ШЛЯПА средняя

Среда HAT ( гипоксантин - аминоптерин - тимидин среда ) представляет собой селективную среду для культуры клеток млекопитающих, в основе которой лежит комбинация аминоптерина , препарата, который действует как мощный ингибитор метаболизма фолатов путем ингибирования дигидрофолатредуктазы , с гипоксантином ( производным пурина ) и тимидин (дезоксинуклеозид ) , который является промежуточным продуктом синтеза ДНК . Хитрость в том, что аминоптерин блокирует ДНК de novo синтез , который абсолютно необходим для продолжения деления клеток , но гипоксантин и тимидин обеспечивают клетки сырьем для обхода блокировки («путь спасения»), при условии, что у них есть нужные ферменты. , что означает наличие функционирующих копий генов , которые их кодируют.

Фермент дигидрофолатредуктаза , который производит тетрагидрофолат (ТГФ) путем восстановления дигидрофолата, специфически блокируется аминоптерином. ТГФ, действуя совместно со специфическими белками , может получать отдельные углеродные единицы, которые затем передаются к конкретным мишеням.

Одной из важных мишеней клеточного воспроизводства является тимидилатсинтаза , которая создает тимидинмонофосфат (ТМФ) из дезоксиуридинмонофосфата (дУМФ). Путем дополнительных реакций фосфорилирования ТМП можно использовать для получения тимидинтрифосфата (ТТР), одного из четырех предшественников нуклеотидов, которые используются ДНК-полимеразами для создания ДНК . Без ТГФ, необходимого для преобразования dUMP, не может быть TTP, и синтез ДНК не может продолжаться, если TMP не может быть получен из другого источника. Альтернативным источником является тимидин, присутствующий в среде HAT, который может поглощаться клетками и фосфорилироваться тимидинкиназой (ТК) в ТМП.

Синтез ИМФ (предшественника ГМФ и ГТФ, а также АМФ и АТФ) также требует ТГФ, и его также можно обойти. В этом случае гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT) реагирует с гипоксантином, абсорбированным из среды, с PRPP , высвобождая пирофосфат , с образованием IMP по пути спасения.

Следовательно, использование среды HAT для культуры клеток является формой искусственного отбора клеток, содержащих рабочие ТЗ и HGPRT. Многие полезные усовершенствования схемы стали возможными благодаря ядам, которые убивают клетки, но к которым они невосприимчивы, если у них отсутствует один из этих генов. Таким образом, клетка, лишенная ТК, устойчива к бромдезоксиуридину (BrdU), а клетка, лишенная HGPRT, устойчива к 6-тиогуанину (6-ТГ) и 8-азагуанину . Таким образом, селекция с использованием одного из двух последних препаратов с последующей средой HAT приведет к образованию ревертантных колоний. ^{[ 1 ]}

Приложения

Среду HAT используют для приготовления моноклональных антител . Этот процесс называется гибридомной технологией . Лабораторные животные (например, мыши) сначала подвергаются воздействию антигена , против которого мы заинтересованы в выделении антитела . После выделения спленоцитов у млекопитающего В-клетки сливают с HGPRT-отрицательными иммортализованными миеломы клетками с использованием полиэтиленгликоля или вируса Сендай . Слитые клетки инкубируют в среде HAT . Аминоптерин в среде блокирует путь de novo . Следовательно, неслитые клетки миеломы погибают, поскольку они не могут производить нуклеотиды de novo или путем спасения. Неслитые В-клетки умирают, поскольку имеют короткий срок жизни. Таким образом, выживают только гибриды В-клеток и миеломы. Эти клетки вырабатывают антитела (свойство В-клеток) и бессмертны (свойство клеток миеломы). Инкубированную среду затем разводят в многолуночные планшеты до такой степени, чтобы каждая лунка содержала только 1 клетку. Затем супернатант в каждой лунке можно проверить на наличие нужного антитела. Поскольку антитела в лунке производятся одной и той же В-клеткой, они будут направлены к одной и той же эпитоп и известны как моноклональные антитела .

Производство моноклональных антител было впервые изобретено Сезаром Мильштейном и Жоржем Дж. Ф. Кёлером , что принесло им Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1984 года, разделенную с Нильсом Каем Йерне .

Ссылки

^ Холлидей, Р; Хо, Т (1998). «доказательства молчания генов посредством эндогенного метилирования» . Proc Natl Acad Sci США . 95 (15): 8727–32. Бибкод : 1998PNAS...95.8727H . дои : 10.1073/pnas.95.15.8727 . ПМК 21144 . ПМИД 9671746 .

[1] Холлидей, Р; Хо, Т (1998). «доказательства молчания генов посредством эндогенного метилирования» . Proc Natl Acad Sci США . 95 (15): 8727–32. Бибкод : 1998PNAS...95.8727H . дои : 10.1073/pnas.95.15.8727 . ПМК 21144 . ПМИД 9671746 .

[ 1 ]