ЕНУ

ЕНУ
Имена
	Предпочтительное название ИЮПАК N -Этил- N -нитрозомочевина
	Другие имена N -Этилнитрозомочевина [ нужна ссылка ] ; 1-Этил-1-нитрозомочевина ; Нитрозоэтилмочевина [ нужна ссылка ] ; N -Нитрозо- N -Этилмочевина ;
Идентификаторы
Номер CAS	759-73-9 ;
3D model ( JSmol )	Интерактивное изображение ;
Сокращения	ЕНУ [ нужна ссылка ]
Справочник Байльштейна	1761174
КЭБ	ЧЕБИ:23995 ;
ХЭМБЛ	ХЕМБЛ167667 ;
ХимическийПаук	12427 ;
Информационная карта ECHA	100.010.975
Номер ЕС	212-072-2 ;
КЕГГ	C19178 ;
ПабХим CID	12967 ;
номер РТЭКС	YT3150000 ;
НЕКОТОРЫЙ	P8M1T4190R ;
Число	2811
Панель управления CompTox ( EPA )	DTXSID8020593 ;
	показывать ИнЧИ
	показывать УЛЫБКИ
Характеристики
Химическая формула	C3H7N3OC3H7N3O2
Молярная масса	117.108 g·mol −1
войти P	0.208
Давление пара	0,00244 кПа при 25˚C
Кислотность ( pKa )	12.317
Основность (p K b )	1.680
Поглощение	ε 398 = 11,86 мМ −1 см −1
Опасности
	СГС Маркировка :
Пиктограммы
Сигнальное слово	Опасность
Заявления об опасности	Х301 , Х312 , Х332 , Х350 , Х360
Меры предосторожности	П280 , П308+П313
	Летальная доза или концентрация (LD, LC):
ЛД 50 ( средняя доза )	300 мг кг −1 (оральный, крыса)
Родственные соединения
Родственные мочевины	N -Нитрозо- N -метилмочевина ;
Родственные соединения	N -Метилформамид ; Диметилформамид ; Дейтерированный ДМФ ; Ацетиллейцин ;
	Если не указано иное, данные приведены для материалов в стандартном состоянии (при 25 °C [77 °F], 100 кПа). проверить ( что такое ?) Ссылки на инфобоксы

ЕНУ , также известный как N -этил- N - нитрозомочевина ( химическая формула C ₃ H ₇ N ₃ O ₂ ), является сильнодействующим мутагеном . Для данного гена у мышей ENU может вызвать 1 новую мутацию в каждых 700 локусах. Он также токсичен в высоких дозах.

Это химическое вещество является алкилирующим агентом и действует путем переноса этильной группы ENU на нуклеиновые основания (обычно тимин ) в нуклеиновых кислотах . Его основной мишенью являются сперматогониальные стволовые клетки , из которых зрелые сперматозоиды получаются .

Предыстория открытия ЕНУ как мутагена

Билл Рассел (1951) совершил веху в области генетики мышей , создав специально разработанную линию мышей, Т (тестовую) массу, которая использовалась в генетических скринингах для тестирования мутагенов, таких как радиация и химические вещества. Мыши Т -типа содержат 7 рецессивных жизнеспособных мутаций, влияющих на легко распознаваемые признаки. В Национальной лаборатории Ок-Ридж первоначальной целью Рассела было определить скорость наследуемых генных мутаций в зародышевой линии, вызванных радиацией. Поэтому он решил использовать мышей T -stock, чтобы определить, как часто набор локусов может мутировать под действием радиации. Поскольку мутации у мышей T -студии были рецессивными , потомство будет иметь фенотип дикого типа (в результате скрещивания мутанта [например, s / s- мутантного самца] с самкой дикого типа [ + / + ]). Таким образом, любое потомство, несущее мутацию, вызванную радиацией в одном из 7 локусов, будет проявлять мутантный фенотип уже в первом поколении. Этот подход, тест специфического локуса (SLT), позволил Расселу изучить широкий спектр специфических мутаций и рассчитать частоту мутаций, вызванных радиацией. ^{[ 3 ]}

Помимо изучения влияния радиации на СЛТ, Рассел и др. были также заинтересованы в изучении влияния химических мутагенов, таких как прокарбазин и этилнитрозомочевина, на СЛТ. В то время прокарбазин был самым мощным химическим мутагеном, который, как известно, вызывал значительный сперматогониальный мутагенез при СЛТ, хотя и со скоростью, составляющей одну треть от таковой при рентгеновском облучении. Рассела по мутагенезу Более ранние работы дрозофилы с использованием диэтилнитрозоамина (ДЭН) побудили их использовать ДЕН для SLT. Однако, чтобы стать мутагенным, ДЕН необходимо ферментативно превратить в алкилирующий агент, и, вероятно, этой ферментативной активации было недостаточно у млекопитающих. Это можно проиллюстрировать чрезвычайно низкой частотой мутаций у мышей, полученной с помощью DEN (3 на 60 179 потомков). новый мутаген, N -этил- N Чтобы преодолеть эту проблему, Эккехарт Вегель предложил использовать -нитрозомочевину (ENU), алкилирующий агент, который не требует метаболизма. Мышам, которым вводили ENU (250 мг/кг), проводили период стерильности в течение 10 недель. После выздоровления 90 самцов были скрещены в Т -поголовья и 7584 детеныша. Получено самок ^{[ 3 ]} Их результаты показали, что доза 250 мг/кг ЕНУ способна вызывать частоту мутаций в 5 раз выше, чем полученная при 600R (1R = 2,6 x 10^-4 кулонов/кг) острого рентгеновского облучения. Эта скорость также была в 15 раз выше, чем при использовании прокарбазина (600 мг/кг). ^{[ 4 ]}

Чтобы преодолеть проблему начального периода бесплодия, группа Рассела показала, что вместо инъекции одной большой дозы ЕНУ применяется дробная доза (100 мг/кг). ^{[ 5 ]} при еженедельном графике допускается общая более высокая доза (300–400 мг/кг). ^{[ 5 ]} терпеть. Это также показало, что частота мутаций увеличилась в 12 раз по сравнению с рентгеновскими лучами, в 36 раз по сравнению с прокарбазином и более чем в 200 раз по сравнению со спонтанными мутациями. Когда скорость мутаций была усреднена по всем 7 локусам, было обнаружено, что ENU вызывает мутации с частотой одна на локус на каждые 700 гамет. ^{[ 3 ]}

Краткое изложение свойств и преимуществ мутагенеза ЕНУ

ENU является алкилирующим агентом и отдает предпочтение трансверсиям оснований A->T, а также переходам AT->GC. ^{[ 6 ]} Однако также показано, что это вызывает переходы GC->AT. ^{[ 7 ]}
Известно, что он вызывает точковые мутации, а это означает, что путем картирования желаемого фенотипа исследователь может идентифицировать единственный ген-кандидат, ответственный за фенотип. ^{[ 8 ]}
Точечные мутации происходят с интервалом примерно 1-2 Мб (пара мегаоснований) и происходят с примерной частотой 1 на 700 гамет. ^{[ 3 ]}
ЕНУ нацелен на сперматогониальные стволовые клетки. ^{[ 6 ]}

**Рисунок 1:** Обзор экрана мутагенеза ЕНУ.

ЕНУ - Генетический инструмент в скрининге мутагенеза: обзор

С момента открытия Расселом и соавт. ЕНУ как наиболее мощного мутагена. он использовался в прямом (на основе фенотипа) генетическом скрининге , с помощью которого можно идентифицировать и изучить фенотип интересующий . Как показано на рисунке 1, процесс скрининга начинается с мутагенизации самца мыши с помощью ENU. За этим следует систематический фенотипический анализ потомства. Потомство оценивается на наличие поведенческих, физиологических или дисморфологических изменений. Выявлен аномальный фенотип. Затем идентификация гена-кандидата достигается путем позиционного клонирования мутантных мышей с интересующим фенотипом.

Типы экранов

ЕНУ используется в качестве генетического инструмента путем разработки различных генетических экранов, соответствующих интересам исследователей. В зависимости от оцениваемого региона прямой генетический скрининг можно классифицировать, как показано на рисунке 2, как: ^{[ 8 ]}

Скрининг конкретного региона : исследования разработаны специально для получения градиента фенотипов путем создания серии аллелей, которые полезны при изучении интересующего региона.
Полногеномный скрининг : это простые доминантные или рецессивные скрининги, которые часто полезны для понимания конкретных генетических и биохимических путей.

Экраны для конкретных регионов

Конкретные регионы можно классифицировать следующим образом:

**Рисунок 3:** Скрининг отсутствия комплементации. При скрининге отсутствия комплементации самца, индуцированного ENU, скрещивают с самкой, несущей мутантный аллель (а) интересующего гена (А). Если мутация доминантная, то она будет присутствовать в каждом поколении. Однако, если мутация рецессивная или потомство G1 нежизнеспособно, для идентификации мутации используется другая стратегия. Самца, обработанного ЕНУ, скрещивают с самкой дикого типа. Из пула особей G1 гетерозиготного самца скрещивают с самкой, несущей мутантный аллель (а). Если потомство G2 бесплодно или нежизнеспособно, его можно снова получить от самца G1.

Экраны без дополнений

Комплементация — это явление, которое позволяет генерировать фенотип дикого типа при скрещивании организмов, несущих рецессивные мутации в разных генах. ^{[ 8 ]} Таким образом, если в организме есть одна функциональная копия гена, то эта функциональная копия способна дополнить мутировавшую или утраченную копию гена. Напротив, если обе копии гена мутируют или теряются, то это приведет к аллельной некомплементации (рис. 3) и, таким образом, к проявлению фенотипа.

Феномен избыточности объясняет, что часто несколько генов способны компенсировать потерю определенного гена. Однако если два или более гена, участвующих в одних и тех же биологических процессах или путях, утрачены, это приводит к неаллельной некомплементации. При скрининге отсутствия комплементации самца, индуцированного ENU, скрещивают с самкой, несущей мутантный аллель ( а ) интересующего гена (А). Если мутация доминантная, то она будет присутствовать в каждом поколении. Однако если мутация рецессивная или потомство G ₁ нежизнеспособно, для идентификации мутации используется другая стратегия. Самца, обработанного ЕНУ, скрещивают с самкой дикого типа. Из пула особей G1 _{гетерозиготного} самца скрещивают с самкой, несущей мутантный аллель ( а ). Если потомство G2 _{бесплодно} или нежизнеспособно, его можно снова получить от _{самца G1} .

**Рисунок 4:** Скрининг делеции. На этом скрининге самцов, получавших ENU, скрещивали с гомозиготными самками для делеции интересующей области. Потомство G1 представляет собой компаунд-гетерозиготу по мутации, индуцированной ENU. Кроме того, они гаплоидны по отношению к генам в удаленной области, и, таким образом, потеря или усиление функции из-за мутации, индуцированной ENU, выражены доминантно. Таким образом, скрининг делеции имеет преимущество перед другими рецессивными скринингами за счет идентификации мутации в самом потомстве G1.

Экраны удаления

Делеции в хромосомах могут быть спонтанными или индуцированными. В этом скрининге самцов, получавших ENU, скрещивали с гомозиготными самками для удаления интересующей области. Потомство G1 _{представляет собой компаунд-гетерозиготу по мутации ,} индуцированной ENU (рис. 4). Кроме того, они гаплоидны по отношению к генам в удаленной области, и, таким образом, потеря или усиление функции из-за мутации, индуцированной ENU, выражены доминантно. Таким образом, скрининг делеции имеет преимущество перед другими рецессивными скринингами благодаря идентификации мутации в _{самом потомстве G1} .

Ринчик и др . провели скрининг делеций и анализ комплементации и смогли изолировать 11 независимых рецессивных локусов, которые были сгруппированы в семь групп комплементации на хромосоме 7, области, окружающей ген альбиноса ( Tyr ) и ген разведения розовых глаз ( p ). ^{[ 8 ]}

в. Экраны балансира

Хромосома, несущая балансирующую область, называется балансирующей хромосомой . Балансировщик — это участок, который предотвращает рекомбинацию между гомологичными хромосомами во время мейоза. Это возможно благодаря наличию инвертированной области или серии инверсий. Балансирующая хромосома в основном использовалась для исследований генетики Drosophila melanogaster . Моника Джастис и др. (2009) эффективно провели балансирующий скрининг, используя балансирующую хромосому, сконструированную Алланом Брэдли и др. на хромосоме 11 мыши. На этом скрининге самца, индуцированного ENU, скрещивают с самкой, гетерозиготной по балансирующей хромосоме. ^{[ 8 ]} Мыши, несущие балансирующую хромосому, имеют желтые уши и хвост. Гетерозиготы G ₁ (рис. 5) скрещиваются с самками, несущими мутацию rex ( Rex на рис. 5), которая дает вьющуюся шерсть. В G ₂ гомозиготы по балансиру нежизнеспособны и не восстанавливаются. Мыши, несущие трансмутацию rex к балансирующему или индуцированному ENU мутацию, имеют курчавую шерсть и отбраковываются. Мышей-мутантов ENU + мутантов-рекс отбраковывают, чтобы предотвратить рекомбинацию между этими двумя хромосомами на следующем этапе размножения, на котором образуются гомозиготные мутанты. Мышей, которые являются компаунд-гетерозиготами по балансирующему фактору и мутации, индуцированной ENU, спаривают брат-сестра для получения гомозигот по индуцированной ENU мутации в G ₃ .

Полногеномные экраны

Полногеномные скрининги чаще всего полезны для изучения генетических заболеваний, в которых могут быть задействованы множественные генетические и биохимические пути. Таким образом, с помощью этого подхода можно идентифицировать гены-кандидаты или области генома, связанные с фенотипом.

а. Обычные экраны

Эти скрининги могут быть разработаны для идентификации простых доминантных и рецессивных фенотипов. (рисунок 6). , индуцированного ENU, _{Таким образом, самца G0} скрещивают с самкой дикого типа. G1 Потомство можно подвергнуть скринингу для выявления доминантных мутаций. Однако если мутация рецессивная, то особи G3 _, гомозиготные по мутации, могут быть выделены из самцов G1 _двумя способами:

А] Самца G ₁ скрещивают с самкой дикого типа для получения пула потомства G ₂ . Особей G ₃ можно получить путем скрещивания самца G ₁ с дочерьми G ₂ . Это даст часть особей G ₃ напоминают самца G _{1 .} , которые в значительной степени
B] Самца G ₁ скрещивают с самкой дикого типа для получения пула животных G ₂ , которых затем спаривают брат-сестра для получения потомства G ₃ . Этот подход дает множество мутантов в _{потомстве G3} .

Ряд организаций по всему миру проводят полногеномный мутагенез с использованием ЕНУ. Некоторые из них включают Институт экспериментальной генетики Немецкого исследовательского центра гигиены окружающей среды (GSF), Мюнхен, Германия; Лаборатория Джексона, Мэн, США; Австралийский центр феномики Австралийского национального университета, Канберра, Австралия; кафедра нейробиологии и физиологии Северо-Западного университета, Иллинойс, США; Национальная лаборатория Ок-Ридж, Теннесси, США; Совет медицинских исследований (MRC), Харвелл, Оксфордшир, Соединенное Королевство; Отдел генетики Исследовательского института Скриппса, Калифорния, США; Центр мутагенеза мышей по дефектам развития при Медицинском колледже Бэйлора, Техас, США; и другие. ^{[ 6 ]}

б. Экраны модификаторов

Модификатор, такой как энхансер или супрессор, может изменить функцию гена. На экране модификаторов выбирается организм с уже существующим фенотипом. Таким образом, любые мутации, вызванные мутагеном (ENU), можно оценить на предмет их усиливающей или подавляющей активности. ^{[ 8 ]} Скрининг доминантных и рецессивных мутаций проводится аналогично обычному полногеномному скринингу (рис. 7). был проведен ряд скринингов модификаторов На дрозофиле . Недавно Алига и др. провели скрининг доминантных модификаторов с использованием мышей, индуцированных ENU, для идентификации модификаторов сигнального пути Notch. ^{[ 9 ]} Дельта 1 является лигандом рецептора Notch. Гомозиготная потеря функции Delta 1 ( Dll1 ^лакZ/lacZ) эмбрионально летален. Мышей, получавших ENU, скрестили с Dll1. ^lacZ гетерозиготы. было создано 35 мутантных линий, _{В G1} из которых 7 выявили модификаторы сигнального пути Notch.

Сенсибилизированные экраны

В случае генетических заболеваний с участием нескольких генов мутации в нескольких генах способствуют прогрессированию заболевания. Однако мутация только в одном из этих генов не может существенно влиять на какой-либо фенотип. Такие «предрасполагающие гены» можно идентифицировать с помощью сенсибилизированного скрининга. ^{[ 10 ]} В этом типе экрана генетический или экологический фон модифицируется, чтобы сделать мышь чувствительной к этим изменениям. Идея состоит в том, что предрасполагающие гены можно обнаружить на измененном генетическом или экологическом фоне. Ринчик и др. провели сенсибилизированный скрининг мышей-мутантов, предрасположенных к диабетической нефропатии. Мышам вводили ЕНУ на сенсибилизированном фоне диабета 1 типа. У этих мышей с диабетом была доминантная мутация акита в гене инсулина-2 ( Ins2 ^Акита). У этих мышей развилась альбуминурия — фенотип, который не наблюдался у потомков, не страдающих диабетом. ^{[ 11 ]}

Стабильность

Вообще говоря, ENU довольно нестабилен, что облегчает его инактивацию при использовании в качестве экспериментального мутагена по сравнению с умеренно более стабильными мутагенами, такими как EMS . Чистый кристаллический ЕНУ чувствителен к свету и влаге, поэтому его следует хранить в холодных и сухих условиях и при необходимости готовить в виде свежеприготовленного раствора. ^{[ 1 ]} В водных растворах ЕНУ быстро разлагается при базовом pH, и протоколы требуют инактивации растворов ЕНУ равным объемом 0,1 М КОН в течение 24 часов с воздействием окружающего света или без него для инактивации добавки. ^{[ 2 ]}

См. также

Ссылки

^ Перейти обратно: ^а ^б ^с «Н-нитрозо-N-этилмочевина» (PDF) . Отчет о канцерогенах, четырнадцатое издание . НИХС . Проверено 10 августа 2021 г.
^ Перейти обратно: ^а ^б Сэлинджер, Эндрю П.; Джастис, Моника Дж. (2008). «Мутагенез мышей с использованием N-этил-N-нитрозомочевины (ENU): Рисунок 1» . Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2008 (4). Лаборатория Колд-Спринг-Харбор: pdb.prot4985. дои : 10.1101/pdb.prot4985 . ISSN 1940-3402 . ПМИД 21356809 . S2CID 1589523 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Дэвис, А. П., Джастис М. Дж. Наследие Ок-Риджа: тест на конкретный локус и его роль в мутагенезе у мышей. Генетика 148,7-12 (1998)
^ Рассел В.Л., Келли Э.М., Хансикер П.Р., Бангэм Дж.В., Мэддукс С.С., Фиппс Э.Л. Тест специфического локуса показывает, что этилнитрозомочевина является наиболее сильным мутагеном у мышей. Учеб. Натл. акад. Sci.USA 11, 5818-5819 (1979).
^ Перейти обратно: ^а ^б Хитоцумачи С., Карпентер Д.А., Рассел В.Л. Повторение дозы увеличивает мутагенную эффективность N-этил-N-нитрозомочевины в сперматогониях мышей. Учеб. Натл. акад. Sci.USA 82, 6619-6621 (1985).
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Нолан П., Хьюгилл А. и Кокс Р.Д., 2002, стр. 278–89.
^ Когхилл, Э.Л. и др., 2002, стр.255-6.
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Кайл, BT и Hilton, DJ 2005, стр.557-67.
^ Рубио-Алиага, И. и др. Генетический скрининг модификаторов дельта1-зависимой сигнальной функции notch у мышей. Генетика 175, 1451-1463 (2007)
^ Кордес, С.П. Мутагенез N-этил-N-нитрозомочевины: посадка на экспресс-мутант мыши. Microbiol Mol Biol Rev 69, 426-439 (2005).
^ Чекнева, Э.Э. и др. Сенсибилизированный скрининг мышей, подвергшихся мутагенизации N-этил-N-нитрозомочевины, идентифицирует доминантные мутанты, предрасположенные к диабетической нефропатии. J Am Soc Nephrol 18, 103–112 (2007).

Внешние ссылки

[niehs2021-1] Перейти обратно: ^а ^б ^с «Н-нитрозо-N-этилмочевина» (PDF) . Отчет о канцерогенах, четырнадцатое издание . НИХС . Проверено 10 августа 2021 г.

[CSHP2008-2] Перейти обратно: ^а ^б Сэлинджер, Эндрю П.; Джастис, Моника Дж. (2008). «Мутагенез мышей с использованием N-этил-N-нитрозомочевины (ENU): Рисунок 1» . Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2008 (4). Лаборатория Колд-Спринг-Харбор: pdb.prot4985. дои : 10.1101/pdb.prot4985 . ISSN 1940-3402 . ПМИД 21356809 . S2CID 1589523 .

[davis-3] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Дэвис, А. П., Джастис М. Дж. Наследие Ок-Риджа: тест на конкретный локус и его роль в мутагенезе у мышей. Генетика 148,7-12 (1998)

[russell-4] Рассел В.Л., Келли Э.М., Хансикер П.Р., Бангэм Дж.В., Мэддукс С.С., Фиппс Э.Л. Тест специфического локуса показывает, что этилнитрозомочевина является наиболее сильным мутагеном у мышей. Учеб. Натл. акад. Sci.USA 11, 5818-5819 (1979).

[russell2-5] Перейти обратно: ^а ^б Хитоцумачи С., Карпентер Д.А., Рассел В.Л. Повторение дозы увеличивает мутагенную эффективность N-этил-N-нитрозомочевины в сперматогониях мышей. Учеб. Натл. акад. Sci.USA 82, 6619-6621 (1985).

[nolan-6] Перейти обратно: ^а ^б ^с Нолан П., Хьюгилл А. и Кокс Р.Д., 2002, стр. 278–89.

[coghill-7] Когхилл, Э.Л. и др., 2002, стр.255-6.

[kile-8] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Кайл, BT и Hilton, DJ 2005, стр.557-67.

[9] Рубио-Алиага, И. и др. Генетический скрининг модификаторов дельта1-зависимой сигнальной функции notch у мышей. Генетика 175, 1451-1463 (2007)

[10] Кордес, С.П. Мутагенез N-этил-N-нитрозомочевины: посадка на экспресс-мутант мыши. Microbiol Mol Biol Rev 69, 426-439 (2005).

[11] Чекнева, Э.Э. и др. Сенсибилизированный скрининг мышей, подвергшихся мутагенизации N-этил-N-нитрозомочевины, идентифицирует доминантные мутанты, предрасположенные к диабетической нефропатии. J Am Soc Nephrol 18, 103–112 (2007).

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]