✖


Jump to content

Замалчивание РНК

Edit links

Замалчивание РНК или РНК-интерференция относится к семейству эффектов подавления генов , с помощью которых экспрессия генов отрицательно регулируется некодирующими РНК, такими как микроРНК . Сайленсинг РНК также можно определить как последовательность-специфическую регуляцию экспрессии генов, запускаемую двухцепочечной РНК ( дсРНК ). [1] Механизмы молчания РНК консервативны среди большинства эукариот . [2] Наиболее распространенным и хорошо изученным примером является РНК-интерференция ( РНКи ), при которой эндогенно экспрессируемая микроРНК ( миРНК ) или экзогенно полученная малая интерферирующая РНК ( миРНК ) индуцирует деградацию комплементарной информационной РНК . Были идентифицированы другие классы малых РНК, включая piwi-взаимодействующую РНК ( piRNA ). [3] и его подвидовый повтор, связанный с небольшой интерферирующей РНК ( rasiRNA ). [4]

Фон

[ редактировать ]

Сайленсинг РНК описывает несколько механически связанных путей, которые участвуют в контроле и регуляции экспрессии генов. [5] [6] [7] Пути молчания РНК связаны с регуляторной активностью небольших некодирующих РНК (длиной примерно 20–30 нуклеотидов), которые действуют как факторы, участвующие в инактивации гомологичных последовательностей, стимулировании активности эндонуклеазы, остановке трансляции и/или хроматической модификации или модификации ДНК. [8] [9] [10] В контексте, когда это явление было впервые изучено, было обнаружено, что малые РНК играют важную роль в защите растений от вирусов. Например, эти исследования показали, что ферменты обнаруживают двухцепочечную РНК ( дцРНК ), обычно не встречающуюся в клетках, и расщепляют ее на маленькие кусочки, которые не способны вызвать заболевание. [11] [12] [13] [14] [2]

Хотя некоторые функции подавления РНК и его механизмы понятны, многие — нет. Например, было показано, что молчание РНК важно в регуляции развития и контроле событий транспозиции. [15] Было показано, что подавление РНК играет роль в противовирусной защите как у растений, так и у насекомых. [16] Также было показано, что у дрожжей замалчивание РНК поддерживает структуру гетерохроматина. [17] Однако разнообразная и тонкая роль молчания РНК в регуляции экспрессии генов остается предметом продолжающихся научных исследований. Ряд разнообразных функций был предложен для растущего числа охарактеризованных малых последовательностей РНК, например, регуляция развития, судьба нейрональных клеток, гибель клеток, пролиферация, накопление жира, судьба гемопоэтических клеток, секреция инсулина. [18]

Сайленсинг РНК действует путем подавления трансляции или расщепления информационной РНК ( мРНК ), в зависимости от степени комплементарности спаривания оснований. РНК широко исследовалась с точки зрения ее роли посредника в трансляции генов в белки. [19] Однако более активные регуляторные функции начали рассматриваться исследователями только с конца 1990-х годов. [20] Знаменательное исследование, дающее понимание первого выявленного механизма, было опубликовано в 1998 году Fire et al., [1] демонстрируя, что двухцепочечная РНК может действовать как триггер молчания генов. [20] С тех пор были идентифицированы и охарактеризованы различные другие классы молчания РНК. [5] В настоящее время терапевтический потенциал этих открытий исследуется, например, в контексте таргетной генной терапии. [21] [22]

Хотя замалчивание РНК представляет собой развивающийся класс механизмов, общей темой является фундаментальная взаимосвязь между малыми РНК и экспрессией генов. [9] Также было замечено, что основные пути молчания РНК, идентифицированные в настоящее время, имеют механизмы действия, которые могут включать как посттранскрипционное молчание генов (PTGS), так и [23] а также пути хроматин-зависимого молчания генов (CDGS). [5] CDGS включает сборку небольших комплексов РНК на возникающих транскриптах и ​​рассматривается как охватывающий механизм действия, который включает в себя события молчания транскрипционных генов (TGS) и котранскрипционного молчания генов (CTGS). [24] Это важно, по крайней мере, потому, что данные свидетельствуют о том, что малые РНК играют роль в модуляции структуры хроматина и TGS. [25] [26]

Несмотря на раннее внимание в литературе к РНК-интерференции ( РНКи ) как основному механизму, который происходит на уровне трансляции информационной РНК, с тех пор были идентифицированы другие в более широком семействе консервативных путей молчания РНК, действующих на уровне ДНК и хроматина. [27] Сайленсинг РНК относится к подавляющей активности ряда малых РНК и обычно рассматривается как более широкая категория, чем РНКи. Хотя эти термины иногда используются в литературе как взаимозаменяемые, RNAi обычно рассматривается как ветвь молчания РНК. В той степени, в которой полезно провести различие между этими родственными концепциями, молчание РНК можно рассматривать как относящееся к более широкой схеме контроля, связанного с малыми РНК, участвующего в экспрессии генов и защите генома от мобильных повторяющихся последовательностей ДНК, ретроэлементов, и транспозоны в той степени, в которой они могут вызывать мутации. [28] Молекулярные механизмы молчания РНК первоначально изучались на растениях. [13] но с тех пор они расширились и охватили множество субъектов, от грибов до млекопитающих, что дает убедительные доказательства того, что эти пути высоко консервативны. [29]

В настоящее время идентифицированы по крайней мере три основных класса малых РНК, а именно: малые интерферирующие РНК ( миРНК ), микроРНК ( миРНК ) и пиви-взаимодействующие РНК ( пиРНК ).

малая интерферирующая РНК (миРНК)

[ редактировать ]
Основная статья: Малая интерферирующая РНК

миРНК действуют в ядре и цитоплазме и участвуют в РНКи, а также в CDGS. [5] siRNA происходят из длинных предшественников дцРНК, полученных из множества предшественников одноцепочечной РНК (оцРНК), таких как смысловые и антисмысловые РНК. siRNA также происходят из шпилечных РНК, полученных в результате транскрипции областей инвертированных повторов. siRNA могут также возникать ферментативно из некодирующих предшественников РНК. [30] Объем литературы по siRNA в рамках RNAi обширен. Одним из эффективных применений миРНК является способность различать целевую и нецелевую последовательность с разницей в один нуклеотид. Этот подход считается терапевтически решающим для подавления доминантных нарушений функции усиления (GOF), когда мутантный аллель, вызывающий заболевание, отличается от аллеля дикого типа одним нуклеотидом (nt). Этот тип миРНК, способный различать однонуклеотидные различия, называется аллель-специфическими миРНК. [31]

микроРНК (миРНК)

[ редактировать ]
Основная статья: МикроРНК

Большинство микроРНК действуют в цитоплазме и опосредуют деградацию мРНК или остановку трансляции. [32] Однако было показано, что некоторые растительные микроРНК непосредственно способствуют метилированию ДНК. [33] МикроРНК происходят из предшественников шпилек, генерируемых ферментами РНКазы III Drosha и Dicer . [34] И микроРНК, и миРНК образуют либо РНК-индуцированный комплекс молчания ( RISC ), либо ядерную форму RISC, известную как РНК-индуцированный комплекс подавления транскрипции ( RITS ). [35] Объем литературы по микроРНК в рамках РНКи обширен.

Три основных нетранслируемых региона и микроРНК

[ редактировать ]
Основная статья: Три главных непереведенных региона

Три первичных нетранслируемых участка (3'UTR) информационных РНК (мРНК) часто содержат регуляторные последовательности, которые посттранскрипционно вызывают РНК-интерференцию. Такие 3'-UTR часто содержат как сайты связывания микроРНК (миРНК), так и регуляторные белки. Связываясь со специфическими сайтами внутри 3'-UTR, микроРНК могут снижать экспрессию генов различных мРНК, либо ингибируя трансляцию, либо непосредственно вызывая деградацию транскрипта. 3'-UTR также может иметь участки сайленсера, которые связывают белки-репрессоры, ингибирующие экспрессию мРНК.

3'-UTR часто содержит элементы ответа микроРНК (MRE) . MRE — это последовательности, с которыми связываются микроРНК. Это преобладающие мотивы в 3'-UTR. Среди всех регуляторных мотивов в 3'-UTR (например, включая сайленсеры), MRE составляют около половины мотивов.

По состоянию на 2014 год miRBase веб-сайт [36] архив микроРНК последовательностей и аннотаций содержит 28 645 записей о 233 биологических видах. Из них 1881 микроРНК находились в аннотированных локусах микроРНК человека. Было предсказано, что микроРНК содержат в среднем около четырехсот целевых мРНК (влияющих на экспрессию нескольких сотен генов). [37] Фрейдман и др. [37] подсчитали, что> 45 000 целевых сайтов микроРНК в 3'UTR мРНК человека консервативны выше фоновых уровней, и> 60% генов, кодирующих белки человека, находились под селективным давлением для поддержания спаривания с микроРНК.

Прямые эксперименты показывают, что одна микроРНК может снизить стабильность сотен уникальных мРНК. [38] Другие эксперименты показывают, что одна микроРНК может подавлять продукцию сотен белков, но эта репрессия часто бывает относительно легкой (менее чем в 2 раза). [39] [40]

Эффекты нарушения регуляции экспрессии генов микроРНК, по-видимому, важны при раке. [41] Например, при раке желудочно-кишечного тракта девять микроРНК были идентифицированы как эпигенетически измененные и эффективные в подавлении ферментов репарации ДНК. [42]

Эффекты нарушения регуляции экспрессии генов микроРНК также, по-видимому, важны при нервно-психических расстройствах, таких как шизофрения, биполярное расстройство, большая депрессия, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и расстройства аутистического спектра. [43] [44] [45]

piwi-взаимодействующая РНК (piRNA)

[ редактировать ]
Основная статья: Piwi-взаимодействующая РНК

piRNA представляют собой самый большой класс небольших некодирующих молекул РНК, экспрессируемых в клетках животных и происходящих из самых разных источников, включая повторяющуюся ДНК и транспозоны. [46] Однако биогенез piRNAs также наименее изучен. [47] piRNAs, по-видимому, действуют как на посттранскрипционном, так и на уровне хроматина. Они отличаются от микроРНК, по крайней мере, увеличением размера и сложности. Связанные с повторами малые интерферирующие РНК ( разиРНК ) считаются подвидом пиРНК. [4]

Механизм

[ редактировать ]
обработка микроРНК

Самый основной механизм подавления РНК заключается в следующем:(Более подробное объяснение механизма можно найти в статье «РНКи: клеточный механизм ».)

1: РНК с инвертированными повторами, конструкции шпильки/ручки --> 2: дцРНК --> 3: микроРНК / миРНК --> 4: RISC --> 5: Разрушение целевой мРНК

  1. Было обнаружено, что лучшим предшественником хорошего подавления РНК является наличие одноцепочечной антисмысловой РНК с инвертированными повторами , которые, в свою очередь, создают небольшие шпильковые РНК и конструкции с ручками. [7] Конструкции «шпилька» или «ручка» существуют для того, чтобы РНК могла оставаться независимой и не отжигаться с другими цепями РНК.
  2. Эти небольшие РНК-шпильки и/или ручки затем транспортируются из ядра в цитозоль через рецептор ядерного экспорта, называемый экспортином-5, а затем трансформируются в дцРНК, двухцепочечную РНК, которая, как и ДНК, представляет собой двухцепочечную последовательность. нуклеотидов ​ . Если бы в этом механизме использовались не дцРНК, а только одиночные нити, у него была бы более высокая вероятность гибридизации с другими «хорошими» мРНК. Поскольку он является двухцепочечным, его можно держать наготове, когда это необходимо.
  3. Затем дцРНК разрезается с помощью Dicer на небольшие (длиной 21-28 нуклеотидов ) цепи микроРНК ( микроРНК ) или миРНК (коротких интерферирующих РНК). Dicer представляет собой эндорибонуклеазную РНКазу , которая представляет собой комплекс белка, смешанного с цепь(и) РНК.
  4. Наконец, двухцепочечные микроРНК / миРНК разделяются на одноцепочечные; антисмысловая цепь РНК этих двух объединится с другим эндорибонуклеазы, ферментным комплексом называемым RISC ( РНК-индуцированный комплекс молчания ), который включает каталитический компонент Argonaute , и будет направлять RISC на расщепление «идеально комплементарной» целевой мРНК или вирусной геномной РНК. чтобы его можно было уничтожить. [2] [7]
  5. Это означает, что на основе специфической области короткой последовательности будет вырезана соответствующая мРНК. Для верности его разрежут и во многих других местах. (Если бы механизм работал только при длительном растяжении, то была бы более высокая вероятность того, что он не успеет соответствовать своей комплементарной длинной мРНК.) Также было показано, что повторно ассоциированные короткие интерференционные РНК ( разиРНК ) имеют роль в управлении модификацией хроматина. [2]

Биологические функции

[ редактировать ]

Иммунитет против вирусов или транспозонов

[ редактировать ]

Замалчивание РНК — это механизм, который наши клетки (и клетки всех царств ) используют для борьбы с РНК-вирусами и транспозонами (которые происходят как из наших собственных клеток, так и из других носителей). [2] В случае РНК-вирусов они немедленно уничтожаются по механизму, указанному выше. В случае с транспозонами все немного более косвенно. Поскольку транспозоны расположены в разных частях генома, разные транскрипции от разных промоторов производят комплементарные мРНК, которые могут гибридизоваться друг с другом. Когда это происходит, в действие вступает механизм РНКи, ослабляя мРНК белков, которые необходимы для перемещения самих транспозонов. [48]

Снижение регуляции генов

[ редактировать ]

Подробное объяснение подавления генов см. в разделе RNAi: подавление генов.

Повышение регуляции генов

[ редактировать ]

Подробное объяснение усиления регуляции генов см. в разделе RNAi: усиление генов.

Замалчивание РНК также регулируется

[ редактировать ]

Точно так же, как молчание РНК регулирует последующие мРНК- мишени , регулируется само молчание РНК. Например, сигналы молчания распространяются между клетками с помощью группы ферментов, называемых RdRP ( РНК-зависимые РНК-полимеразы ) или RDR. [2]

Практическое применение

[ редактировать ]

Растущее понимание механизмов молчания генов малых РНК, включающих деградацию мРНК, опосредованную дцРНК, напрямую повлияло на области функциональной геномики, биомедицины и экспериментальной биологии. В следующем разделе описаны различные приложения, связанные с эффектами подавления РНК. К ним относятся использование в биотехнологии, терапии и лабораторных исследованиях. Методы биоинформатики также применяются для идентификации и характеристики большого количества малых РНК и их мишеней.

Биотехнология

[ редактировать ]

Искусственное введение длинных дцРНК или миРНК было принято в качестве инструмента инактивации экспрессии генов как в культивируемых клетках, так и в живых организмах. [2] Структурное и функциональное разрешение малых РНК как эффекторов молчания РНК оказало прямое влияние на экспериментальную биологию. Например, можно синтезировать дцРНК, имеющую специфическую последовательность, комплементарную интересующему гену. После введения в клетку или биологическую систему он распознается как экзогенный генетический материал и активирует соответствующий путь подавления РНК. Этот механизм можно использовать для снижения экспрессии генов по отношению к мишени, что полезно для исследования потери функции генов относительно фенотипа. То есть изучение фенотипических и/или физиологических эффектов снижения экспрессии может выявить роль генного продукта. Наблюдаемые эффекты могут иметь нюансы, например, некоторые методы позволяют различать «нокдаун» (снижение экспрессии) и «нокаут» (устранение экспрессии) гена. [49] Технологии РНК-интерференции недавно были отмечены как один из наиболее широко используемых методов функциональной геномики. [50] Скрины, разработанные с использованием малых РНК, использовались для идентификации генов, участвующих в фундаментальных процессах, таких как деление клеток, апоптоз и регуляция жировой ткани.

Биомедицина

[ редактировать ]

По крайней мере, с середины 2000-х годов возрос интерес к разработке коротких интерферирующих РНК для биомедицинских и терапевтических применений. [51] Этот интерес усиливается растущим числом экспериментов, которые успешно продемонстрировали клинический потенциал и безопасность малых РНК для борьбы с различными заболеваниями, от вирусных инфекций до рака, а также нейродегенеративных расстройств. [52] В 2004 году первые заявки на новые исследовательские лекарства для siRNA были поданы в США в Управление по контролю за продуктами и лекарствами ; он был задуман как терапия возрастной дегенерации желтого пятна . [50] Замалчивание РНК in vitro и in vivo достигалось путем создания триггеров (нуклеиновых кислот, индуцирующих РНКи) либо посредством экспрессии в вирусах, либо посредством синтеза олигонуклеотидов. [53] Многие исследования с оптимизмом указывают на то, что терапия на основе малых РНК может предложить новое и мощное оружие против патогенов и болезней, где малые молекулы/фармакологические и вакцинные/биологические методы лечения в прошлом оказались неэффективными или оказались менее эффективными. [51] Однако также предупреждается, что дизайн и доставку малых эффекторных молекул РНК следует тщательно продумать, чтобы обеспечить безопасность и эффективность.

Роль подавления РНК в терапии, клинической медицине и диагностике является быстро развивающейся областью, и ожидается, что в ближайшие несколько лет некоторые соединения, использующие эту технологию, получат одобрение на рынке. Отчет был обобщен ниже, чтобы подчеркнуть многие клинические области, в которых подавление РНК играет все более важную роль, главными из которых являются заболевания глаз и сетчатки, рак, заболевания почек, снижение уровня ЛПНП и противовирусные препараты. [53] В следующей таблице представлен список терапии на основе РНКи, которые в настоящее время находятся на различных стадиях клинических испытаний. Статус этих исследований можно отслеживать на веб-сайте ClinicalTrials.gov , службе Национальных институтов здравоохранения ( NIH ). [54] Следует отметить разрабатываемые методы лечения заболеваний глаз и сетчатки, которые были одними из первых соединений, дошедших до клинической разработки. AGN211745 (sirna027) (Allergan) и бевасираниб (Cand5) (Opko) прошли клинические разработки для лечения возрастной дегенерации желтого пятна, но испытания были прекращены до того, как соединения поступили на рынок. Другие соединения, находящиеся в разработке для лечения заболеваний глаз, включают SYL040012 (Sylentis) и QPI-007 (Quark). SYL040012 (бамозинан) является кандидатом на лекарственное средство, находящееся в стадии клинической разработки, для лечения глаукомы, прогрессирующей нейродегенерации зрительного нерва, часто связанной с повышенным внутриглазным давлением; QPI-007 является кандидатом для лечения закрытоугольной глаукомы и неартериальной передней ишемической оптической нейропатии; оба соединения в настоящее время проходят фазу II клинических испытаний. Несколько соединений также находятся в стадии разработки для лечения таких заболеваний, как рак и редкие заболевания.

Клиническая область Лекарство Индикация Цель
Заболевания глаз и сетчатки ТД101 Врожденная пахионихия Кератин 6А N171K мутант
Заболевания глаз и сетчатки QPI-1007 Неартериальная передняя ишемическая нейропатия зрительного нерва Каспаза 2
Заболевания глаз и сетчатки АГН211745 Возрастная дегенерация желтого пятна, хориоидальная неоваскуляризация ВЕФФР1
Заболевания глаз и сетчатки ПФ-655 Диабетический макулярный отек, возрастная макулярная дегенерация. РТП801
Заболевания глаз и сетчатки SYL040012 Глаукома β2-адренергический рецептор
Заболевания глаз и сетчатки Запятнанный Диабетический макулярный отек ВЭФР
Заболевания глаз и сетчатки Запятнанный Дегенерация желтого пятна ВЭФР
Рак CEQ508 Семейный аденоматозный полипоз β-катенин
Рак АЛН-ПЛК1 Опухоль печени ПЛК1
Рак КЛЫК Солидная опухоль Фурин
Рак АЛАА-01 Солидная опухоль РРМ2
Рак SPC2996 хронический лимфоцитарный лейкоз БКЛ-2
Рак АЛН-ВСП02 Солидная опухоль VEGF, белок веретена кинезина
Рак NCT00672542 Метастатическая меланома LMP2, LMP7 и MECL1
Рак Ату027 Солидные злокачественные новообразования ПКН3
Заболевания почек QPI-1002/I5NP Острое повреждение почек стр.53
Заболевания почек QPI-1002/I5NP Трансплантация почки с дисфункцией трансплантата стр.53
Заболевания почек QPI-1002/I5NP Поражение почек, острая почечная недостаточность стр.53
Снижение ЛПНП ТКМ-АпоБ Гиперхолестеринемия АПОБ
Снижение ЛПНП ПРО-040,201 Гиперхолестеринемия АПОБ
Противовирусное средство миравирсен Вирус гепатита С миР-122
Противовирусное средство pHIV7-shI-TAR-CCR5RZ ВИЧ Белок Tat ВИЧ, РНК ВИЧ TAR, человеческий CCR5
Противовирусное средство АЛН-РСВ01 РСВ Нуклеокапсид РСВ
Противовирусное средство АЛН-РСВ01 РСВ у пациентов после трансплантации легких Нуклеокапсид РСВ

Основная задача

[ редактировать ]

Как и в случае с традиционными лекарственными средствами, основной проблемой в разработке успешных ответвлений препаратов на основе РНКи является точная доставка триггеров РНКи туда, где они необходимы в организме. Причина того, что противоядие от дегенерации желтого пятна глаза оказалось успешным раньше, чем противоядие от других заболеваний, заключается в том, что глазное яблоко представляет собой практически закрытую систему, и сыворотку можно вводить иглой именно туда, куда нужно. Будущие успешные лекарства будут теми, которые смогут приземлиться там, где это необходимо, вероятно, с помощью наноботов. Ниже приведена интерпретация таблицы [53] это показывает существующие способы доставки триггеров РНКи.

Виды/формуляция Емкость упаковки Приложения и соображения
Вирусный вектор
Аденовирус Обычно < 10 Кб Вектор дцДНК с большой упаковочной способностью, транзиторной экспрессией, высокой иммуногенностью
Аденоассоциированный вирус (ААВ) ~4,5Кб Вектор оцДНК, небольшая упаковочная способность, умеренная иммуногенность, длительная экспрессия в неделящихся клетках, псевдотипирование/инженерия капсида облегчает специфическое нацеливание на клетки
Лентивирус До 13,5 Кб РНК-вектор, доступны компетентные и некомпетентные формы интеграции, менее иммуногенен, чем аденовирус или AAV, псевдотипирование оболочки облегчает нацеливание на клетки, клиническое производство более сложно, чем для аденовируса или AAV
Вирус простого герпеса 150 Кб ДНК-вектор, эписомальный, длительная экспрессия, иммуногенный
Виды бактериальных векторов (бактериальные миниклетки могут нести плазмиды, миРНК или лекарства)
Escherichis coli , S. Typhymurium Доставка короткой шпилечной РНК или миРНК в ткань кишечника.
Невирусные составы
Наночастица Самосборка, может быть нацелена на определенные рецепторы, требует технических знаний для подготовки.
Стабильная липидная частица нуклеиновой кислоты (SNALP) Стабильно для системной доставки, доставка широкого клеточного типа.
Аптамер Нацеливание на специфические рецепторы требует сложного скрининга для разработки
Холестерин Стабильно для системной доставки, доставка широкого клеточного типа.

Лаборатория

[ редактировать ]

Научное сообщество быстро использовало подавление РНК в качестве исследовательского инструмента. Стратегическое нацеливание мРНК может предоставить большой объем информации о функции гена и его способности включаться и выключаться. Индуцированное молчание РНК может служить контролируемым методом подавления экспрессии генов. Поскольку этот механизм сохраняется у большинства эукариот, эти эксперименты хорошо масштабируются на ряде модельных организмов. [55] На практике экспрессия синтетических коротких шпилечных РНК может быть использована для достижения стабильного нокдауна. [56] Если можно создать промоторы для экспрессии этих дизайнерских коротких шпилечных РНК, результатом часто будет мощное, стабильное и контролируемое нокдаун генов как в условиях in vitro, так и in vivo. [57] Векторные системы с короткой шпилькой РНК можно рассматривать как примерно аналогичные по объему использованию системы сверхэкспрессии кДНК. [58] В целом, синтетические и природные малые РНК оказались важным инструментом для изучения функции генов в клетках, а также у животных. [59]

Биоинформатические подходы к идентификации малых РНК и их мишеней выявили несколько сотен, если не тысяч, малых РНК-кандидатов, которые, по прогнозам, влияют на экспрессию генов у растений, C. elegans, D. melanogaster, рыбок данио, мышей, крыс и человека. [60] Эти методы в основном направлены на идентификацию малых РНК-кандидатов для экспериментов по нокауту, но могут иметь и более широкое применение. Один из биоинформатических подходов оценивал критерии сохранения последовательности путем фильтрации семян, комплементарных сайтов связывания с мишенью. В цитируемом исследовании было предсказано, что примерно треть генов млекопитающих должна регулироваться, в данном случае, микроРНК. [61]

Этика и анализ рисков и выгод

[ редактировать ]

Одним из аспектов подавления РНК, который следует учитывать, является его возможное нецелевое воздействие, токсичность и методы доставки. Если подавление РНК должно стать обычным лекарством, оно должно сначала решить типичные этические проблемы биомедицины. [62] Используя анализ риска и выгоды, исследователи могут определить, соответствует ли подавление РНК этическим идеологиям, таким как непричинение вреда, благодеяние и автономия. [63]

Существует риск создания инфекционно-компетентных вирусов, которые могут заразить людей, не согласившихся на это. [64] Существует также риск воздействия этих методов лечения на будущие поколения. Эти два сценария в отношении автономии, возможно, неэтичны. В настоящий момент небезопасные методы доставки и непреднамеренные аспекты векторных вирусов усиливают аргументы против подавления РНК. [63]

Что касается нецелевых эффектов, миРНК может индуцировать врожденные интерфероновые ответы, ингибировать эндогенные микроРНК за счет насыщения и может иметь последовательности, комплементарные другим нецелевым мРНК. Эти нецелевые объекты также могут иметь целевую активацию, такую ​​как онкогены и антиапоптотические гены. Токсичность подавления РНК все еще изучается, поскольку имеются противоречивые сообщения. [63] [64] [65]

Количество публикаций RNAi с 1998 г.

Сайленсинг РНК быстро развивается, поэтому этические вопросы требуют дальнейшего обсуждения. Зная общие этические принципы, мы должны постоянно проводить анализ рисков и выгод. [63]

См. также

[ редактировать ]

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Перейти обратно: а б Файр А, Сюй С, Монтгомери МК, Костас С.А., Драйвер С.Е., Мелло CC (февраль 1998 г.). «Мощное и специфическое генетическое вмешательство двухцепочечной РНК в Caenorhabditis elegans» . Природа . 391 (6669): 806–11. Бибкод : 1998Natur.391..806F . дои : 10.1038/35888 . ПМИД   9486653 . S2CID   4355692 .
  2. ^ Перейти обратно: а б с д и ж г Мейстер Г., Тушл Т. (сентябрь 2004 г.). «Механизмы молчания генов с помощью двухцепочечной РНК» (PDF) . Природа . 431 (7006): 343–9. Бибкод : 2004Natur.431..343M . дои : 10.1038/nature02873 . ПМИД   15372041 . S2CID   90438 .
  3. ^ Монга I, Банерджи I (ноябрь 2019 г.). «Вычислительная идентификация piRNA с использованием признаков, основанных на последовательности, структуре, термодинамических и физико-химических свойствах РНК» . Современная геномика . 20 (7): 508–518. дои : 10.2174/1389202920666191129112705 . ПМЦ   7327968 . PMID   32655289 .
  4. ^ Перейти обратно: а б Гунавардане Л.С., Сайто К., Нисида К.М., Миёси К., Кавамура Ю., Нагами Т., Сиоми Х., Сиоми MC (март 2007 г.). «Опосредованный слайсером механизм формирования 5'-конца ассоциированной с повторами миРНК у дрозофилы» . Наука . 315 (5818): 1587–90. Бибкод : 2007Sci...315.1587G . дои : 10.1126/science.1140494 . ПМИД   17322028 . S2CID   11513777 .
  5. ^ Перейти обратно: а б с д Моазед Д. (январь 2009 г.). «Маленькие РНК в подавлении транскрипционного гена и защите генома» . Природа . 457 (7228): 413–20. Бибкод : 2009Natur.457..413M . дои : 10.1038/nature07756 . ПМЦ   3246369 . ПМИД   19158787 .
  6. ^ Пикфорд А.С., Когони С. (май 2003 г.). «РНК-опосредованное молчание генов» . Клеточные и молекулярные науки о жизни . 60 (5): 871–82. дои : 10.1007/s00018-003-2245-2 . ПМЦ   11138585 . ПМИД   12827277 . S2CID   5822771 .
  7. ^ Перейти обратно: а б с Тийстерман М., Кеттинг Р.Ф., Пластерк Р.Х. (2002). «Генетика молчания РНК». Ежегодный обзор генетики . 36 : 489–519. дои : 10.1146/annurev.genet.36.043002.091619 . ПМИД   12429701 .
  8. ^ Малецова Б., Моррис К.В. (апрель 2010 г.). «Транскрипционное молчание генов посредством эпигенетических изменений, опосредованных некодирующими РНК» . Современное мнение о молекулярной терапии . 12 (2): 214–22. ПМЦ   2861437 . ПМИД   20373265 .
  9. ^ Перейти обратно: а б Мейстер Г., Ландталер М., Дорсетт Ю., Тушль Т. (март 2004 г.). «Последовательность-специфическое ингибирование молчания РНК, индуцированного микроРНК и миРНК» . РНК . 10 (3): 544–50. дои : 10.1261/rna.5235104 . ПМК   1370948 . ПМИД   14970398 .
  10. ^ Чжоу Х, Ху Х, Лай М (декабрь 2010 г.). «Некодирующие РНК и их эпигенетические регуляторные механизмы» . Биология клетки . 102 (12): 645–55. дои : 10.1042/BC20100029 . ПМИД   21077844 . S2CID   11325463 .
  11. ^ Дин СВ (апрель 2000 г.). «Замалчивание РНК». Современное мнение в области биотехнологии . 11 (2): 152–6. дои : 10.1016/s0958-1669(00)00074-4 . ПМИД   10753772 .
  12. ^ Суси П., Хокури М., Валроос Т., Килби, Нью-Джерси (январь 2004 г.). «Характеристики молчания РНК у растений: сходства и различия между царствами». Молекулярная биология растений . 54 (2): 157–74. дои : 10.1023/B:PLAN.0000028797.63168.a7 . ПМИД   15159620 . S2CID   11018531 .
  13. ^ Перейти обратно: а б Баулкомб Д. ​​(сентябрь 2004 г.). «Замалчивание РНК у растений». Природа . 431 (7006): 356–63. Бибкод : 2004Natur.431..356B . дои : 10.1038/nature02874 . ПМИД   15372043 . S2CID   4421274 .
  14. ^ Баулкомб Д. ​​(июнь 2005 г.). «Замалчивание РНК» . Тенденции биохимических наук . 30 (6): 290–3. дои : 10.1016/j.tibs.2005.04.012 . ПМИД   15950871 .
  15. ^ Мацке М.А., Бирхлер Дж.А. (январь 2005 г.). «РНКи-опосредованные пути в ядре» . Обзоры природы Генетика . 6 (1): 24–35. дои : 10.1038/nrg1500 . ПМИД   15630419 . S2CID   9321759 .
  16. ^ Войннет О (март 2005 г.). «Индукция и подавление молчания РНК: данные о вирусных инфекциях». Обзоры природы Генетика . 6 (3): 206–20. дои : 10.1038/nrg1555 . ПМИД   15703763 . S2CID   26351712 .
  17. ^ Гревал С.И., Райс Дж.К. (июнь 2004 г.). «Регуляция гетерохроматина посредством метилирования гистонов и малых РНК» . Современное мнение в области клеточной биологии . 16 (3): 230–8. дои : 10.1016/j.ceb.2004.04.002 . ПМИД   15145346 .
  18. ^ Пой М.Н., Элиассон Л., Круцфельдт Дж., Кувадзима С., Ма Х, Макдональд П.Е., Пфеффер С., Тушль Т., Раевски Н., Рорсман П., Стоффель М. (ноябрь 2004 г.). «МикроРНК, специфичная для островков поджелудочной железы, регулирует секрецию инсулина». Природа . 432 (7014): 226–30. Бибкод : 2004Natur.432..226P . дои : 10.1038/nature03076 . ПМИД   15538371 . S2CID   4415988 .
  19. ^ Экклстон, Алекс; Анджела К. Эгглстон (2004). «РНК-интерференция» . Природа . 431 (7006): 338–42. Бибкод : 2004Natur.431..337E . дои : 10.1038/431337a . ПМИД   15372040 .
  20. ^ Перейти обратно: а б Эгглстон АК (январь 2009 г.). «Замалчивание РНК» . Природа . 457 (7228): 395. Бибкод : 2009Natur.457..395E . дои : 10.1038/457395a . ПМИД   19158784 .
  21. ^ Такешита Ф., Очия Т. (август 2006 г.). «Терапевтический потенциал РНК-интерференции против рака» . Раковая наука . 97 (8): 689–96. дои : 10.1111/j.1349-7006.2006.00234.x . ПМЦ   11158528 . ПМИД   16863503 . S2CID   19447542 .
  22. ^ Dykxhoorn DM, Novina CD, Sharp PA (июнь 2003 г.). «Убийство посланника: короткие РНК, подавляющие экспрессию генов». Nature Reviews Молекулярно-клеточная биология . 4 (6): 457–67. дои : 10.1038/nrm1129 . ПМИД   12778125 . S2CID   7445808 .
  23. ^ Хаммонд С.М., Коди А.А., Хэннон Дж.Дж. (февраль 2001 г.). «Посттранскрипционное молчание генов с помощью двухцепочечной РНК». Обзоры природы Генетика . 2 (2): 110–9. дои : 10.1038/35052556 . ПМИД   11253050 . S2CID   2864720 .
  24. ^ Бюлер М. (апрель 2009 г.). «Обмен РНК и хроматин-зависимое замалчивание генов». Хромосома . 118 (2): 141–51. дои : 10.1007/s00412-008-0195-z . ПМИД   19023586 . S2CID   2790637 .
  25. ^ Гонсалес С., Пизано Д.Г., Серрано М. (август 2008 г.). «Механистические принципы ремоделирования хроматина, управляемые миРНК и микроРНК» . Клеточный цикл . 7 (16): 2601–8. дои : 10.4161/cc.7.16.6541 . ПМИД   18719372 .
  26. ^ Ким Дж.К., Габель Х.В., Камат Р.С., Тевари М., Паскинелли А., Руал Дж.Ф., Кеннеди С., Диббс М., Бертин Н., Каплан Дж.М., Видал М., Рувкун Г. (май 2005 г.). «Функционально-геномный анализ РНК-интерференции у C. elegans» . Наука . 308 (5725): 1164–7. Бибкод : 2005Sci...308.1164K . дои : 10.1126/science.1109267 . ПМИД   15790806 . S2CID   15510615 .
  27. ^ Бюлер М., Моазед Д. (ноябрь 2007 г.). «Транскрипция и РНКи в подавлении гетерохроматического гена». Структурная и молекулярная биология природы . 14 (11): 1041–8. дои : 10.1038/nsmb1315 . ПМИД   17984966 . S2CID   39098216 .
  28. ^ Домброски Б.А., Фенг К., Матиас С.Л., Сассаман Д.М., Скотт А.Ф., Казазиан Х.Х., Буке Дж.Д. (июль 1994 г.). «Анализ обратной транскриптазы человеческого ретротранспозона L1 in vivo в Saccharomyces cerevisiae» . Молекулярная и клеточная биология . 14 (7): 4485–92. дои : 10.1128/mcb.14.7.4485 . ПМК   358820 . ПМИД   7516468 .
  29. ^ Свобода П (2008). «Замалчивание РНК в ооцитах и ​​ранних эмбрионах млекопитающих». РНК-интерференция . Актуальные темы микробиологии и иммунологии. Том. 320. стр. 225–56. дои : 10.1007/978-3-540-75157-1_11 . ISBN  978-3-540-75156-4 . ПМИД   18268847 .
  30. ^ Гильдиял М., Зейтц Х., Хорвич М.Д., Ли С., Ду Т., Ли С., Сюй Дж., Киттлер Э.Л., Запп М.Л., Венг З., Замор П.Д. (май 2008 г.). «Эндогенные миРНК, полученные из транспозонов и мРНК в соматических клетках дрозофилы» . Наука . 320 (5879): 1077–81. Бибкод : 2008Sci...320.1077G . дои : 10.1126/science.1157396 . ПМЦ   2953241 . ПМИД   18403677 .
  31. ^ Монга И., Куреши А., Тхакур Н., Гупта А.К., Кумар М. (2017). «ASPsiRNA: ресурс ASP-siRNA, обладающий терапевтическим потенциалом в отношении генетических нарушений человека, и алгоритм прогнозирования их ингибирующей эффективности» . G3: Гены, геномы, генетика . 7 (9): 2931–2943. дои : 10.1534/g3.117.044024 . ПМК   5592921 . ПМИД   28696921 .
  32. ^ Филипович В., Яскевич Л., Колб Ф.А., Пиллаи Р.С. (июнь 2005 г.). «Посттранскрипционное молчание генов с помощью миРНК и микроРНК». Современное мнение в области структурной биологии . 15 (3): 331–41. дои : 10.1016/j.sbi.2005.05.006 . ПМИД   15925505 .
  33. ^ Бао Н., Щелок К.В., Бартон М.К. (ноябрь 2004 г.). «Сайты связывания микроРНК в мРНК HD-ZIP Arabidopsis класса III необходимы для метилирования матричной хромосомы» . Развивающая клетка . 7 (5): 653–62. дои : 10.1016/j.devcel.2004.10.003 . ПМИД   15525527 .
  34. ^ Цзэн Ю, Йи Р, Каллен Б.Р. (январь 2005 г.). «Распознавание и расщепление первичных предшественников микроРНК ферментом ядерной обработки Дроша» . Журнал ЭМБО . 24 (1): 138–48. дои : 10.1038/sj.emboj.7600491 . ПМК   544904 . ПМИД   15565168 .
  35. ^ Ирвин Д.В., Заратьеги М., Толия Н.Х., Гото Д.Б., Читвуд Д.Х., Вон М.В., Джошуа-Тор Л., Мартиенссен Р.А. (август 2006 г.). «Нарезка аргонавта необходима для гетерохроматического подавления и распространения». Наука . 313 (5790): 1134–7. Бибкод : 2006Sci...313.1134I . дои : 10.1126/science.1128813 . ПМИД   16931764 . S2CID   42997104 .
  36. ^ miRBase.org
  37. ^ Перейти обратно: а б Фридман Р.К., Фарх К.К., Бердж CB, Бартель Д.П. (январь 2009 г.). «Большинство мРНК млекопитающих являются консервативными мишенями микроРНК» . Геномные исследования . 19 (1): 92–105. дои : 10.1101/гр.082701.108 . ПМЦ   2612969 . ПМИД   18955434 .
  38. ^ Лим Л.П., Лау Н.К., Гарретт-Энгеле П., Гримсон А., Шелтер Дж.М., Касл Дж., Бартель Д.П., Линсли П.С., Джонсон Дж.М. (февраль 2005 г.). «Анализ микрочипов показывает, что некоторые микроРНК подавляют большое количество целевых мРНК». Природа . 433 (7027): 769–73. Бибкод : 2005Natur.433..769L . дои : 10.1038/nature03315 . ПМИД   15685193 . S2CID   4430576 .
  39. ^ Зельбах М., Шванхойссер Б., Тирфельдер Н., Фанг З., Ханин Р., Раевски Н. (сентябрь 2008 г.). «Широко распространенные изменения в синтезе белка, вызванные микроРНК». Природа . 455 (7209): 58–63. Бибкод : 2008Natur.455...58S . дои : 10.1038/nature07228 . ПМИД   18668040 . S2CID   4429008 .
  40. ^ Пэк Д., Виллен Дж., Шин С., Камарго Ф.Д., Гиги С.П., Бартель Д.П. (сентябрь 2008 г.). «Влияние микроРНК на выход белка» . Природа . 455 (7209): 64–71. Бибкод : 2008Natur.455...64B . дои : 10.1038/nature07242 . ПМК   2745094 . ПМИД   18668037 .
  41. ^ Палмеро Э.И., де Кампос С.Г., Кампос М., де Соуза Н.К., Геррейру И.Д., Карвалью А.Л., Маркес М.М. (июль 2011 г.). «Механизмы и роль дерегуляции микроРНК в возникновении и прогрессировании рака» . Генетика и молекулярная биология . 34 (3): 363–70. дои : 10.1590/S1415-47572011000300001 . ПМК   3168173 . ПМИД   21931505 .
  42. ^ Бернштейн С., Бернштейн Х. (май 2015 г.). «Эпигенетическое снижение репарации ДНК при прогрессировании рака желудочно-кишечного тракта» . Всемирный журнал желудочно-кишечной онкологии . 7 (5): 30–46. дои : 10.4251/wjgo.v7.i5.30 . ПМЦ   4434036 . ПМИД   25987950 .
  43. ^ Маффиолетти Э., Тардито Д., Дженнарелли М., Боккио-Кьяветто Л. (2014). «Микрошпионы от мозга к периферии: новые данные исследований микроРНК при нервно-психических расстройствах» . Границы клеточной нейронауки . 8 : 75. дои : 10.3389/fncel.2014.00075 . ПМЦ   3949217 . ПМИД   24653674 .
  44. ^ Меллиос Н., Сур М. (2012). «Новая роль микроРНК при шизофрении и расстройствах аутистического спектра» . Границы в психиатрии . 3 : 39. doi : 10.3389/fpsyt.2012.00039 . ПМК   3336189 . ПМИД   22539927 .
  45. ^ Гиган М., Кэрнс MJ (август 2015 г.). «МикроРНК и посттранскрипционная дисрегуляция в психиатрии» . Биологическая психиатрия . 78 (4): 231–9. doi : 10.1016/j.biopsych.2014.12.009 . hdl : 1959.13/1335073 . ПМИД   25636176 .
  46. ^ Клаттенхофф К., Теркауф В. (январь 2008 г.). «Биогенез и функции зародышевой линии piRNA» . Разработка . 135 (1): 3–9. дои : 10.1242/dev.006486 . ПМИД   18032451 .
  47. ^ Исидзу Х, Сиоми Х, Сиоми MC (ноябрь 2012 г.). «Биология PIWI-взаимодействующих РНК: новое понимание биогенеза и функций внутри и снаружи зародышевых линий» . Гены и развитие . 26 (21): 2361–73. дои : 10.1101/gad.203786.112 . ПМЦ   3489994 . ПМИД   23124062 .
  48. ^ Мэтью П. Скотт; Лодиш, Харви Ф.; Арнольд Берк; Кайзер, Крис; Монти Кригер; Энтони Бретшер; Хидде Плуг; Анжелика Амон (2012). Молекулярно-клеточная биология . Сан-Франциско: WH Freeman. ISBN  978-1-4292-3413-9 .
  49. ^ Вурхув П.М., Агами Р. (январь 2003 г.). «Нокдаун встает». Тенденции в биотехнологии . 21 (1): 2–4. дои : 10.1016/S0167-7799(02)00002-1 . ПМИД   12480342 .
  50. ^ Перейти обратно: а б Караяннис TC, Эль-Оста А (октябрь 2005 г.). «РНК-интерференция и потенциальное терапевтическое применение коротких интерферирующих РНК» . Генная терапия рака . 12 (10): 787–95. дои : 10.1038/sj.cgt.7700857 . ПМИД   15891770 .
  51. ^ Перейти обратно: а б Ким Д.Х., Росси Джей-Джей (март 2007 г.). «Стратегии подавления болезней человека с помощью РНК-интерференции». Обзоры природы Генетика . 8 (3): 173–84. дои : 10.1038/nrg2006 . ПМИД   17304245 . S2CID   5781886 .
  52. ^ Стивенсон М. (октябрь 2004 г.). «Терапевтический потенциал РНК-интерференции». Медицинский журнал Новой Англии . 351 (17): 1772–7. дои : 10.1056/NEJMra045004 . ПМИД   15496626 . S2CID   1531568 .
  53. ^ Перейти обратно: а б с Дэвидсон Б.Л., МакКрей П.Б. (май 2011 г.). «Современные перспективы терапии на основе РНК-интерференции» . Обзоры природы Генетика . 12 (5): 329–40. дои : 10.1038/nrg2968 . ПМЦ   7097665 . ПМИД   21499294 .
  54. ^ «Клинические испытания.gov» . www.clinicaltrials.gov .
  55. ^ Цзэн Ю, Вагнер Э.Дж., Каллен Б.Р. (июнь 2002 г.). «Как природные, так и созданные микроРНК могут ингибировать экспрессию родственных мРНК при экспрессии в клетках человека» . Молекулярная клетка . 9 (6): 1327–33. дои : 10.1016/s1097-2765(02)00541-5 . ПМИД   12086629 .
  56. ^ Пэддисон П.Дж., Коди А.А., Бернштейн Э., Хэннон Г.Дж., Конклин Д.С. (апрель 2002 г.). «Короткие шпильковые РНК (shRNA) вызывают специфичное для последовательности молчание в клетках млекопитающих» . Гены и развитие . 16 (8): 948–58. дои : 10.1101/gad.981002 . ПМЦ   152352 . ПМИД   11959843 .
  57. ^ Дикинс Р.А., Хеманн М.Т., Зилфу Дж.Т., Симпсон Д.Р., Ибарра И., Хэннон Г.Дж., Лоу С.В. (ноябрь 2005 г.). «Изучение фенотипов опухолей с использованием стабильных и регулируемых синтетических предшественников микроРНК». Природная генетика . 37 (11): 1289–95. дои : 10.1038/ng1651 . ПМИД   16200064 . S2CID   15586239 .
  58. ^ Риго Г., Папди С., Сабадос Л. (2012). «Трансформация с использованием системы контролируемой сверхэкспрессии кДНК». Солеустойчивость растений . Методы молекулярной биологии. Том. 913. стр. 277–90. дои : 10.1007/978-1-61779-986-0_19 . ISBN  978-1-61779-985-3 . ПМИД   22895767 .
  59. ^ Сильва Дж.М., Ли М.З., Чанг К., Ге В., Голдинг М.К., Риклз Р.Дж., Сиолас Д., Ху Дж., Пэддисон П.Дж., Шлабах М.Р., Шет Н., Брэдшоу Дж., Берчард Дж., Кулкарни А., Кавет Дж., Сачиданандам Р., МакКомби В.Р. , Клири М.А., Элледж С.Дж., Хэннон Г.Дж. (ноябрь 2005 г.). «Библиотеки shRNA второго поколения, охватывающие геномы мыши и человека». Природная генетика . 37 (11): 1281–8. дои : 10.1038/ng1650 . ПМИД   16200065 . S2CID   17346898 .
  60. ^ Березиков Е., Гурьев В., ван де Бельт Дж., Винхолдс Е., Пластерк Р.Х., Куппен Е. (январь 2005 г.). «Филогенетическое отслеживание и компьютерная идентификация генов микроРНК человека» . Клетка . 120 (1): 21–4. дои : 10.1016/j.cell.2004.12.031 . ПМИД   15652478 . S2CID   16403721 .
  61. ^ Льюис Б.П., Бердж CB, Бартель Д.П. (январь 2005 г.). «Консервативные пары семян, часто окруженные аденозинами, указывают на то, что тысячи человеческих генов являются мишенями микроРНК» . Клетка . 120 (1): 15–20. дои : 10.1016/j.cell.2004.12.035 . ПМИД   15652477 . S2CID   17316349 .
  62. ^ Бошан, TL; Чилдресс, Дж. Ф. (2009). Принципы биомедицинской этики, 6-е изд . Оксфорд: Издательство Оксфордского университета.
  63. ^ Перейти обратно: а б с д Эббесен, Метте; Дженсен, Томас Г.; Андерсен, Свенд; Педерсен, Финн Скоу (25 июня 2008 г.). «Этические перспективы терапии с помощью РНК-интерференции» . Международный журнал медицинских наук . 5 (3): 159–168. дои : 10.7150/ijms.5.159 . ISSN   1449-1907 . ПМЦ   2443345 . ПМИД   18612370 .
  64. ^ Перейти обратно: а б Каллен, Р.К. (2006). «Повышение и подтверждение специфичности экспериментов с РНКи». Природные методы . 3 (9): 677–681. дои : 10.1038/nmeth913 . ПМИД   16929311 . S2CID   13320443 .
  65. ^ Эльбашир, С.М.; Мартинес, Дж; Патканёвска, А; Лендекель, В; Тушль, Т (2001). «Функциональная анатомия миРНК для обеспечения эффективной РНКи в лизате эмбриона Drosophila melanogaster» . Журнал ЭМБО . 20 (23): 6877–88. дои : 10.1093/emboj/20.23.6877 . ПМК   125328 . ПМИД   11726523 .
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=RNA_silencing&oldid=1238849978"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 5a3a4f65acd0a7cea80710908f62d081__1722894600
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/5a/81/5a3a4f65acd0a7cea80710908f62d081.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
RNA silencing - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)