Патч-секвенирование
Патч-секвенирование (patch-seq) — это модификация метода patch-clamp , которая сочетает в себе электрофизиологическую , транскриптомную и морфологическую характеристику отдельных нейронов. При этом подходе цитоплазма нейрона собирается и обрабатывается для RNAseq после проведения на ней электрофизиологических записей. Клетка одновременно заполняется красителем, что позволяет провести последующую морфологическую реконструкцию.
Предыстория [ править ]
Типирование нейрональных клеток требует одновременного сбора нескольких . модальностей данных
Хотя электрические свойства нейрона важны при определении типа клетки, его морфология , типы высвобождаемых нейротрансмиттеров , рецепторы нейромедиаторов нейрона , экспрессируемые в синапсах, а также расположение в нервной системе и его локальная цепь не менее важны. Нейроны бывают самых разных форм, со многими различиями в клеточных телах (сомах) , дендритах и аксонах . Положение дендритов определяет, от каких других нейронов клетка получает входные данные, а их форма может иметь огромное влияние на то, как нейроны реагируют на эти входные данные. Точно так же цели аксона нейрона определяют его выходы. Не менее важны и типы синапсов , образующихся между аксонами и дендритами нейронов. [1] Например, в кортикальной микросхеме коры головного мозга млекопитающих, изображенной справа, клетки имеют весьма специфические паттерны проецирования как внутри локальной цепи, так и в корковых и некортикальных областях. Геометрия дендритов также влияет на электрическое поведение нейронов, оказывая огромное влияние на то, как дендриты обрабатывают входные данные в форме постсинаптических потенциалов . Нарушенная геометрия и модели проецирования связаны с разнообразным набором психиатрических и неврологических заболеваний, включая аутизм и шизофрению, хотя поведенческая значимость этих фенотипов еще не понята. [2] Типы нейрональных клеток, по-видимому, часто постоянно различаются между собой. Предыдущие попытки классификации нейронов по морфоэлектрическим свойствам были ограничены использованием несовместимых методологий и выбором различных клеточных линий. [3]
С появлением секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) появилась надежда, что будут существовать гены, которые будут последовательно экспрессироваться только в нейронах со специфическими, классически определенными свойствами. Эти гены будут служить клеточными маркерами. Это предоставит лучшие средства для быстрого и легкого определения типов нейронов, используя только секвенирование мРНК. Однако оказалось, что scRNA-seq только подтвердил тот факт, что слишком жесткие определения типов клеток не всегда являются лучшим способом охарактеризовать нейроны. [4] Более того, экспрессия генов динамически регулируется, варьируясь в различных временных масштабах в ответ на активность конкретных типов клеток, что обеспечивает пластичность нейронов. [5] [6] Как и в случае с другими тканями, необходимо учитывать процессы развития. [7] Сопоставление результатов scRNA-seq с классически определенными типами нейрональных клеток является очень сложной задачей по всем этим причинам. [8] и, кроме того, секвенирование одноклеточной РНК имеет свои недостатки для классификации нейронов. Хотя scRNA-seq позволяет изучать закономерности экспрессии генов в отдельных нейронах, он разрушает ткань для изоляции отдельных клеток, и поэтому трудно сделать вывод об исходном положении нейрона в ткани или наблюдать его морфологию. Связывание информации секвенирования с подтипом нейронов, определенным ранее электрофизиологическими и морфологическими характеристиками, представляет собой медленный и сложный процесс. [9] Одновременный сбор и интеграция нескольких типов данных с помощью patch-seq делает его идеальным для классификации нейронов, раскрывая новые корреляции между экспрессией генов, электрофизиологическими и морфологическими свойствами и функцией нейронов. [10] Это делает patch-seq поистине междисциплинарным методом, требующим сотрудничества специалистов в области электрофизиологии, секвенирования и визуализации. [10]
Подготовка и выбор модельной системы [ править ]
Patch-seq можно выполнить в любой модельной системе, включая культуру клеток нейронов. Нейроны для культуры могут быть собраны из нейрональной ткани, а затем диссоциированы. [11] или изготовлены из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) , нейронов, выращенных из линий стволовых клеток человека. [12] Подготовка клеточной культуры – это самый простой способ применить патч-зажим, который дает экспериментатору контроль над тем, каким лигандам подвергается нейрон, например, гормонам или нейротрансмиттерам. Однако преимущество полного экспериментального контроля также означает, что нейроны не подвержены воздействию естественной среды, которой они могли бы подвергнуться во время развития. Как упоминалось ранее, положение их дендритов и аксонов, а также положение нейрона в структуре мозга невероятно важно для понимания его роли в цепи. Существует множество препаратов для срезов мозга разных видов животных. [13] [14] Из-за присутствия клеток или мусора на пути пипетки и клетки-мишени препарат необходимо слегка модифицировать; часто к пипетке прикладывают небольшое положительное давление, чтобы предотвратить образование непреднамеренных уплотнений. Если понимание того, как поведение связано с динамикой нейрональных событий, представляет интерес, его можно записывать in vivo и . Хотя адаптация патч-зажима для исследований in vivo может быть очень сложной по механическим причинам, особенно во время поведенческих задач, но это было сделано. [15] автоматизированные методы фиксации патчей in vivo . Были разработаны [16] Между препаратами для видов млекопитающих существует очень небольшая разница, хотя большее разнообразие размеров нейронов в коре головного мозга приматов и приматов может потребовать использования наконечников разного диаметра и давления для формирования уплотнений без уничтожения целевых нейронов. [10] Patch-seq также применяется для исследований, не связанных с нейронами, таких как клетки поджелудочной железы или сердца. [17]
Рабочий процесс секвенирования патчей [ править ]
После выбора модельной системы и типа подготовки эксперименты с патч-секвенированием имеют аналогичный рабочий процесс. Сначала устанавливается герметичность между клеткой и пипеткой, чтобы можно было осуществлять запись и сбор. Клетки могут быть заполнены флуоресцентной меткой для визуализации во время записи. [18] После записи применяется отрицательное давление для захвата цитозоля и часто ядра для секвенирования. Этот процесс повторяется до тех пор, пока клетки препарата не деградируют и из них не будет смысла собирать данные. Последующий анализ данных визуализации позволяет провести морфологическую реконструкцию. Аналогично, часто требуется сложная сложная последующая обработка транскриптомных данных, чтобы справиться с большим количеством ошибок при сборе цитозольного содержимого из клеток с помощью пипетки. [19] [20] [21] На начальных этапах, перед формированием уплотнения между пипеткой и клеткой, срезы ткани готовят с помощью компресстома- вибратома . Для получения тонких срезов ткани используют эти устройства. Это устройство гарантирует, что клетки-мишени доступны для фиксации патчем. Качество и точность нарезки ткани важны для успеха эксперимента patch-seq. Толщина и состояние этих срезов ткани влияют на эффективность нацеливания на клетки и качество приклеивания пластыря. Соответствующая подготовка срезов имеет важное значение для общего успеха рабочего процесса patch-seq. [22]
Формирование уплотнения между пипеткой и клеткой [ править ]
Патч-пипетка предназначена для регистрации целых клеток, поэтому диаметр ее отверстия больше, чем в экспериментах, проводимых для изучения одиночных ионных каналов. По большей части можно использовать стандартные протоколы патч-клампа, хотя есть некоторые небольшие модификации пипетки и внутреннего раствора, зависящие от ситуации. Можно использовать еще более широкий диаметр, чтобы облегчить аспирацию внутренней части клетки в пипетку, но его, возможно, придется отрегулировать в зависимости от типа клетки-мишени. [23] Отрицательное давление применяется для улучшения уплотнения, что будет лучше для регистрации, а также для предотвращения утечки и загрязнения внутриклеточной жидкости после или во время сбора содержимого клеток для секвенирования. Во время записи биотин можно диффундировать в клетку с помощью пипетки для визуализации и последующей морфологической реконструкции. [18]
Электрофизиологическая запись [ править ]
После того, как герметизация установлена, клетки подвергаются различным режимам стимуляции с использованием зажима напряжения , таким как линейное изменение, прямоугольные импульсы и инъекции шумного тока. Регистрируются особенности мембраны тела клетки, включая мембранный потенциал покоя и пороговый потенциал . особенности, наблюдаемые при генерируемых потенциалах действия (ПД), такие как ширина ПД, амплитуда ПД, амплитуда после деполяризации и после гиперполяризации. Также регистрируются [3] [9] Запись цельных клеток выполняется с использованием пипеток для кодирования патчей, наполненных небольшим объемом внутриклеточного раствора (во избежание разбавления РНК), хелаторов кальция, носителей РНК и ингибиторов РНКазы. [10] Добавление ингибиторов РНКазы, таких как EGTA, улучшает анализ транскриптома за счет сохранения РНК более высокого качества из образцов. [9] Время записи может занимать от 1 до 15 минут, не затрагивая структуру нейрона из-за отека, при этом более низкие значения увеличивают производительность метода. [14] Данные записываются и анализируются с помощью коммерческого программного обеспечения или программного обеспечения с открытым исходным кодом, такого как MIES, [3] [24] УЗЕЛОЧНЫЙ МАСТЕР, [25] pЗАЖИМ, [26] ВолнаСерфер, [27] среди других.
Нейроны предварительно стимулируются для проверки их мембранного потенциала покоя и стабилизации их базового уровня во время экспериментов. Затем клетки стимулируют пилообразным и прямоугольным током, их электрофизиологические свойства регистрируются и измеряются. После стимула мембранный потенциал должен вернуться к исходному значению, чтобы записи были последовательными и надежными. В конце записи используется отрицательное давление, чтобы вернуть стабильность мембраны. Измерения должны удовлетворять этим условиям, чтобы их можно было рассматривать для дальнейшего анализа. [14] Во время записи необходимо поддерживать жизнеспособность клеток, поскольку зажатие патчем является стрессом для клетки.
Крайне важно иметь здоровые острые или живые срезы мозга для электрофизиологических записей, поскольку здоровье нейрона существенно влияет на качество полученных данных. Срезы здорового мозга обычно готовят с использованием таких инструментов, как вибратом Compresstome, что обеспечивает оптимальные условия для точных и надежных записей. [28]
Извлечение ядра [ править ]
Отрицательное давление используется для перемещения ядра вблизи кончика пипетки при перемещении электрода вблизи центра сомы. Рассматриваемая модельная система будет влиять на создаваемое отрицательное давление. У человека и приматов, не являющихся человеком, жизнеспособность клеток обеспечить труднее. Большие различия в размере нейронов по сравнению с моделями на грызунах означают большую вариабельность величины отрицательного давления, необходимого для извлечения цитозоля и ядра. [10] После извлечения пипетку медленно втягивают, поддерживая отрицательное давление, пока мембрана, окружающая ядро, не отрывается от клетки, а кончик образует мембранное уплотнение. Мембранное уплотнение удерживает содержимое, извлеченное из пипетки, и предотвращает загрязнение во время удаления для секвенирования перед подготовкой пипетки к следующей записи. За конструкцией уплотнения можно наблюдать электрически по увеличению сопротивления (МОм). [14] Процесс извлечения медленный, часто занимает около десяти минут, поскольку необходима точность, чтобы не разрушить ячейку. [14]
Транскриптомика [ править ]
Анализ РНК-seq проводится с использованием ядра и цитозоля, извлеченных из зарегистрированных нейронов. [9] [14] РНК амплифицируют до полноразмерной кДНК и создают библиотеки для секвенирования. Анализы, включающие ядро, не только дают более высокий выход мРНК, но и повышают качество данных. [3]
Образцы демонстрируют высокую степень изменчивости содержания РНК, в некоторых случаях включая загрязнение РНК из соседних клеток, таких как астроциты или другие типы нейронов. Качество оценивается по определенным маркерным генам, указывающим, включает ли содержание РНК мишени интересующего класса клеток ( маркер ) и не содержит каких-либо маркеров загрязнения ( маркер выключен ). [14] Для оценки качества собранной РНК используются различные показатели.
- Нормализованная сумма маркеров (NMS): соотношение включенных маркерных генов из клеток patch-seq относительно медианы экспрессии тех же генов из аналогичных данных с использованием методов клеточной диссоциации, таких как сортировка клеток, активируемая флуоресценцией ( FACS ). Методы клеточной диссоциации уменьшили технические проблемы и действуют как метод стандартизации. [19] Оценка измеряет сходство экспрессии генов в образце с известным классом клеток. Более низкие показатели NMS указывают на снижение обнаружения маркерных генов в большей степени, чем на увеличение немаркерных генов. [14]
- Оценка загрязнения: указывает на вероятность загрязнения РНК из близлежащих клеток во время экстракции. Загрязнение может возникнуть в результате перемещения пипетки к соме при взаимодействии с другими нейрональными отростками. [19] Он рассчитывается как сумма баллов NMS для всех широких типов ячеек, которые не соответствуют назначенному классу ячеек.
- Показатель качества: измеряет корреляцию между включенными и выключенными маркерными генами на основе результата patch-seq со средним профилем экспрессии клеток, проанализированных с использованием методов клеточной диссоциации того же типа. [14]
- Маркеры присутствия ядра: обнаружение ядерно-специфичных генов (таких как Malat1 у млекопитающих). [19] [29] и повышенное соотношение интронных считываний свидетельствуют о включении ядра в анализ секвенирования РНК.
Морфологическая реконструкция [ править ]
Форма и структура нейрона, такие как ветвление дендритов/аксонов, геометрия аксонов, синаптические контакты и расположение сомы, используются для классификации типов нейронов. При приготовлении острых срезов или in vivo отмечается ламинарное положение, поскольку оно также имеет важные функциональные последствия. Окрашивание биотином осуществляется во время электрофизиологической регистрации нейронов. [30] Альтернативно , добавление родамина вне клетки позволяет представить себе живую клетку перед записью. [31] Визуализация осуществляется с помощью двумерных мозаичных изображений с помощью светлопольных каналов передачи и флуоресценции на отдельных клетках, а затем обрабатывается в коммерческом программном обеспечении или программном обеспечении с открытым исходным кодом. [14] Изображения с более высоким разрешением могут быть получены из культивируемых нейронов по сравнению с острыми срезами, что дает более качественные морфологические реконструкции. [10]
Апостериорная 3D-реконструкция выполняется с помощью программного обеспечения для обработки изображений, такого как TReMAP. [32] Мозг, [33] или Ваа3D. [34] Качество результата зависит от множества факторов, от времени электрофизиологической записи до процедуры извлечения ядра. Реконструированные клетки затем классифицируются по четырем уровням качества в зависимости от их целостности и полноты структуры. Высокое качество , если сомы и отростки полностью видны и возможна правильная цифровая реконструкция, среднее качество, если сомы и некоторые отростки видны, но несовместимы с 3D-реконструкцией, недостаточный аксон , где дендриты заполнены биотином, но аксоны слабо окрашены, и не удалось заполнить у которых отсутствует окрашивание сомы, вероятно, из-за проседания структуры после извлечения ядра. [14]
данных Анализ последующих
Разработка рабочего процесса обработки и объединения полученных мультимодальных данных зависит от конкретного исследовательского вопроса, к которому применяется patch-seq. В исследованиях типирования клеток данные следует сравнивать с существующими исследованиями scRNA-seq с большими размерами выборки (порядка тысяч клеток по сравнению с десятками или сотнями) и, следовательно, с большей статистической мощностью для идентификации типа клеток с использованием только транскриптомных данных. Для этого шага достаточно методов, основанных на корреляции. [3] [35] Затем можно использовать методы уменьшения размерности, такие как стохастическое встраивание T-распределенных соседей или аппроксимация и проекция равномерного многообразия для визуализации положения собранных данных в эталонном атласе данных scRNA-seq более высокого качества. [36] Машинное обучение может применяться для того, чтобы связать данные об экспрессии генов с морфологическими и электрофизиологическими данными. Методы для этого включают автоэнкодеры , [37] узкие сети , [38] или другие методы понижения ранга. [36] Включение морфологических данных оказалось сложной задачей, поскольку это задача компьютерного зрения , общеизвестно сложная проблема в машинном обучении . Трудно представить данные визуализации морфологических реконструкций как вектор признаков для включения в анализ. [10]
Приложения [ править ]
Интегративный набор данных Patch-seq позволяет всесторонне охарактеризовать типы клеток, особенно в нейронах. Нейробиологи применили этот метод к множеству экспериментов и протоколов для открытия новых подтипов клеток на основе корреляций между транскриптомными данными и морфоэлектрическими свойствами нейронов. Применяя машинное обучение к данным patch-seq, можно изучить транскриптомные данные и связать их с соответствующими морфоэлектрическими свойствами. [10] Наличие подтвержденной истины для надежной классификации типов клеток позволяет исследователям изучить функцию конкретных типов и подтипов нейронов в сложных процессах, таких как поведение, речь и основные процессы при неврологических и психиатрических заболеваниях. Сравнение протеомики с транскриптомикой показало, что данные транскрипции не обязательно трансформируются в одну и ту же экспрессию белка. [39] Точно так же для нейронауки важна возможность взглянуть на основную истину о фенотипе нейрона с помощью классических методов классификации в сочетании с транскриптомными данными. Были обнаружены эксперименты Patch-seq, которые подтверждают транскриптомные результаты, но в других случаях были обнаружены случаи, когда морфология схожих транскриптомно определенных типов клеток в разных областях мозга не совпадала. [10] Этот метод особенно хорошо подходит для нейробиологии, но в целом любая ткань, где интересно одновременно изучить электрофизиологию, морфологию и транскриптомику, может найти применение для патч-секвенирования. Например, patch-seq также применялся к ненейрональным тканям, таким как островки поджелудочной железы, для изучения диабета. [17]
- Целевые исследования популяций нейронов: Patch-seq превосходит другие методологии в своей способности измерять и извлекать генетическую информацию из целевых нейронов без необходимости разрушения образца. Это позволяет точно проследить транскриптомные данные до свойств нейрона, таких как его связность, расположение в срезе, морфология. Исследования корреляции между этими типами данных помогают идентифицировать гены дифференциальной экспрессии в разных типах нейронов и обнаружить генетические маркеры для быстрой классификации. [10]
- Составление и интеграция баз данных мультимодальных типов клеток: Patch-seq использовался для интеграции функциональных характеристик нейронов в большие базы данных транскрипции из исследований секвенирования одноклеточной РНК. Patch-seq может предоставить электрофизиологические и морфологические данные, при этом морфология встречается реже из-за сложности достижения высоких стандартов качества. [14] Интеграция мультимодальных данных необходима, поскольку правильную маркировку типов ячеек невозможно получить только на основе одного типа данных. Предыдущие исследования показали, что транскриптомно сходные нейроны могут иметь разные морфоэлектрические характеристики. [40]
- Молекулярная основа морфологического и функционального разнообразия. Исследования молекулярных механизмов, определяющих морфологическое и функциональное разнообразие нейронов, продолжаются. Patch-seq позволяет идентифицировать дифференциально экспрессируемые гены между известными различными типами клеток. Небольшие изменения в экспрессии генов могут привести к тому, что клетки будут проявлять различную реакцию на стимулы, что подчеркивает важность корреляции этих данных для правильной классификации. [41]
Ограничения [ править ]
Самым серьезным ограничением для патч-секвенирования является ограничение, которое обычно характерно для методов патч-клампа, а именно требование высокой точности и ловкости ручного труда. Зажим заплатки называют формой искусства и требует практики для совершенствования техники. Таким образом, это не только трудоемко, но и требует многих лет обучения, чтобы отточить технику. [42] [43] мышей На сегодняшний день самое крупное исследование patch-seq было проведено на острых корковых срезах первичной зрительной коры . Было собрано и секвенировано чуть более 4000 нейронов, и эта работа потребовала огромного количества ручного труда. [14] Большинство других наборов данных были собраны из десятков или сотен ячеек. Значительно меньше, чем клетки, собранные для секвенирования путем диссоциации ткани. [10] Тем не менее, ни один другой метод электрофизиологической регистрации не может сравниться с Patch-Seq по временному разрешению или способности характеризовать определенные ионные токи, а также не обеспечивает возможности создания фиксации напряжения. По этим причинам автоматизация этого метода является областью активных исследований во многих лабораториях по всему миру для применения с использованием патч-фиксации, включая патч-секвенирование.
Морфологическая реконструкция с помощью цифровых изображений является еще одним ограничением метода: процент прохождения часто ниже 50%. [14] Правильная интеграция огромного количества изображений с большим количеством шума и структурных нарушений, вызванных извлечением ядер, делает это вычислительной проблемой в нейробиологии. Разрабатываются новые методы автоматического отслеживания, но качество остается низким. [44]
Будущие направления [ править ]
Интеграция других технологий секвенирования, протеомики и генетических манипуляций с . клетками отдельными
До сих пор единственной используемой технологией секвенирования было секвенирование мРНК. Включение других модальностей также увеличит количество « омиков », включенных в генерируемые данные. Например, метод отделения мРНК от ДНК может позволить изучать модификации ДНК. [23] О доступности хроматина можно судить по метилированию ДНК и использованию иммунопреципитации метилированной ДНК , а также ацетилированию и деацетилированию гистонов по данным секвенирования ChIP . Это позволит изучать эпигенетику в экспериментах с патч-секвенированием. Аналогичным образом разделение белков было бы полезно для оценки их содержания, что позволило бы интегрировать их с протеомикой . CRISPR можно было бы включить в пипетку и вводить во время записи, чтобы изучить эффекты мутации на уровне отдельных клеток. [10]
Автоматическое исправление [ править ]
Самым большим препятствием для производительности патч-секвенирования является труд, необходимый для зажима патча. постепенно Автоматический зажим пластырей становится нормой, но пока еще не получил широкого распространения. И это несмотря на то, что некоторые установки с автоматическим определением траектории имеют более высокий уровень успешных попыток запечатывания и скорость сбора данных, чем люди. Автоматическое закрепление заплаты может осуществляться вслепую без получения информации о визуализации, вместо этого полагаясь на датчики давления, которые будут предоставлять входные данные для алгоритмов, управляющих роботизированными установками для формирования печатей и записи. Альтернативно существуют алгоритмы, управляемые изображением, которые позволяют нацеливаться на флуоресцентно меченные клетки. Некоторые системы лучше подходят для конкретных модельных систем и препаратов. [43] [1]
См. также [ править ]
- Патч-зажим
- Одноклеточные омики
- Одноклеточное секвенирование
- РНК-Seq
- MAP-Seq
- Нейроморфология
- Отслеживание нейронов
- Электрофизиология
- Автоматический зажим патча
Ссылки [ править ]
- ^ Ларсен, Райлан С; Сьёстрем, П. Йеспер (01 декабря 2015 г.). «Пластичность, специфичная для типа синапса, в локальных цепях» . Современное мнение в нейробиологии . Пластичность схемы и память. 35 : 127–135. дои : 10.1016/j.conb.2015.08.001 . ISSN 0959-4388 . ПМК 5280068 . ПМИД 26310110 .
- ^ Патания, М.; Давенпорт, ЕС; Мьюир, Дж.; Шихан, DF; Лопес-Доменек, Г.; Киттлер, JT (март 2014 г.). «Ген CYFIP1, связанный с аутизмом и шизофренией, имеет решающее значение для поддержания сложности дендритов и стабилизации зрелых шипов» . Трансляционная психиатрия . 4 (3): е374. дои : 10.1038/tp.2014.16 . ISSN 2158-3188 . ПМК 3966042 . ПМИД 24667445 .
- ^ Перейти обратно: а б с д Это Гувенс, Натан В.; Соренсен, Стейси А.; Берг, Джим; Ли, Чангю; Ярски, Тим; Тинг, Джонатан; Санкин, Сьюзен М.; Фэн, Дэвид; Анастасиу, Костас; Баркан, Элиза; Бикли, Крис (17 июля 2018 г.). «Классификация электрофизиологических и морфологических типов зрительной коры мыши» . bioRxiv : 368456. doi : 10.1101/368456 . S2CID 91601091 .
- ^ Цембровский, Марк С.; Менон, Вилас (01.06.2018). «Непрерывное изменение типов клеток нервной системы». Тенденции в нейронауках . 41 (6): 337–348. дои : 10.1016/j.tins.2018.02.010 . ISSN 0166-2236 . ПМИД 29576429 . S2CID 4338758 .
- ^ Хрватин, Синиша; Хохбаум, Дэниел Р.; Надь, М. Аурель; Чикконе, Марсело; Робертсон, Кейрамари; Чидл, Лукас; Зилионис, Раполас; Ратнер, Алекс; Борхес-Монрой, Ребека; Кляйн, Аллон М.; Сабатини, Бернардо Л. (январь 2018 г.). «Одноклеточный анализ зависимых от опыта транскриптомных состояний в зрительной коре мыши» . Природная неврология . 21 (1): 120–129. дои : 10.1038/s41593-017-0029-5 . ISSN 1546-1726 . ПМК 5742025 . ПМИД 29230054 .
- ^ Да, И-Линн; Гринберг, Майкл Э. (24 октября 2018 г.). «Транскрипция, регулируемая активностью: устранение разрыва между нейронной активностью и поведением» . Нейрон . 100 (2): 330–348. дои : 10.1016/j.neuron.2018.10.013 . ISSN 0896-6273 . ПМК 6223657 . ПМИД 30359600 .
- ^ Флеминг, Анджелин; Рубинштейн, Дэвид К. (01 октября 2020 г.). «Аутофагия в развитии нейронов и пластичности» . Тенденции в нейронауках . 43 (10): 767–779. doi : 10.1016/j.tins.2020.07.003 . ISSN 0166-2236 . ПМИД 32800535 . S2CID 221106496 .
- ^ Джонсон, Мэтью Б; Уолш, Кристофер А. (01 февраля 2017 г.). «Разнообразие и развитие нейронов коры головного мозга при разрешении отдельных клеток» . Современное мнение в нейробиологии . Развивающая нейробиология. 42 : 9–16. дои : 10.1016/j.conb.2016.11.001 . ISSN 0959-4388 . ПМЦ 5316371 . ПМИД 27888678 .
- ^ Перейти обратно: а б с д Кэдвелл, Кэтрин Р.; Паласантца, Афанасия; Цзян, Сяолун; Беренс, Филипп; Дэн, Цяолинь; Йылмаз, Марлен; Реймер, Джейкоб; Шен, Шан; Бетге, Матиас; Толиас, Кимберли Ф; Сандберг, Рикард (февраль 2016 г.). «Электрофизиологическое, транскриптомное и морфологическое профилирование отдельных нейронов с использованием Patch-seq» . Природная биотехнология . 34 (2): 199–203. дои : 10.1038/nbt.3445 . ISSN 1087-0156 . ПМК 4840019 . ПМИД 26689543 .
- ^ Перейти обратно: а б с д Это ж г час я дж к л Липовсек, Марсела; Барди, Седрик; Кэдвелл, Кэтрин Р.; Хэдли, Кристен; Кобак Дмитрий; Трипати, Шриджой Дж. (3 февраля 2021 г.). «Patch-seq: прошлое, настоящее и будущее» . Журнал неврологии . 41 (5): 937–946. doi : 10.1523/JNEUROSCI.1653-20.2020 . ISSN 0270-6474 . ПМЦ 7880286 . ПМИД 33431632 .
- ^ ЯЗАВА, Кадзуто; КАЙБАРА, Мунэсигэ; ОХАРА, Масахиро; КАМЕЯМА, Масаки (1990). «Улучшенный метод выделения кардиомиоцитов, полезный для исследований с использованием патч-клампа» . Японский журнал физиологии . 40 (1): 157–163. дои : 10.2170/jjphysicalol.40.157 . ISSN 0021-521X . ПМИД 2163463 .
- ^ Белинский, Гленн С.; Рич, Мэтью Т.; Сируа, Карисса Л.; Короткая, Шайна М.; Педроса, Эрика; Лахман, Герберт М.; Антич, Срджан Д. (01 января 2014 г.). «Патч-кламп-записи и визуализация кальция с последующей ПЦР отдельных клеток раскрывают профиль развития 13 генов в нейронах человека, полученных из ИПСК» . Исследования стволовых клеток . 12 (1): 101–118. дои : 10.1016/j.scr.2013.09.014 . ISSN 1873-5061 . ПМЦ 3947234 . ПМИД 24157591 .
- ^ Кэдвелл, Кэтрин Р.; Скала, Федерико; Ли, Шуан; Ливрицци, Джулия; Шен, Шан; Сандберг, Рикард; Цзян, Сяолун; Толиас, Андреас С. (декабрь 2017 г.). «Мультимодальное профилирование морфологии, электрофизиологии и экспрессии генов одиночных клеток с использованием Patch-seq» . Протоколы природы . 12 (12): 2531–2553. дои : 10.1038/nprot.2017.120 . ISSN 1750-2799 . ПМК 6422019 . ПМИД 29189773 .
- ^ Перейти обратно: а б с д Это ж г час я дж к л м н Ли, Брайан Р.; Будзилло, Агата; Хэдли, Кристен; Миллер, Джереми А.; Ярски, Тим; Бейкер, Кэтрин; Хилл, ДиДжон; Ким, Лиза; Манн, Расти; Нг, Линдси; Олдре, Аарон (04 декабря 2020 г.). «Масштабная, высокоточная электрофизиологическая, морфологическая и транскриптомная характеристика клеток» . bioRxiv : 2020.11.04.369082. дои : 10.1101/2020.11.04.369082 . S2CID 229297384 .
- ^ Ли, Альберт К.; Маннс, Ян Д.; Сакманн, Берт; Брехт, Майкл (август 2006 г.). «Целоклеточные записи у свободно движущихся крыс» . Нейрон . 51 (4): 399–407. дои : 10.1016/j.neuron.2006.07.004 . ПМИД 16908406 . S2CID 13524757 .
- ^ Кодандарамайя, Сухаса Б.; Францези, Джованни Талей; Чоу, Брайан Ю.; Бойден, Эдвард С.; Форест, Крейг Р. (июнь 2012 г.). «Автоматизированная цельноклеточная электрофизиология нейронов in vivo» . Природные методы . 9 (6): 585–587. doi : 10.1038/nmeth.1993 . ISSN 1548-7105 . ПМЦ 3427788 . ПМИД 22561988 .
- ^ Перейти обратно: а б Камунас-Солер, Жоан; Дай, Сяо-Цин; Постой, Ян; Баутиста, Остин; Лион, Джеймс; Сузуки, Кунимаса; Ким, Сын К.; Землетрясение, Стивен Р.; Макдональд, Патрик Э. (05 мая 2020 г.). «Patch-Seq связывает одноклеточные транскриптомы с дисфункцией островков человека при диабете» . Клеточный метаболизм . 31 (5): 1017–1031.e4. doi : 10.1016/j.cmet.2020.04.005 . ISSN 1550-4131 . ПМЦ 7398125 . ПМИД 32302527 .
- ^ Перейти обратно: а б Кэдвелл, Кэтрин Р.; Скала, Федерико; Ли, Шуан; Ливрицци, Джулия; Шен, Шан; Сандберг, Рикард; Цзян, Сяолун; Толиас, Андреас С. (декабрь 2017 г.). «Мультимодальное профилирование морфологии, электрофизиологии и экспрессии генов одиночных клеток с использованием Patch-seq» . Протоколы природы . 12 (12): 2531–2553. дои : 10.1038/nprot.2017.120 . ISSN 1754-2189 . ПМК 6422019 . ПМИД 29189773 .
- ^ Перейти обратно: а б с д Трипати, Шриджой Дж.; Токер, Лайла; Бомкамп, Клэр; Манкарчи, Б. Оган; Бельмадани, Мануэль; Павлидис, Пол (2018). «Оценка качества транскриптома в наборах данных Patch-Seq» . Границы молекулярной нейронауки . 11 : 363. doi : 10.3389/fnmol.2018.00363 . ISSN 1662-5099 . ПМК 6187980 . ПМИД 30349457 .
- ^ Липовсек, М.; Барди, К.; Кадвелл, Чехия; Хэдли, К.; Кобак Д.; Трипатия, SJ (2021). «Patch-seq: прошлое, настоящее и будущее» . Журнал неврологии . 41 (5): 937–946. doi : 10.1523/JNEUROSCI.1653-20.2020 . ПМЦ 7880286 . ПМИД 33431632 .
- ^ Трипати, Шриджой Дж.; Токер, Лайла; Бомкамп, Клэр; Манкарчи, Б. Оган; Бельмадани, Мануэль; Павлидис, Пол (2018). «Оценка качества транскриптома в наборах данных Patch-Seq» . Границы молекулярной нейронауки . 11 : 363. doi : 10.3389/fnmol.2018.00363 . ПМК 6187980 . ПМИД 30349457 .
- ^ Махфуз, Кашиф; Эллендер, Томмас Дж. (2021). «Объединение записей пэтч-клампов целых клеток с секвенированием одноклеточной РНК» . Патч-кламп Электрофизиология . Методы молекулярной биологии. Том. 2188. стр. 179–189. дои : 10.1007/978-1-0716-0818-0_9 . ISBN 978-1-0716-0817-3 . ПМИД 33119852 . S2CID 226203486 .
- ^ Перейти обратно: а б Липовсек, Марсела; Браун, Лоркан; Грабб, Мэтью С. (декабрь 2020 г.). «Протокол Patch-Seq малых интернейронов» . STAR-протоколы . 1 (3): 100146. doi : 10.1016/j.xpro.2020.100146 . ISSN 2666-1667 . ПМЦ 7757288 . ПМИД 33377040 .
- ^ Симан, Стефани С; Кампаньола, Люк; Давудян, Паша А; Хоггарт, Алекс; Хейдж, Трэвис А; Босма-Муди, Алиса; Бейкер, Кристофер А; Ли, Чон Хун; Михалас, Стефан; Титер, Коринн; Ко, Эндрю Л. (26 сентября 2018 г.). Слуцкий, Инна; Мардер, Ева; Сьёстрем, Пер Йеспер (ред.). «Редкие рекуррентные возбуждающие связи в микросхеме коры головного мозга взрослой мыши и человека» . электронная жизнь . 7 : е37349. дои : 10.7554/eLife.37349 . ISSN 2050-084X . ПМК 6158007 . ПМИД 30256194 .
- ^ «HEKA Elektronik — Загрузите последнюю версию программного обеспечения, драйверы оборудования и руководства» . www.heka.com . Проверено 24 февраля 2021 г.
- ^ «Комплект программного обеспечения pCLAMP 11» . Молекулярные устройства . Проверено 24 февраля 2021 г.
- ^ «WaveSurfer | Исследовательский кампус Джанелии» . www.janelia.org . Проверено 24 февраля 2021 г.
- ^ Фонтейн, Р.; Ходне, К.; Вельциен, ФА (2018). «Здоровые срезы мозга и гипофиза для электрофизиологических исследований клеток гипофиза костистых рыб» . Журнал визуализированных экспериментов (138). дои : 10.3791/57790 . ПМК 6126815 . ПМИД 30176004 .
- ^ Хатчинсон, Джон Н.; Энсмингер, Александр В.; Клемсон, Кристин М.; Линч, Кристофер Р.; Лоуренс, Жанна Б.; Шахматы, Эндрю (01 февраля 2007 г.). «Скрининг ядерных транскриптов идентифицирует две связанные некодирующие РНК, связанные с доменами сплайсинга SC35» . БМК Геномика . 8 (1): 39. дои : 10.1186/1471-2164-8-39 . ISSN 1471-2164 . ПМК 1800850 . ПМИД 17270048 .
- ^ Фельдмейер, Дирк; Эггер, Вероника; Любке, Иоахим; Сакманн, Берт (15 ноября 1999 г.). «Надежные синаптические связи между парами нейронов возбуждающего слоя 4 в пределах одной «бочки» развивающейся соматосенсорной коры головного мозга крысы» . Журнал физиологии . 521 (Часть 1): 169–190. дои : 10.1111/j.1469-7793.1999.00169.x . ISSN 0022-3751 . ПМК 2269646 . ПМИД 10562343 .
- ^ ван ден Херк, Марк; Эрвин, Дженнифер А.; Йео, Джин В.; Гейдж, Фред Х.; Барди, Седрик (10 августа 2018 г.). «Протокол Patch-Seq для анализа электрофизиологии, морфологии и транскриптома целых одиночных нейронов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека» . Границы молекулярной нейронауки . 11 : 261. doi : 10.3389/fnmol.2018.00261 . ISSN 1662-5099 . ПМК 6096303 . ПМИД 30147644 .
- ^ Чжоу, Чжи; Лю, Сяосяо; Лонг, Брайан; Пэн, Ханьчуань (01 января 2016 г.). «TReMAP: автоматическая 3D-реконструкция нейронов на основе отслеживания, обратного картирования и сборки 2D-проекций» . Нейроинформатика . 14 (1): 41–50. дои : 10.1007/s12021-015-9278-1 . ISSN 1559-0089 . ПМИД 26306866 . S2CID 9636781 .
- ^ Роскамс, Джейн; Попович, Зоран (2 ноября 2016 г.). «Власть людям: решение проблем, связанных с большими данными в неврологии, путем создания новых кадров гражданских нейробиологов» . Нейрон . 92 (3): 658–664. дои : 10.1016/j.neuron.2016.10.045 . ISSN 0896-6273 . ПМИД 27810012 . S2CID 23704393 .
- ^ Пэн, Ханьчуань; Жуань, Цзунцай; Лонг, Фухуэй; Симпсон, Джули Х.; Майерс, Юджин В. (апрель 2010 г.). «V3D обеспечивает 3D-визуализацию в реальном времени и количественный анализ крупномасштабных наборов данных биологических изображений» . Природная биотехнология . 28 (4): 348–353. дои : 10.1038/nbt.1612 . ISSN 1087-0156 . ПМЦ 2857929 . ПМИД 20231818 .
- ^ Фузик, Янош; Рехман, Сабах; Гирач, Фатима; Миклоши, Андрас Г.; Корчинская, Соломия; Арк, Глория; Романов Роман А.; Ханичс, Янош; Вагнер, Людвиг; Мелетида, Константинос; Янагава, Ючио (17 декабря 2019 г.). «Генетическое картирование всего мозга идентифицирует indusium griseum как пренатальную мишень для фармакологически несвязанных психостимуляторов» . Труды Национальной академии наук . 116 (51): 25958–25967. Бибкод : 2019PNAS..11625958F . дои : 10.1073/pnas.1904006116 . ISSN 0027-8424 . ПМК 6929682 . ПМИД 31796600 .
- ^ Перейти обратно: а б Кобак Дмитрий; Бернартс, Ив; Вайс, Марисса А.; Скала, Федерико; Толиас, Андреас; Беренс, Филипп (14 апреля 2020 г.). «Разреженная регрессия пониженного ранга для исследовательской визуализации парных многомерных наборов данных» . bioRxiv : 302208. doi : 10.1101/302208 . S2CID 90792329 .
- ^ Гала, Рохан; Гувенс, Натан; Яо, Цзычжэнь; Будзилло, Агата; Пенн, Оснат; Ташич, Босилька; Мерфи, Гейб; Цзэн, Хункуй; Сюмбюль, Уйгар (05.11.2019). «Подход совмещенного автоэнкодера для мультимодального анализа типов клеток». arXiv : 1911.05663 [ q-bio.NC ].
- ^ Бернартс, Ив; Беренс, Филипп; Кобак Дмитрий (18.06.2020). «Разреженные сети с узкими местами для исследовательского анализа и визуализации данных нейронного патч-секвенирования». arXiv : 2006.10411 [ cs.LG ].
- ^ Шпехт, Харрисон; Эммотт, Эдвард; Петельский, Александра А.; Хаффман, Р. Грей; Перлман, Дэвид Х.; Серра, Марко; Харченко Петр; Коллер, Антониус; Славов, Николай (27 января 2021 г.). «Одноклеточный протеомный и транскриптомный анализ гетерогенности макрофагов с использованием SCoPE2» . Геномная биология . 22 (1): 50. дои : 10.1186/s13059-021-02267-5 . ISSN 1474-760X . ПМЦ 7839219 . ПМИД 33504367 .
- ^ Скала, Ф.; Кобак Д.; Шан, С.; Бернартс, Ю.; Латурнус, С.; Кадвелл, Чехия; Хартманис, Л.; Фрударакис, Э.; Кастро, Дж.; Тан, З.Х.; Пападопулос, С. (11 апреля 2019 г.). «Неокортикальный слой 4 у взрослой мыши различается по основным типам клеток и организации цепей между первичными сенсорными областями» . bioRxiv : 507293. doi : 10.1101/507293 . S2CID 91269384 .
- ^ Олах, Виктор Янош; Лукачович, Дэвид; Винтерер, Йохен; Арсовский, Антония; Лоринц, Андреа; Нуссер, Золтан; Фёлди, Чаба; Сабадич, Янош (2020). «Функциональная спецификация интернейронов CCK+ альтернативными изоформами вспомогательных субъединиц Kv4.3» . электронная жизнь . 9 . doi : 10.7554/eLife.58515 . ISSN 2050-084X . ПМЦ 7269670 . ПМИД 32490811 .
- ^ Пеннер, Рейнхольд (1995), «Практическое руководство по фиксации патчей» , Одноканальная запись , Бостон, Массачусетс: Springer US, стр. 3–30, doi : 10.1007/978-1-4419-1229-9_1 , ISBN 978-1-4419-1230-5 , получено 25 февраля 2021 г.
- ^ Перейти обратно: а б Сук, Хо-Джун; Бойден, Эдвард С.; ван Вели, Ингрид (октябрь 2019 г.). «Достижения в области автоматизации технологии цельноклеточных патч-зажимов» . Журнал методов нейробиологии . 326 : 108357. doi : 10.1016/j.jneumeth.2019.108357 . ISSN 0165-0270 . ПМИД 31336060 . S2CID 198192157 .
- ^ Лю, Сики; Чжан, Дунхао; Сун, Ян; Пэн, Ханьчуань; Цай, Вэйдун (27 ноября 2017 г.). «Автоматическое 3D-отслеживание нейронов с точным стиранием ветвей и уверенным обратным отслеживанием» . bioRxiv : 109892. doi : 10.1101/109892 . S2CID 195961934 .