Кас12а
| CRISPR-ассоциированный белок 12а | |
|---|---|
 | |
| Идентификаторы | |
| Символ | Кас12а |
| ИнтерПро | ИПР027620 |
| Часть серии о |
| КРИСПР |
|---|
| Редактирование генома : CRISPR-Cas |
|
варианты: Анти-CRISPR - CIRTS - CRISPeYCRISPR-Cas10 - CRISPR-Cas13 - CRISPR-BEST CRISPR-Disp - CRISPR-Gold - CRISPRa - CRISPRi Easi-CRISPR – СДЕЛАЙТЕ ЭТО |
| Фермент |
|
Cas9 - FokI - EcoRI - PstI - SmaI HaeIII – Cas12a (Cpf1) – xCas9 |
| Приложения |
| КАМЕРА - ICE - Направленная генетика |
| другой метод редактирования генома: |
| Прайм монтаж - Pro-AG - RESCUE - TALEN - ZFN - LEAPER |
Cas12a ( C RISPR как ассоциированный белок 12a , ранее известный как Cpf1 ) представляет собой подтип белков Cas12 и РНК-ориентируемую эндонуклеазу , которая является частью системы CRISPR у некоторых бактерий и архей . Он возникает как часть бактериального иммунного механизма , где он служит для разрушения генетического материала вирусов и, таким образом, защиты клетки и колонии от вирусной инфекции. Cas12a и другие CRISPR-ассоциированные эндонуклеазы используют РНК (называемую crRNA в случае Cas12a) для нацеливания нуклеиновой кислоты в специфическую и программируемую материю. В организмах, из которых она происходит, эта направляющая РНК представляет собой копию фрагмента чужеродной нуклеиновой кислоты (т.е. фага ), ранее инфицированной клетки. [1]
Он представляет интерес для исследователей, поскольку его можно использовать для целенаправленных модификаций ДНК или РНК , аналогично более известной системе CRISPR- Cas9 . [2] Cas12a отличается от Cas9 своим единственным активным сайтом эндонуклеазы RuvC 5'- , предпочтением мотива, примыкающего к протоспейсеру , а также созданием липких, а не тупых концов в месте разреза. Эти и другие различия могут сделать его более подходящим для определенных приложений. Помимо использования в фундаментальных исследованиях , CRISPR-Cas12a может найти применение в лечении генетических заболеваний и реализации генных драйвов . [2]
Описание
[ редактировать ]Открытие
[ редактировать ]CRISPR-Cas12a был обнаружен в результате поиска в опубликованной базе данных бактериальных генетических последовательностей многообещающих участков ДНК. Его идентификация с помощью биоинформатики как белка системы CRISPR, его наименование и скрытая марковская модель (HMM) для его обнаружения были представлены в 2012 году в выпуске TIGRFAMs базы данных семейств белков . Cas12a появляется у многих видов бактерий. Последняя эндонуклеаза Cas12a, которая была разработана в качестве инструмента для редактирования генома, была взята у одного из первых 16 видов, о которых известно, что она является носителем. [3] Два фермента-кандидата из Acidaminococcus и Lachnospiraceae проявляют эффективную активность по редактированию генома в клетках человека. [2]
Уменьшенная версия Cas9 из бактерии Staphylococcus aureus является потенциальной альтернативой Cas12a. [3]
Классификация
[ редактировать ]Системы CRISPR-Cas разделены на два класса: класс 1 использует несколько белков Cas вместе с РНК CRISPR (crRNA) для создания функциональной эндонуклеазы, тогда как системы CRISPR класса 2 используют только один белок Cas с crРНК. Согласно этой классификации Cas12a был идентифицирован как система CRISPR-Cas класса II, типа V, содержащая белок из 1300 аминокислот. [4]
Имя
[ редактировать ]CRISPR ( Clustered в Regularly Interspaced Repeats . Short Palindromic ) назван в честь нацеливании особенностей инвариантных последовательностей ДНК, участвующих Cas12a первоначально был известен как Cpf1 как аббревиатура CRISPR и двух родов бактерий, в которых он встречается: Prevotella и Francesella . Он был переименован в 2015 году после более широкой рационализации названий белков Cas ( C RISPR как ассоциированных) с целью соответствия их гомологии последовательностей . [4]
Структура
[ редактировать ]Локус Cas12a содержит смешанный альфа / бета- домен, RuvC-I, за которым следует спиральная область, RuvC-II и домен, подобный цинковому пальцу . [5] Белок Cas12a имеет RuvC -подобный эндонуклеазный домен, который подобен домену RuvC Cas9. Более того, Cas12a не имеет эндонуклеазного домена HNH, а N-конец Cas12a не имеет альфа-спиральной доли узнавания Cas9. [4]
Архитектура домена Cas12a CRISPR-Cas показывает, что Cas12a функционально уникален и классифицируется как система CRISPR класса 2, типа V. Локусы Cas12a кодируют Cas1 , Cas2 и Cas4, белки более сходные с системами типа I и III, чем с системами типа II. Поиск в базе данных позволяет предположить наличие белков семейства Cas12a у многих видов бактерий. [4]
Функциональному Cas12a не нужна tracrRNA , поэтому требуется только crRNA. Это приносит пользу редактированию генома, поскольку Cas12a не только меньше Cas9, но также имеет меньшую молекулу sgRNA (примерно вдвое меньше нуклеотидов , чем Cas9). [6]
Комплекс Cas12a-crRNA расщепляет целевую ДНК или РНК путем идентификации мотива, примыкающего к протоспейсеру (PAM) 5'-YTN-3' [7] (где «Y» — пиримидин [8] и «N» представляет собой любое азотистое основание ), в отличие от G-богатого PAM, на который нацелен Cas9. После идентификации PAM Cas12a вводит двухцепочечный разрыв ДНК, подобный липкому концу, на 4 или 5 выступающих нуклеотидов. [5]
Механизм
[ редактировать ]
Система CRISPR-Cas12a состоит из фермента Cas12a и направляющей РНК, которая находит и позиционирует комплекс в нужном месте двойной спирали для расщепления целевой ДНК. Активность системы CRISPR-Cas12a имеет три стадии: [3]
- Адаптация: белки Cas1 и Cas2 облегчают адаптацию небольших фрагментов ДНК в массив CRISPR.
- Формирование crРНК: процессинг пре-crРНК с образованием зрелых crРНК для управления белком Cas.
- Вмешательство: Cas12a связывается с crRNA с образованием бинарного комплекса для идентификации и расщепления целевой последовательности ДНК. Комплекс crRNA-Cas12a ищет в дцДНК 3-6нтный 5'- протоспейсерный мотив (PAM). Как только PAM обнаружен, белок локально денатурирует дцДНК и ищет комплементарность между спейсером crRNA и протоспейсером оцДНК. Достаточная комплементарность запускает активность RuvC, и активный сайт RuvC затем разрезает нецелевую цепь, а затем целевую цепь, в конечном итоге создавая шахматный разрыв дцДНК с выступающими 5'-оцДНК (цис-расщепление). [5] [9]
Cas9 против Cas12a
[ редактировать ]
Cas9 требуется две молекулы РНК для разрезания ДНК, а Cas12a — одна. Белки также разрезают ДНК в разных местах, предоставляя исследователям больше возможностей при выборе места редактирования. Cas9 разрезает обе цепи молекулы ДНК в одном и том же положении, оставляя после себя тупые концы . Cas12a оставляет одну прядь длиннее другой, создавая липкие концы . Липкие концы обладают свойствами, отличными от тупых концов во время негомологичного соединения концов или гомологичной репарации ДНК, что дает Cas12a определенные преимущества при попытках вставки генов по сравнению с Cas9. [3] Хотя система CRISPR-Cas9 может эффективно отключать гены, вставить гены или создать нокаут сложно. [1] Cas12a не имеет tracrRNA , использует Т-богатый PAM и расщепляет ДНК через шахматный DSB ДНК. [6]
Таким образом, важные различия между системами Cas12a и Cas9 заключаются в том, что Cas12a: [10]
- Распознает различные PAM, открывая новые возможности таргетинга.
- Создает длинные липкие концы длиной 4–5 нт вместо тупых концов, производимых Cas9, повышая эффективность генетических вставок и специфичность во время NHEJ или HDR.
- Разрезает целевую ДНК дальше от PAM, дальше от места разреза Cas9, открывая новые возможности для расщепления ДНК.
| Особенность | Красный9 | Кас12а |
|---|---|---|
| Структура | Требуются две РНК (или 1 слитый транскрипт (crRNA+tracrRNA=sgRNA) | Требуется одна crRNA |
| Режущий механизм | Тупые концы срезов | Ступенчатые торцевые срезы |
| Место резки | Ближе к месту узнавания | Дистально от места узнавания |
| Целевые сайты | G-богатый PAM | Т-богатый ПАМ |
Источник
[ редактировать ]Эндонуклеазы Cas12, вероятно, в конечном итоге произошли от эндонуклеазы TnpB транспозонов семейства IS200/IS605. TnpB , еще не «прирученные» к иммунной системе CRISPR, сами способны выполнять расщепление под контролем РНК с использованием матричной системы OmegaRNA . [11]
Инструменты
[ редактировать ]При использовании CRISPR на целевую эффективность и специфичность влияют множество аспектов, включая дизайн направляющей РНК. множество моделей проектирования и программных инструментов CRISPR-Cas Разработано для оптимального проектирования направляющей РНК. К ним относятся конструктор SgRNA, CRISPR MultiTargeter, SSFinder. [12] Кроме того, доступны коммерческие антитела для обнаружения белка Cas12a. [13]
Интеллектуальная собственность
[ редактировать ]CRISPR-Cas9 является предметом споров об интеллектуальной собственности , тогда как CRISPR-Cas12a не имеет тех же проблем. [2]
Примечания
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б «Генная инженерия на основе CRISPR получает успех» . Новости метанауки . 29 сентября 2015 г. Архивировано из оригинала 22 октября 2017 г. Проверено 3 мая 2016 г.
- ^ Перейти обратно: а б с д «Даже CRISPR» . Экономист . ISSN 0013-0613 . Проверено 3 мая 2016 г.
- ^ Перейти обратно: а б с д Ледфорд Х (октябрь 2015 г.). «Бактерии создают новый генный резак» . Природа . 526 (7571): 17. doi : 10.1038/nature.2015.18432 . ПМИД 26432219 .
- ^ Перейти обратно: а б с д Макарова К.С., Вольф Ю.И., Алхнбаши О.С., Коста Ф., Шах С.А., Сондерс С.Дж. и др. (ноябрь 2015 г.). «Обновленная эволюционная классификация систем CRISPR-Cas» . Обзоры природы. Микробиология . 13 (11): 722–736. дои : 10.1038/nrmicro3569 . ПМК 5426118 . ПМИД 26411297 .
- ^ Перейти обратно: а б с Зетше Б., Гутенберг Дж.С., Абудайе О.О., Слеймейкер И.М., Макарова К.С., Эсслетцбихлер П. и др. (октябрь 2015 г.). «Cpf1 представляет собой единственную РНК-ориентированную эндонуклеазу системы CRISPR-Cas класса 2» . Клетка . 163 (3): 759–771. дои : 10.1016/j.cell.2015.09.038 . ПМЦ 4638220 . ПМИД 26422227 .
- ^ Перейти обратно: а б «Cpf1 переходит на Cas9 для редактирования генома CRISPR следующего поколения» . epigenie.com . 29 сентября 2015 года . Проверено 3 мая 2016 г.
- ^ Фонфара И, Рихтер Х, Братович М, Ле Рун А, Шарпантье Э (апрель 2016 г.). «Связанный с CRISPR фермент, расщепляющий ДНК Cpf1, также обрабатывает РНК-предшественник CRISPR». Природа . 532 (7600): 517–521. Бибкод : 2016Natur.532..517F . дои : 10.1038/nature17945 . ПМИД 27096362 . S2CID 2271552 .
- ^ «Нуклеотидные коды, коды аминокислот и генетические коды» . KEGG: Киотская энциклопедия генов и геномов. 15 июля 2014 года . Проверено 25 мая 2016 г.
- ^ Кофски Дж.С., Карандур Д., Хуанг С.Дж., Витте И.П., Куриян Дж., Дудна Дж.А. (июнь 2020 г.). «CRISPR-Cas12a использует асимметрию R-петли для образования двухцепочечных разрывов» . электронная жизнь . 9 . doi : 10.7554/eLife.55143 . ПМЦ 7286691 . ПМИД 32519675 .
- ^ Ямано Т., Нишимасу Х., Зетше Б., Хирано Х., Слеймейкер И.М., Ли Ю. и др. (май 2016 г.). «Кристаллическая структура Cpf1 в комплексе с направляющей РНК и целевой ДНК» . Клетка . 165 (4): 949–962. дои : 10.1016/j.cell.2016.04.003 . ПМЦ 4899970 . ПМИД 27114038 .
- ^ Алтае-Тран Х., Каннан С., Демирджиоглу Ф.Е., Оширо Р., Нети С.П., Маккей Л.Дж. и др. (октябрь 2021 г.). «Распространенное семейство транспозонов IS200/IS605 кодирует разнообразные программируемые РНК-ориентированные эндонуклеазы» . Наука . 374 (6563): 57–65. Бибкод : 2021Sci...374...57A . дои : 10.1126/science.abj6856 . ПМЦ 8929163 . ПМИД 34591643 .
- ^ Грэм Д.Б., Root DE (ноябрь 2015 г.). «Ресурсы для разработки экспериментов по редактированию генов CRISPR» . Геномная биология . 16 : 260. дои : 10.1186/s13059-015-0823-x . ПМК 4661947 . ПМИД 26612492 .
- ^ «Антитело против CPF1 (GTX133301) | GeneTex» . www.genetex.com . Проверено 30 октября 2020 г.