seqNAME

нуклеосом используемый Заселенность и ( секвенирование метиломов геномный NOMe -seq ) — это метод, для одновременного определения положения нуклеосом и метилирования ДНК . [ 1 ] Этот метод является расширением бисульфитного секвенирования , которое является золотым стандартом для определения метилирования ДНК. [ 2 ] NOMe-seq основан на метилтрансферазе M.CviPl, которая метилирует цитозины GpC в динуклеотидах , несвязанных нуклеосомами или другими белками , создавая нуклеосомный след. Геном млекопитающих , поэтому естественным образом содержит метилирование ДНК, но только в сайтах CpG метилирование GpC можно отличить от метилирования генома после бисульфитного секвенирования. Это позволяет одновременно анализировать нуклеосомный след и эндогенное метилирование на одних и тех же молекулах ДНК . [ 1 ] Помимо нуклеосомного следа, NOMe-seq может определять местоположения, связанные факторами транскрипции . Нуклеосомы связаны 147 парами оснований ДНК. [ 3 ] тогда как факторы транскрипции или другие белки будут связывать только область размером примерно 10-80 пар оснований. После обработки M.CviPl сайты нуклеосом и факторов транскрипции можно дифференцировать по размеру неметилированной области GpC. [ 4 ]
Заселенность нуклеосом определяет доступность ДНК, что дает представление о регуляторных областях генома. Важные регуляторные элементы внутри клетки (такие как промоторы , энхансеры , сайленсеры и т. д.) расположены в открытых или доступных областях, что позволяет связывать факторы транскрипции или другие регуляторные молекулы. [ 3 ] Таким образом, NOMe-seq можно использовать для выяснения нормативной информации. Альтернативные методы обеспечения доступности ДНК включают MNase-seq , [ 5 ] ДНКаза-сек , [ 6 ] DO-последовательность , [ 7 ] и их преемник ATAC-seq . [ 8 ] NOMe-seq имеет дополнительное преимущество, заключающееся в определении статуса метилирования ДНК, который также играет решающую роль в регуляции геномной активности. Интересно, что повышенное метилирование ДНК связано с подавлением транскрипции , тогда как доступная ДНК, несвязанная нуклеосомами, обычно связана с активацией транскрипции. В этом смысле NOMe-seq состоит из двух независимых анализов метилирования, которые функционально противоположны. [ 9 ]
История
[ редактировать ]Метилтрансфераза M.CviPl была впервые описана в 1998 году, когда этот ген был клонирован из вируса Chorella NYs-1. [ 10 ] После своего открытия метилтрансфераза использовалась для нуклеосомного отпечатка еще в 2004 году. [ 11 ] но NOMe-seq официально не был описан до 2012 года. [ 12 ] M.CviPl была не единственной метилтрансферазой, используемой для нуклеосомного отпечатка; Чувствительный к метилазе анализ одного промотора (M-SPA) был описан в 2005 году с использованием CpG-метилтрансферазы M.Sssi. [ 13 ] [ 14 ] Методы M.CviPl быстро обогнали M-SPA, поскольку специфичность GpC предпочтительнее специфичности CpG, при этом динуклеотиды GpC имеют более широкое распределение по геному и не имеют эндогенного метилирования. [ 14 ] Впоследствии был разработан анализ NOMe-seq, самое раннее упоминание было сделано в 2011 году. [ 15 ] и подробное описание, опубликованное в 2012 году. [ 12 ] С тех пор этот метод был адаптирован для одноклеточных технологий: в 2017 году был описан одноклеточный NOMe-seq (scNOMe-seq). [ 16 ] и NOMe-seq с использованием секвенирования нанопор (nanoNOMe), описанного в 2020 году. [ 17 ] Эти адаптации позволили проводить анализы с высоким разрешением, которые могут сравнивать и сравнивать доступность ДНК между отдельными клетками. [ 16 ]
Методы
[ редактировать ]- Компоненты
- [ 9 ]
- Для выделения ядер компоненты включают фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS), трипсин или диспазу (в зависимости от типа клеток), трипановый синий, гемоцитометр, лизирующий буфер и промывочный буфер.
- Для обработки ядер с помощью M.CviPl компоненты включают буфер GpC, S-аденозилгомоцистеин (SAM), M.CviPl, сахарозу, воду, не содержащую нуклеазы, и стоп-буфер.
- Для выделения ДНК, обработанной M.CviPl, компоненты включают NaCl, протеиназу K, фенол:хлороформ (1:1), этанол, буфер TE и спектрофотометр Nandrop с ЭДТА, pH 8.
- Для фрагментации ДНК, обработанной M.CviPI, компоненты включают ультразвуковой аппарат Covaris, колпачок Covaris MicroTUBE AFA с предварительной прорезью Snap-Cap 6x16 мм, спектрофотометр Nanodrop и набор для высокочувствительной ДНК (Agilent) для использования с биоанализатором Agilent 2100.
- Для бисульфитной конверсии ДНК, обработанной M.CviPI, компоненты включают набор для метилирования ДНК EZ.
- Компоненты для создания библиотеки NOMe-seq включают набор библиотеки ДНК Accel-NGS Mmethyl-Seq для платформ Illumina, набор для индексирования Mmethyl-Seq Set A, магнитные шарики, набор для анализа dsDNA HS и набор для высокой чувствительности ДНК.

- Изолировать ядра : Лизация осажденных клеток
- Обработка ядер M. CviPl для метилирования GpC : инкубация с буфером GpC и M.CviPI.
- Очистите и фрагментируйте ядра, обработанные MCviPl
- Обработка ядер, обработанных MCviPI, бисульфитом : преобразование неметилированного Cs в Ts
- Создайте библиотеку NOME-seq.
- Библиотека последовательностей NOMe-seq
- Выполнение проверки качества : анализ последовательности путем сопоставления секвенированных геномных клонов с последовательностью, преобразованной в бисульфит.
- Постобработка : анализ дубликатов и качества покрытия.
- Требование к метилированию в сайтах CpG и GpC : CpG обнаружен во всех тринуклеотидах ХГЧ; GpC содержится во всех тринуклеотидах GCH.
- Призыв к отчетам о недоставке
- Выполнение анализа качества метилирования и выявление NDR : Визуализация уровней метилирования.
Использовать
[ редактировать ]Преимущества
[ редактировать ]- Высокое разрешение [ нужна ссылка ]
- Идентифицирует регуляторные элементы без необходимости понимания модификаций нуклеосом (по сравнению с CHIP-seq ). [ нужна ссылка ]
- Более подробная информация о положении нуклеосом (по сравнению с DNase-seq , FAIRE-seq и ATAC-seq . [ 9 ]
- Идентифицирует информацию о положении двойной нуклеосомы
- Идентифицирует метилирование ДНК с разрешением одной молекулы ДНК.
- Относительно короткое время реакции: 15 минут при использовании примерно 200 000 клеток. [ 1 ]
Ограничения
[ редактировать ]- Зависит от присутствия остатков GpC: хотя широкое распространение GpC дает глубокую информацию, картирование по-прежнему основано на присутствии GpC в регионах, не связанных нуклеосомами или факторами транскрипции, и поэтому не может обеспечить разрешение отдельных нуклеотидов. [ 18 ]
- Более высокие затраты по сравнению с другими методами секвенирования из-за глубины получаемой информации. [ 19 ]
Другие приложения и дополнительные методы
[ редактировать ]scNOMe-seq
[ редактировать ]scNOMe-seq — это метод, адаптированный на основе NOMe-seq для использования в исследованиях отдельных клеток. Было обнаружено, что это дает результаты, аналогичные NOMe-seq, при использовании объемных образцов культур клеток человека. Анализ отдельных клеток имеет много преимуществ в тех случаях, когда экспрессия генов может варьироваться в разных клетках. Например, для дальнейшей разработки методов лечения рака было бы полезно понять различия, возникающие между отдельными клетками с помощью метода scNOMe-seq. [ 16 ]
наноНОМ
[ редактировать ]nanoNOMe — это метод, адаптированный из NOMe-seq, который использует секвенирование нанопор вместо бисульфитного секвенирования. Секвенирование нанопор — это метод секвенирования с длинным считыванием, который также обнаруживает метилирование ДНК, что дает дополнительную информацию о закономерностях дальнего действия в отдельных молекулах. [ 17 ]
NOMePlot
[ редактировать ]NOMePlot — это биоинформатический инструмент, разработанный для наборов данных, полученных с помощью NOMe-seq. Этот инструмент легко получает информацию, специфичную для локусов отдельных молекул, в полногеномных наборах данных из популяций клеток и был проверен с использованием эмбриональных стволовых клеток мыши. [ 20 ]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д Лэй, Фидес Д.; Келли, Тереза К.; Джонс, Питер А. (2018), Тост, Йорг (редактор), «Заселение нуклеосом и секвенирование метилома (NOMe-seq)» , Протоколы метилирования ДНК , Методы молекулярной биологии, том. 1708, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Springer, стр. 267–284, doi : 10.1007/978-1-4939-7481-8_14 , ISBN. 978-1-4939-7481-8 , PMID 29224149 , получено 28 февраля 2023 г.
- ^ Ли, Юаньюань; Толлефсбол, Трюгве О. (2011). «Обнаружение метилирования ДНК: анализ бисульфитного геномного секвенирования». Протоколы эпигенетики . Методы молекулярной биологии. Том. 791. стр. 11–21. дои : 10.1007/978-1-61779-316-5_2 . ISBN 978-1-61779-315-8 . ISSN 1064-3745 . ПМЦ 3233226 . ПМИД 21913068 .
- ^ Jump up to: а б Цомпана, Мария; Бак, Майкл Дж. (20 ноября 2014 г.). «Доступность хроматина: окно в геном» . Эпигенетика и хроматин . 7 (1): 33. дои : 10.1186/1756-8935-7-33 . ISSN 1756-8935 . ПМК 4253006 . ПМИД 25473421 .
- ^ «NOMe-Seq (заселенность нуклеосом и секвенирование метилома)» . www.activemotif.com . Проверено 28 февраля 2023 г.
- ^ Джонсон, Стивен М.; Тан, Фредерик Дж.; Маккалоу, Хизер Л.; Риордан, Дэниел П.; Файер, Эндрю З. (декабрь 2006 г.). «Гибкость и ограничения в ядерном ландшафте нуклеосом хроматина Caenorhabditis elegans» . Геномные исследования . 16 (12): 1505–1516. дои : 10.1101/гр.5560806 . ISSN 1088-9051 . ПМЦ 1665634 . ПМИД 17038564 .
- ^ Бойл, Алан П.; Дэвис, Шон; Шульха, Геннадий П.; Мельцер, Пол; Маргулис, Эллиот Х.; Вэн, Чжипин; Фьюри, Терренс С.; Кроуфорд, Грегори Э. (25 января 2008 г.). «Картирование высокого разрешения и характеристика открытого хроматина по всему геному» . Клетка . 132 (2): 311–322. дои : 10.1016/j.cell.2007.12.014 . ISSN 1097-4172 . ПМЦ 2669738 . ПМИД 18243105 .
- ^ Гирези, Пол Г.; Ким, Джонхван; МакДэниел, Райан М.; Айер, Вишванат Р.; Либ, Джейсон Д. (19 декабря 2006 г.). «FAIRE (выделение регуляторных элементов с помощью формальдегида) изолирует активные регуляторные элементы из хроматина человека» . Геномные исследования . 17 (6): 877–885. дои : 10.1101/гр.5533506 . ISSN 1088-9051 . ЧВК 1891346 . ПМИД 17179217 .
- ^ Буэнростро, Джейсон Д.; Ву, Пекин; Чанг, Ховард Ю.; Гринлиф, Уильям Дж. (январь 2015 г.). «ATAC-seq: метод анализа доступности хроматина по всему геному» . Современные протоколы молекулярной биологии . 109 (1): 21.29.1–21.29.9. дои : 10.1002/0471142727.mb2129s109 . ISSN 1934-3639 . ПМЦ 4374986 . ПМИД 25559105 .
- ^ Jump up to: а б с д Ри, Сон Кён; Шрайнер, Шеннон; Фарнхэм, Пегги Дж. (2018). «Определение регуляторных элементов в геноме человека с использованием занятости нуклеосом и секвенирования метилома (NOMe-Seq)». Острова ЦПГ . Методы молекулярной биологии. Том. 1766. стр. 209–229. дои : 10.1007/978-1-4939-7768-0_12 . ISBN 978-1-4939-7767-3 . ISSN 1940-6029 . ПМК 6019634 . ПМИД 29605855 .
- ^ Сюй, М.; Кладде, член парламента; Ван Эттен, JL; Симпсон, RT (1 сентября 1998 г.). «Клонирование, характеристика и экспрессия гена, кодирующего цитозин-5-ДНК-метилтрансферазу, узнающую GpC» . Исследования нуклеиновых кислот . 26 (17): 3961–3966. дои : 10.1093/нар/26.17.3961 . ISSN 0305-1048 . ПМК 147793 . ПМИД 9705505 .
- ^ Джессен, Уолтер Дж; Дхасарати, Арчана; Хуз, Скотт А; Карвин, Кристофер Д.; Райзингер, Эйприл Л.; Кладде, Майкл П. (1 мая 2004 г.). «Картирование структуры хроматина in vivo с использованием ДНК-метилтрансфераз» . Методы . In vitro анализ структуры хроматина в модельных системах. 33 (1): 68–80. дои : 10.1016/j.ymeth.2003.10.025 . ISSN 1046-2023 . ПМИД 15039089 .
- ^ Jump up to: а б Келли, Тереза К.; Лю, Япин; Лэй, Фидес Д.; Лян, Ганнин; Берман, Бенджамин П.; Джонс, Питер А. (декабрь 2012 г.). «Полногеномное картирование положения нуклеосом и метилирования ДНК внутри отдельных молекул ДНК» . Геномные исследования . 22 (12): 2497–2506. дои : 10.1101/гр.143008.112 . ISSN 1088-9051 . ПМЦ 3514679 . ПМИД 22960375 .
- ^ Фатеми, Мерназ; Пао, Марта М.; Чон, Шинву; Гал-Ям, Эйнав Нили; Эггер, Герда; Вайзенбергер, Дэниел Дж.; Джонс, Питер А. (27 ноября 2005 г.). «Отпечаток промоторов млекопитающих: использование ДНК-метилтрансферазы CpG, выявляющей положения нуклеосом на уровне одной молекулы» . Исследования нуклеиновых кислот . 33 (20): е176. дои : 10.1093/nar/gni180 . ISSN 1362-4962 . ПМК 1292996 . ПМИД 16314307 .
- ^ Jump up to: а б Вольф, Эрика М.; Бён, Хян Мин; Хан, Хан Ф.; Шарма, Шикхар; Николс, Питер В.; Зигмунд, Кимберли Д.; Ян, Аллен С.; Джонс, Питер А.; Лян, Ганнин (22 апреля 2010 г.). «Гипометилирование промотора LINE-1 активирует альтернативный транскрипт онкогена MET в мочевом пузыре с раком» . ПЛОС Генетика . 6 (4): e1000917. дои : 10.1371/journal.pgen.1000917 . ISSN 1553-7404 . ПМЦ 2858672 . ПМИД 20421991 .
- ^ Хан, Хан; Кортес, Конни С.; Ян, Сяоцзин; Николс, Питер В.; Джонс, Питер А.; Лян, Ганнин (15 ноября 2011 г.). «Метилирование ДНК напрямую подавляет гены с промоторами, не относящимися к CpG-островкам, и устанавливает промотор, занятый нуклеосомой» . Молекулярная генетика человека . 20 (22): 4299–4310. дои : 10.1093/hmg/ddr356 . ISSN 1460-2083 . ПМК 3196883 . ПМИД 21835883 .
- ^ Jump up to: а б с Потт, Себастьян (27 июня 2017 г.). Рен, Бинг (ред.). «Одновременное измерение доступности хроматина, метилирования ДНК и фазировки нуклеосом в отдельных клетках» . электронная жизнь . 6 : е23203. doi : 10.7554/eLife.23203 . ISSN 2050-084X . ПМК 5487215 . ПМИД 28653622 .
- ^ Jump up to: а б Ли, Исак; Разаги, Рохам; Гилпатрик, Тимоти; Молнар, Майкл; Гершман, Ариэль; Садовский, Нора; Седлажек, Фриц Дж.; Хансен, Каспер Д.; Симпсон, Джаред Т.; Тимп, Уинстон (декабрь 2020 г.). «Одновременное профилирование доступности и метилирования хроматина на линиях клеток человека с помощью секвенирования нанопор» . Природные методы . 17 (12): 1191–1199. дои : 10.1038/s41592-020-01000-7 . ISSN 1548-7105 . ПМК 7704922 . ПМИД 33230324 .
- ^ Исии, Харухико; Кадонага, Джеймс Т.; Рен, Бинг (07 июля 2015 г.). «MPE-seq — новый метод полногеномного анализа структуры хроматина» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 112 (27): Е3457–Е3465. Бибкод : 2015PNAS..112E3457I . дои : 10.1073/pnas.1424804112 . ISSN 0027-8424 . ПМК 4500276 . ПМИД 26080409 .
- ^ Нордстрем, Карл СП; Шмидт, Флориан; Гаспарони, Нина; Салхаб, Абдулрахман; Гаспарони, Жиль; Каттлер, Кэтрин; Мюллер, Фабиан; Эберт, Питер; Коста, Иван Г.; консорциум DEEP; Пфайфер, Нико; Ленгауэр, Томас; Шульц, Марсель Х.; Вальтер, Йорн (18 ноября 2019 г.). «Уникальные и специфические особенности анализа данных NOMe-, ATAC- и DNase I-seq» . Исследования нуклеиновых кислот . 47 (20): 10580–10596. дои : 10.1093/nar/gkz799 . ISSN 1362-4962 . ПМК 6847574 . ПМИД 31584093 .
- ^ Рекена, Франциско; Асенджо, Хелена Г.; Бартурен, Гильермо; Марторелл-Маруган, Хорди; Кармона-Саес, Педро; Ландейра, Дэвид (31 мая 2019 г.). «NOMePlot: анализ метилирования ДНК и занятости нуклеосом в отдельной молекуле» . Научные отчеты . 9 (1): 8140. Бибкод : 2019НатСР...9.8140Р . дои : 10.1038/s41598-019-44597-2 . ISSN 2045-2322 . ПМК 6544651 . ПМИД 31148571 .