Генетический экран
Генетический экран или экран мутагенеза — это экспериментальный метод, используемый для идентификации и отбора лиц, обладающих фенотипом в мутагенизированной популяции. интересующим [ 1 ] Следовательно, генетический экран является разновидностью фенотипического экрана . Генетический скрининг может предоставить важную информацию о функции генов , а также о молекулярных событиях, которые лежат в основе биологических процессов или путей. Хотя геномные проекты выявили обширный перечень генов у многих различных организмов, генетический скрининг может дать ценную информацию о том, как функционируют эти гены. [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]
Базовый скрининг
[ редактировать ]Прямая генетика (или прямой генетический скрининг) начинается с фенотипа, а затем пытается идентифицировать причинную мутацию и, следовательно, ген(ы), ответственные за фенотип. Например, знаменитый экран Кристианы Нюсляйн-Фольхард и Эрика Вишауса мутагенизировал дрозофил, а затем решил найти гены, вызывающие наблюдаемые мутантные фенотипы. [ 7 ]
Успешный прямой генетический скрининг часто требует определенного генетического фона и простой экспериментальной процедуры. То есть, когда несколько особей подвергаются мутагенизации, они должны быть генетически идентичны, чтобы их фенотип дикого типа также был идентичен, а мутантные фенотипы было легче идентифицировать. Простой метод скрининга позволяет обследовать большее количество людей, тем самым увеличивая вероятность создания и идентификации представляющих интерес мутантов. [ 3 ]
Поскольку естественные аллельные мутации редки, до скрининга генетики часто мутагенизируют популяцию людей, подвергая их воздействию известного мутагена , такого как химическое вещество или радиация, тем самым генерируя гораздо более высокую частоту хромосомных мутаций . [ 1 ] В некоторых организмах мутагены используются для проведения скрининга насыщения , то есть скрининга, используемого для выявления всех генов, участвующих в определенном фенотипе. Кристиан Нюсляйн-Фольхард и Эрик Вишаус были первыми, кто провел процедуру такого рода скрининга на животных. [ 8 ]
Обратная генетика (или обратный генетический скрининг) начинается с известного гена и оценивает эффект его разрушения путем анализа полученных фенотипов. Например, при нокаут-скрининге один или несколько генов полностью удаляются, а делеционные мутанты проверяются на фенотипы. Такие скрининги были проведены для всех генов многих бактерий и даже сложных организмов, таких как C. elegans . [ 1 ] Обратный генетический скрининг обычно начинается с определения последовательности генов, за которой следует целенаправленная инактивация. [ 9 ] Более того, он вызывает мутации в модельных организмах, чтобы узнать их роль в заболевании. [ 10 ] Обратная генетика также используется для получения чрезвычайно точной статистики мутаций, происходящих в определенных генах. С помощью этих экранов вы можете определить, насколько случайны мутации и как часто они происходят. [ 11 ]
Варианты скрининга
[ редактировать ]Было разработано множество вариантов скрининга для выяснения гена, который приводит к интересующему мутантному фенотипу.
Усилитель
[ редактировать ]начинается Скрининг энхансеров с мутантного индивидуума, у которого есть интересующий процесс с известной мутацией гена. Затем скрининг можно использовать для идентификации дополнительных генов или генных мутаций, которые играют роль в этом биологическом или физиологическом процессе. Скрининг генетических энхансеров выявляет мутации, которые усиливают интересующий фенотип у уже мутантного человека. Фенотип двойного мутанта (человека, имеющего как энхансер, так и исходную фоновую мутацию) более выражен, чем любой из фенотипов одиночного мутанта. Усиление должно превосходить ожидаемые фенотипы двух мутаций сами по себе, и поэтому каждая мутация может рассматриваться как усилитель другой. Выделение мутантов-энхансеров может привести к идентификации взаимодействующих генов или генов, которые действуют избыточно по отношению друг к другу. [ 12 ]
Подавитель
[ редактировать ]Скрининг супрессора используется для выявления супрессорных мутаций , которые облегчают или возвращают фенотип исходной мутации в процессе, определяемом как синтетическая жизнеспособность . [ 13 ] Супрессорные мутации можно охарактеризовать как вторые мутации в участке хромосомы, отличном от изучаемой мутации, которые подавляют фенотип исходной мутации. [ 14 ] Если мутация происходит в том же гене, что и исходная мутация, она называется внутригенной супрессией , тогда как мутация, локализованная в другом гене, называется экстрагенной супрессией или межгенной супрессией . [ 1 ] Мутации-супрессоры чрезвычайно полезны для определения функций биохимических путей внутри клетки и взаимоотношений между различными биохимическими путями.
Чувствителен к температуре
[ редактировать ]Термочувствительный скрининг включает в себя температурные сдвиги для усиления мутантного фенотипа. Популяция, выращенная при низких температурах, будет иметь нормальный фенотип; однако мутация в конкретном гене сделает его нестабильным при более высокой температуре. Например, проверка на температурную чувствительность у плодовых мух может включать повышение температуры в клетке до тех пор, пока некоторые мухи не упадут в обморок, а затем открытие портала, позволяющего остальным уйти. Лица, отобранные в ходе скрининга, могут нести необычную версию гена, участвующего в интересующем фенотипе. Преимущество аллелей, обнаруженных в этом типе скрининга, состоит в том, что мутантный фенотип условен и может быть активирован простым повышением температуры. Нулевая мутация в таком гене может быть летальной для эмбриона, и такие мутанты будут пропущены при базовом скрининге. Знаменитый термочувствительный скрининг был независимо проведен Ли Хартвеллом и Полом Нерсом для выявления мутантов с дефектами клеточного цикла у S. cerevisiae. и S. pombe соответственно.
РНКи
[ редактировать ]
Скрининг РНК-интерференции (РНКи) по сути представляет собой прямой генетический скрининг с использованием метода обратной генетики. Подобно классическим генетическим скринингам прошлого, успех крупномасштабных исследований RNAi зависит от тщательной разработки фенотипических анализов и их интерпретации. [ 9 ] У дрозофилы РНКи применялась в культивируемых клетках или in vivo для исследования функций генов и воздействия на функцию отдельных генов в масштабе всего генома. RNAi используется для подавления экспрессии генов у дрозофилы путем инъекции дсРНК в ранние эмбрионы и воздействия на гены Frizzled и Frizzled2, создавая дефекты в формировании эмбрионального паттерна, которые имитируют потерю функции бескрылости. [ 15 ]
КРИСПР
[ редактировать ]
CRISPR/Cas в основном используется для обратного генетического скрининга. CRISPR имеет возможность создавать библиотеки тысяч точных генетических мутаций и может идентифицировать новые опухоли, а также проверять старые опухоли в исследованиях рака. Библиотека геномного нокаута CRISPR-Cas9 (GeCKO), нацеленная на 18 080 генов с 64 751 уникальной направляющей последовательностью, идентифицирует гены, необходимые для жизнеспособности клеток при раке. Бактериальная система CRISPR-Cas9 для конструирования мутаций потери функции (LOF) и усиления функции (GOF) в нетрансформированных органоидах кишечника человека с целью демонстрации модели колоректального рака (CRC) . Его также можно использовать для изучения функциональных последствий мутаций in vivo, позволяя осуществлять прямое редактирование генома соматических клеток. [ 10 ]
Картирование мутантов
[ редактировать ]Используя подход классической генетики , исследователь должен затем найти (нанести на карту) ген на его хромосоме путем скрещивания с особями, несущими другие необычные признаки , и собрать статистику о том, как часто эти два признака наследуются вместе. Классические генетики использовали бы фенотипические признаки для картирования новых мутантных аллелей . С появлением геномных последовательностей модельных систем, таких как Drosophila melanogaster , Arabidopsis thaliana и C. elegans, множество однонуклеотидных полиморфизмов теперь идентифицировано (SNP), которые можно использовать в качестве признаков для картирования. Фактически, Гейдельбергский экран , позволяющий массовое тестирование мутантов и разработанный в 1980 году Нюсляйн-Фольхардом и Вишаусом , расчистил путь будущим учёным в этой области. [ 4 ] SNP являются предпочтительными признаками для картирования, поскольку они очень часты, порядка одной разницы на 1000 пар оснований, между различными видами организмов. Мутагены, такие как случайные вставки ДНК путем трансформации или активные транспозоны, также могут использоваться для создания новых мутантов. Преимущество этих методов состоит в том, что они помечают новые аллели известным молекулярным маркером (ДНК), что может облегчить быструю идентификацию гена. [ 8 ]
Позиционное клонирование
[ редактировать ]Позиционное клонирование — это метод идентификации генов, при котором ген определенного фенотипа идентифицируется только по его приблизительному хромосомному расположению (но не по функции); это известно как регион-кандидат . Первоначально область-кандидат может быть определена с использованием таких методов, как анализ сцепления , а затем используется позиционное клонирование для сужения области-кандидата до тех пор, пока не будут обнаружены ген и его мутации. Позиционное клонирование обычно включает выделение частично перекрывающихся сегментов ДНК из геномных библиотек для продвижения по хромосоме к определенному гену. В ходе позиционного клонирования необходимо определить, является ли рассматриваемый в данный момент сегмент ДНК частью гена.
Тесты, используемые для этой цели, включают межвидовую гибридизацию, идентификацию неметилированных CpG-островков , захват экзонов , прямой отбор кДНК , компьютерный анализ последовательности ДНК, скрининг мутаций у пораженных людей и тесты экспрессии генов. Для геномов, в которых известны области генетического полиморфизма , позиционное клонирование включает идентификацию полиморфизмов, фланкирующих мутацию. Этот процесс требует, чтобы фрагменты ДНК ближайшего известного генетического маркера постепенно клонировались и секвенировались, приближаясь к мутантному аллелю с каждым новым клоном. Этот процесс создает контиг-карту локуса хромосомам и известен как ходьба по . С завершением проектов секвенирования генома, таких как проект «Геном человека» , современное позиционное клонирование может напрямую использовать готовые контиги из баз данных последовательностей генома.
Для каждого нового клона ДНК идентифицируют полиморфизм и тестируют его в картирующей популяции на предмет частоты его рекомбинации по сравнению с мутантным фенотипом. Когда клон ДНК находится на уровне мутантного аллеля или близко к нему, частота рекомбинации должна быть близка к нулю. Если блуждание по хромосоме продолжится через мутантный аллель, новые полиморфизмы начнут демонстрировать увеличение частоты рекомбинации по сравнению с мутантным фенотипом. В зависимости от размера картируемой популяции мутантный аллель может быть сужен до небольшой области (<30 КБ). сравнение последовательностей ДНК дикого типа и мутантной Затем необходимо ДНК в этом регионе, чтобы определить местонахождение мутации ДНК , которая вызывает фенотипическое различие.
Современное позиционное клонирование позволяет более напрямую извлекать информацию из проектов геномного секвенирования и существующих данных путем анализа генов в регионе-кандидате. Затем можно будет расставить приоритеты генам потенциальных заболеваний из региона-кандидата, что потенциально сократит объем необходимой работы. Приоритетными кандидатами являются гены, паттерны экспрессии которых соответствуют фенотипу заболевания, демонстрируют (предполагаемую) функцию, связанную с фенотипом, или гомологичны другому гену, связанному с фенотипом. Такое обобщение методов позиционного клонирования также известно как открытие позиционных генов.
Позиционное клонирование является эффективным методом беспристрастной изоляции генов заболеваний и используется для идентификации генов заболеваний при мышечной дистрофии Дюшенна , болезни Хантингтона и муковисцидозе . Однако осложнения при анализе возникают, если заболевание демонстрирует локус-гетерогенность.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б с д Хартвелл Л.Х., Худ Л., Голдберг М.Л., Рейнольдс А.Е., Сильвер Л.М., Верес Р.К. (2008). Генетика: от генов к геномам . Бостон: Высшее образование Макгроу-Хилла. ISBN 978-0-07-284846-5 .
- ^ Паттон Э.Э., Зон Л.И. (декабрь 2001 г.). «Искусство и дизайн генетических экранов: рыбки данио». Обзоры природы. Генетика . 2 (12): 956–966. дои : 10.1038/35103567 . ПМИД 11733748 . S2CID 3166016 .
- ^ Перейти обратно: а б Пейдж Д.Р., Гроссниклаус У. (февраль 2002 г.). «Искусство и дизайн генетических экранов: Arabidopsis thaliana». Обзоры природы. Генетика . 3 (2): 124–136. дои : 10.1038/nrg730 . ПМИД 11836506 . S2CID 431110 .
- ^ Перейти обратно: а б Сент-Джонстон Д. (март 2002 г.). «Искусство и дизайн генетических экранов: Drosophila melanogaster». Обзоры природы. Генетика . 3 (3): 176–188. дои : 10.1038/nrg751 . ПМИД 11972155 . S2CID 195368351 .
- ^ Йоргенсен Э.М., Манго С.Э. (май 2002 г.). «Искусство и дизайн генетических экранов: caenorhabditis elegans». Обзоры природы. Генетика . 3 (5): 356–369. дои : 10.1038/nrg794 . ПМИД 11988761 . S2CID 152517 .
- ^ Касселтон Л., Золан М. (сентябрь 2002 г.). «Искусство и дизайн генетических экранов: нитчатые грибы». Обзоры природы. Генетика . 3 (9): 683–697. дои : 10.1038/nrg889 . ПМИД 12209143 . S2CID 11744977 .
- ^ Нюсляйн-Фольхард С., Вишаус Е (октябрь 1980 г.). «Мутации, влияющие на количество и полярность сегментов у дрозофилы». Природа . 287 (5785): 795–801. Бибкод : 1980Natur.287..795N . дои : 10.1038/287795a0 . ПМИД 6776413 . S2CID 4337658 .
- ^ Перейти обратно: а б «Генетический экран» . Исследование стволовых клеток. Архивировано из оригинала 1 апреля 2012 г. Проверено 3 мая 2012 г.
- ^ Перейти обратно: а б Бутрос М., Арингер Дж. (июль 2008 г.). «Искусство и дизайн генетических экранов: РНК-интерференция». Обзоры природы. Генетика . 9 (7): 554–566. дои : 10.1038/nrg2364 . ПМИД 18521077 . S2CID 12787125 .
- ^ Перейти обратно: а б Гурумурти CB, Грати М, Оцука М, Шилит С.Л., Квадрос РМ, Лю XZ (сентябрь 2016 г.). «CRISPR: универсальный инструмент для прямых и обратных генетических исследований» . Генетика человека . 135 (9): 971–976. дои : 10.1007/s00439-016-1704-4 . ПМК 5002245 . ПМИД 27384229 .
- ^ Грин Е.А., Кодомо К.А., Тейлор Н.Е., Хеникофф Дж.Г., Тилль Б.Дж., Рейнольдс С.Х. и др. (июнь 2003 г.). «Спектр химически индуцированных мутаций в результате крупномасштабного обратного генетического скрининга арабидопсиса» . Генетика . 164 (2): 731–740. дои : 10.1093/генетика/164.2.731 . ПМЦ 1462604 . ПМИД 12807792 .
- ^ Герман Р.К., Йохем Дж. (сентябрь 2005 г.). «Генетические усилители» . Червячная книга : 1–11. дои : 10.1895/wormbook.1.27.1 . ПМК 4780930 . ПМИД 18023119 .
- ^ Пудду Ф., Ольшлегель Т., Герини И., Гейслер Н.Дж., Ниу Х., Херцог М. и др. (июнь 2015 г.). «Геномный скрининг синтетической жизнеспособности определяет функцию Sae2 в репарации ДНК» . Журнал ЭМБО . 34 (11): 1509–1522. дои : 10.15252/embj.201590973 . ПМЦ 4474527 . ПМИД 25899817 .
- ^ Ходжкин Дж. (декабрь 2005 г.). «Генетическое подавление» . Червячная книга : 1–13. дои : 10.1895/wormbook.1.59.1 . ПМК 4781008 . ПМИД 18023120 .
- ^ Хейгвер Ф, Порт Ф, Бутрос М (март 2018 г.). «Скрининг РНК-интерференции (РНКи) у дрозофилы » . Генетика . 208 (3): 853–874. doi : 10.1534/genetics.117.300077 . ПМЦ 5844339 . ПМИД 29487145 .