20 оснований.
Рекомбинация основана на гомологичной рекомбинации в Escherichia coli, опосредованной белками бактериофага , либо RecE/RecT из профага Rac. [ 4 ] или Redαβδ из бактериофага лямбда . [ 5 ] [ 6 ] В настоящее время наиболее часто используется система рекомбинации лямбда-реда, и первые демонстрации генной инженерии Red in vivo были независимо проведены Кенаном Мерфи. [ 7 ] и Фрэнсис Стюарт. [ 4 ] [ 5 ] Однако эксперименты Мерфи требовали экспрессии RecA, а также использовали длинные гомологичные плечи. Следовательно, последствия для новой технологии инженерии ДНК не были очевидны. Лаборатория Стюарта показала, что эти системы гомологичной рекомбинации опосредуют эффективную рекомбинацию линейных молекул ДНК, фланкированных гомологическими последовательностями длиной всего 30 пар оснований (40-50 пар оснований более эффективны), в целевые последовательности ДНК в отсутствие RecA. Теперь гомологию можно обеспечить с помощью олигонуклеотидов, изготовленных по заказу, и можно использовать стандартные хозяева для клонирования RecA , что значительно расширяет возможности рекомбинации.
Рекомбинация с дцДНК
[ редактировать ]При рекомбинировании используются линейные ДНК-субстраты, которые являются либо двухцепочечными (дцДНК), либо одноцепочечными (оцДНК). Чаще всего рекомбинирование дцДНК используется для создания замен, делеций, вставок и инверсий генов. Клонирование генов [ 6 ] [ 8 ] и мечение генов/белков (His tags и т. д., см. [ 9 ] ) тоже распространено. Для замены или делеции гена обычно кассету, кодирующую ген лекарственной устойчивости, изготавливают методом ПЦР с использованием двудольных праймеров. Эти праймеры состоят из (от 5'→3') 50 оснований, гомологичных целевой области, куда должна быть вставлена кассета, а затем 20 оснований для праймирования кассеты, устойчивой к лекарственному средству. Точная последовательность соединения окончательной конструкции определяется конструкцией праймера. [ 10 ] [ 11 ] Эти события обычно происходят с частотой примерно 10 раз. 4 /10 8 клетки, которые выживают после электропорации . Электропорация — это метод, используемый для преобразования линейного субстрата в рекомбинирующую клетку.
Техника отбора/контротбора
[ редактировать ]В некоторых случаях требуется делеция без остатка маркера, слияние генов или создание точечного мутанта в гене. Это можно сделать с помощью двух раундов рекомбинации. [ 12 ] На первом этапе рекомбинации на кассете вводится маркер селекции для замены модифицируемой области. На втором этапе второй маркер контрселекции (например, sacB) на кассете отбирается против последующего введения целевого фрагмента, содержащего желаемую модификацию. Альтернативно, целевой фрагмент может быть фланкирован сайтами loxP или FRT , которые могут быть удалены позже просто за счет экспрессии рекомбиназ Cre или FLP соответственно. Новый маркер селекции «mFabI» также был разработан для повышения эффективности рекомбинации. [ 13 ]
Рекомбинация с оцДНК
[ редактировать ]Рекомбинация с оцДНК обеспечила прорыв как в эффективности реакции, так и в простоте создания точковых мутаций. [ 1 ] Этот метод был дополнительно усовершенствован открытием того, что, избегая системы репарации метил-направленного ошибочного спаривания, частота получения рекомбинантов может быть увеличена до более чем 10 7 /10 8 жизнеспособные клетки. [ 14 ] Эта частота достаточно высока, поэтому теперь можно вносить изменения без выбора. Благодаря оптимизированным протоколам более 50% клеток, переживших электропорацию, содержат желаемые изменения. Для рекомбинации с оцДНК требуется только белок Red Beta; Экзо, Гамма и рекомбинационные белки хозяина не требуются. Поскольку белки, гомологичные Beta и RecT, обнаружены во многих бактериях и бактериофагах (более 100 по состоянию на февраль 2010 г.), рекомбинация, вероятно, будет работать во многих различных бактериях. [ 15 ] Таким образом, рекомбинация с оцДНК расширяет генетические инструменты, доступные для исследований на различных организмах. На сегодняшний день рекомбинация проведена в E. coli , S. enterica , Y. pseudotuberculosis , S. cerevisiae и M.tuberculosis . [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]
Красно-независимая рекомбинация
[ редактировать ]В 2010 году было продемонстрировано, что рекомбинация оцДНК может происходить в отсутствие известных функций рекомбинации. [ 22 ] Рекомбинанты были обнаружены в количестве до 10 4 /10 8 жизнеспособные клетки. Эта независимая от Red активность была продемонстрирована у P. syringae , E. coli , S. enterica serovar typhimurium и S. flexneria .
Применение и преимущества рекомбинации
[ редактировать ]Самым большим преимуществом рекомбинации является то, что она устраняет необходимость в удобно расположенных сайтах рестрикции , тогда как в традиционной генной инженерии модификация ДНК часто подвергается риску из-за наличия уникальных сайтов рестрикции. При создании больших конструкций размером более 100 т.п.н., таких как бактериальные искусственные хромосомы (BAC) или хромосомы, рекомбинация стала необходимостью. Рекомбинация может привести к желаемым модификациям, не оставляя после себя никаких «следов». Он также исключает несколько клонирования стадий для создания промежуточных векторов и поэтому используется для модификации конструкций ДНК в относительно короткие сроки. Требуемая гомология достаточно коротка, чтобы ее можно было получить в синтетических олигонуклеотидах, а рекомбинация с самими короткими олигонуклеотидами невероятно эффективна. Недавно рекомбинация была разработана для высокопроизводительных приложений ДНК-инженерии, называемых «конвейерами рекомбинации». [ 23 ] Конвейеры рекомбинации поддерживают крупномасштабное производство трансгенов BAC и конструкций , нацеленных на гены, для программ функциональной геномики, таких как EUCOMM (Европейский консорциум по условному мутагенезу мышей) и KOMP (Программа нокаута мышей). Рекомбинация также была автоматизирована - процесс, названный «MAGE» - мультиплексная автоматическая геномная инженерия, в лаборатории Черча. [ 24 ] С развитием технологий CRISPR создание интерференционных штаммов CRISPR в E. coli требует только одноэтапной рекомбинации олигонуклеотидов, что обеспечивает простой и легкий в реализации инструмент для контроля экспрессии генов. [ 12 ] [ 25 ] «Инструменты рекомбинации» и лабораторные протоколы также были реализованы для ряда видов растений. Эти инструменты и процедуры настраиваемы, масштабируемы и свободно доступны всем исследователям. [ 26 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Эллис Х.М., Ю. Д., ДиТизио Т., Court DL (2001). «Высокоэффективный мутагенез, репарация и инженерия хромосомной ДНК с использованием одноцепочечных олигонуклеотидов» . Труды Национальной академии наук . 98 (12): 6742–6746. Бибкод : 2001PNAS...98.6742E . дои : 10.1073/pnas.121164898 . ПМК 34423 . ПМИД 11381128 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Орр-Уивер, Т.Л., Дж.В. Шостак и др. (1983)Генетическое применение трансформации дрожжей с помощью линейных и разрывных плазмид. Методы. Энзимол. 101: 228-245.
- ^ Моершелл Р.П., Цунасава С.; и др. (1988). «Трансформация дрожжей синтетическими олигонуклеотидами» . Труды Национальной академии наук . 85 (2): 524–528. Бибкод : 1988PNAS...85..524M . дои : 10.1073/pnas.85.2.524 . ПМК 279583 . ПМИД 2829192 .
- ^ Jump up to: а б Чжан Ю., Бухгольц Ф., Мюрерс Дж.П., Стюарт А.Ф. (1998). «Новая логика инженерии ДНК с использованием рекомбинации в Escherichia coli». Природная генетика . 20 (2): 123–128. дои : 10.1038/2417 . ПМИД 9771703 . S2CID 21186444 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Jump up to: а б Мюрерс Дж. П., Чжан Ю., Теста Г., Стюарт А. Ф. (1999). «Быстрая модификация бактериальных искусственных хромосом путем ЭТ-рекомбинации» . Исследования нуклеиновых кислот . 27 (6): 1555–1557. дои : 10.1093/нар/27.6.1555 . ПМК 148353 . ПМИД 10037821 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Jump up to: а б Ю Д., Эллис Х.М.; и др. (2000). «Эффективная система рекомбинации для инженерии хромосом в Escherichia coli» . Труды Национальной академии наук . 97 (11): 5978–5983. Бибкод : 2000PNAS...97.5978Y . дои : 10.1073/pnas.100127597 . ЧВК 18544 . ПМИД 10811905 .
- ^ Мерфи КС (1998). «Использование функций рекомбинации бактериофага λ для содействия замене генов в Escherichia coli» . Журнал бактериологии . 180 (8): 2063–2071. дои : 10.1128/JB.180.8.2063-2071.1998 . ПМК 107131 . ПМИД 9555887 .
- ^ Чжан Ю., Мюрерс Дж. П., Теста Г. и Стюарт А. Ф. (2000) Клонирование ДНК путем гомологичной рекомбинации в Escherichia coli. Nature Biotechnology 18, 1314–1317.
- ^ Позер I, Саров М, Хатчинс Дж.Р., Эрише Дж.К., Тойода Ю., Позняковский А., Вейгль Д., Ницше А., Хегеманн Б., Берд А.В., Пеллетье Л., Киттлер Р., Хуа С., Науманн Р., Аугсбург М., Сикора М.М., Хофмейстер Х. , Чжан Ю., Нэсмит К., Уайт К.П., Дитцель С., Мехтлер К., Дурбин Р., Стюарт А.Ф., Питерс Дж.М., Буххольц Ф., Хайман А.А. (2008). «BAC TransgeneOmics: высокопроизводительный метод исследования функции белка у млекопитающих» . Природные методы . 5 (5): 409–15. дои : 10.1038/nmeth.1199 . ПМЦ 2871289 . ПМИД 18391959 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Савицке Дж.А., Томасон Л.К., Константино Н., Бубуненко М., Датта С., Корт Д.Л. (2007). «Рекомбинация: генная инженерия in vivo в E. coli, S. enterica и других». Передовая бактериальная генетика: использование транспозонов и фагов для геномной инженерии . Методы энзимологии. Том. 421. стр. 171–199. дои : 10.1016/S0076-6879(06)21015-2 . ISBN 9780123737496 . ПМИД 17352923 .
{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Томасон Л., Д.Л. Корт, М. Бубуненко, Н. Костантино, Х. Уилсон, С. Датта и А. Оппенгейм, (2007) Рекомбинация: Генная инженерия бактерий с использованием гомологичной рекомбинации. В: Современные протоколы молекулярной биологии. Хобокен, Нью-Джерси: John Wiley & Sons, Inc., стр. Глава 1, часть 16 стр. 11-24.
- ^ Jump up to: а б Ли, Х; Томасон, LC; Савицке, Дж. А.; Константино, Н; Суд, Д.Л. (2013). «Положительный и отрицательный отбор с использованием кассеты tetA-sacB: рекомбинация и трансдукция P1 в Escherichia coli» . Исследования нуклеиновых кислот . 41 (22): е204. дои : 10.1093/нар/gkt1075 . ПМЦ 3905872 . ПМИД 24203710 .
- ^ Новый маркер селекции для эффективного клонирования и рекомбинации ДНК в E. coli.
- ^ Константино Н., Суд Д.Л. (2003). «Повышенные уровни рекомбинантов, опосредованных λ Red, у мутантов репарации ошибочного спаривания» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 100 (26): 15748–15753. Бибкод : 2003PNAS..10015748C . дои : 10.1073/pnas.2434959100 . ПМК 307639 . ПМИД 14673109 .
- ^ Датта С., Константино Н., Чжоу К., Court DL (2008). «Идентификация и анализ функций рекомбинации грамотрицательных и грамположительных бактерий и их фагов» . Труды Национальной академии наук . 105 (5): 1626–1631. Бибкод : 2008PNAS..105.1626D . дои : 10.1073/pnas.0709089105 . ПМК 2234195 . ПМИД 18230724 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Дербис, А., Б. Лесик, Д. Даше, Дж. М. Гиго и Э. Карниел, (2003) Быстрый и простой метод инактивации хромосомных генов у иерсиний. ФЭМС Иммунол. Мед. Микробиол. 38: 113-116.
- ^ ван Кессель Дж.К., Hatfull GF (2007). «Рекомбинация микобактерий туберкулеза». Природные методы . 4 (2): 147–152. дои : 10.1038/nmeth996 . ПМИД 17179933 . S2CID 2990045 .
- ^ ван Кессель Дж.К., Hatfull GF (2008). «Микобактериальная рекомбинация». Микобактериальные протоколы . Методы молекулярной биологии. Том. 435. стр. 203–215. дои : 10.1007/978-1-4939-2450-9_10 . ISBN 978-1-4939-2449-3 . ПМИД 25779316 .
- ^ ван Кессель Дж.К., Hatfull GF (2008). «Эффективный точечный мутагенез в микобактериях с использованием рекомбинации одноцепочечной ДНК: характеристика мишеней антимикобактериальных препаратов». Молекулярная микробиология . 67 (5): 1094–1107. дои : 10.1111/j.1365-2958.2008.06109.x . ПМИД 18221264 . S2CID 12136889 .
- ^ ван Кессель Дж.К., Маринелли Л.Дж., Хэтфулл Г.Ф. (2008). «Рекомбинация микобактерий и их фагов» . Обзоры природы Микробиология . 6 (11): 851–857. дои : 10.1038/nrmicro2014 . ПМЦ 3503148 . ПМИД 18923412 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ ДиКарло Джеймс Э., Конли Эндрю Дж., Пенттиля Мерья, Янти Юсси, Ван Харрис Х., Черч Джордж М. (2013). «Дрожжевая олигоопосредованная геномная инженерия (YOGE)» . ACS Синтетическая биология . 2 (12): 741–749. дои : 10.1021/sb400117c . ПМК 4048964 . ПМИД 24160921 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Свингл Б., Маркел Э., Константино Н., Бубуненко М.Г., Картинхур С., Корт Д.Л. (2010). «Рекомбинация олигонуклеотидов у грамотрицательных бактерий» . Молекулярная микробиология . 75 (1): 138–148. дои : 10.1111/j.1365-2958.2009.06976.x . ПМЦ 3404488 . ПМИД 19943907 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Саров М., Шнайдер С., Позняковский А., Рогуев А., Эрнст С., Чжан Ю., Хайман А.А., Стюарт А.Ф. (2006). «Конвейер рекомбинации для функциональной геномики применительно к Caenorhabditis elegans» . Природные методы . 3 (10): 839–844. дои : 10.1038/nmeth933 . ПМИД 16990816 . S2CID 10658504 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Ван Х.Х., Айзекс Ф.Дж., Карр П.А., Сунь З.З., Сюй Г., Форест Ч.Р., Черч ГМ (2009). «Программирование клеток путем мультиплексной геномной инженерии и ускоренной эволюции» . Природа . 460 (7257): 894–898. Бибкод : 2009Natur.460..894W . дои : 10.1038/nature08187 . ПМК 4590770 . ПМИД 19633652 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Ли, Х; Джун, Ю; Эрикстад, М; Браун, С; Паркс, А; Суд, Д; Джун, С (2016). «tCRISPRi: настраиваемый и обратимый, одноэтапный контроль экспрессии генов» . Научные отчеты . 6 : 39096. Бибкод : 2016NatSR...639076L . дои : 10.1038/srep39076 . ПМК 5171832 . ПМИД 27996021 .
- ^ Брумос Дж., Чжао С., Гонг Ю., Сориано Д., Патель А.П., Перес-Амадор М.А., Степанова А.Н., Алонсо Ж.М. (2019). «Улучшенный набор инструментов рекомбинации для растений» . Растительная клетка . 32 (1): 100–122. дои : 10.1105/tpc.19.00431 . ПМК 6961616 . PMID 31666295 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
Внешние ссылки
[ редактировать ]- redrecombineering.ncifcrf.gov — подробная информация о рекомбинации, а также протоколы, часто задаваемые вопросы, которые можно использовать для запроса штаммов и плазмид, необходимых для рекомбинации.