Jump to content

seqNAME

Обзор NOMe-seq

нуклеосом используемый Заселенность и ( секвенирование метиломов геномный NOMe -seq ) — это метод, для одновременного определения положения нуклеосом и метилирования ДНК . [ 1 ] Этот метод является расширением бисульфитного секвенирования , которое является золотым стандартом для определения метилирования ДНК. [ 2 ] NOMe-seq основан на метилтрансферазе M.CviPl, которая метилирует цитозины GpC в динуклеотидах , несвязанных нуклеосомами или другими белками , создавая нуклеосомный след. Геном млекопитающих , поэтому естественным образом содержит метилирование ДНК, но только в сайтах CpG метилирование GpC можно отличить от метилирования генома после бисульфитного секвенирования. Это позволяет одновременно анализировать нуклеосомный след и эндогенное метилирование на одних и тех же молекулах ДНК . [ 1 ] Помимо нуклеосомного следа, NOMe-seq может определять местоположения, связанные факторами транскрипции . Нуклеосомы связаны 147 парами оснований ДНК. [ 3 ] тогда как факторы транскрипции или другие белки будут связывать только область размером примерно 10-80 пар оснований. После обработки M.CviPl сайты нуклеосом и факторов транскрипции можно дифференцировать по размеру неметилированной области GpC. [ 4 ]

Заселенность нуклеосом определяет доступность ДНК, что дает представление о регуляторных областях генома. Важные регуляторные элементы внутри клетки (такие как промоторы , энхансеры , сайленсеры и т. д.) расположены в открытых или доступных областях, что позволяет связывать факторы транскрипции или другие регуляторные молекулы. [ 3 ] Таким образом, NOMe-seq можно использовать для выяснения нормативной информации. Альтернативные методы обеспечения доступности ДНК включают MNase-seq , [ 5 ] ДНКаза-сек , [ 6 ] DO-последовательность , [ 7 ] и их преемник ATAC-seq . [ 8 ] NOMe-seq имеет дополнительное преимущество, заключающееся в определении статуса метилирования ДНК, который также играет решающую роль в регуляции геномной активности. Интересно, что повышенное метилирование ДНК связано с подавлением транскрипции , тогда как доступная ДНК, несвязанная нуклеосомами, обычно связана с активацией транскрипции. В этом смысле NOMe-seq состоит из двух независимых анализов метилирования, которые функционально противоположны. [ 9 ]

Метилтрансфераза M.CviPl была впервые описана в 1998 году, когда этот ген был клонирован из вируса Chorella NYs-1. [ 10 ] После своего открытия метилтрансфераза использовалась для нуклеосомного отпечатка еще в 2004 году. [ 11 ] но NOMe-seq официально не был описан до 2012 года. [ 12 ] M.CviPl была не единственной метилтрансферазой, используемой для нуклеосомного отпечатка; Чувствительный к метилазе анализ одного промотора (M-SPA) был описан в 2005 году с использованием CpG-метилтрансферазы M.Sssi. [ 13 ] [ 14 ] Методы M.CviPl быстро обогнали M-SPA, поскольку специфичность GpC предпочтительнее специфичности CpG, при этом динуклеотиды GpC имеют более широкое распределение по геному и не имеют эндогенного метилирования. [ 14 ] Впоследствии был разработан анализ NOMe-seq, самое раннее упоминание было сделано в 2011 году. [ 15 ] и подробное описание, опубликованное в 2012 году. [ 12 ] С тех пор этот метод был адаптирован для одноклеточных технологий: в 2017 году был описан одноклеточный NOMe-seq (scNOMe-seq). [ 16 ] и NOMe-seq с использованием секвенирования нанопор (nanoNOMe), описанного в 2020 году. [ 17 ] Эти адаптации позволили проводить анализы с высоким разрешением, которые могут сравнивать и сравнивать доступность ДНК между отдельными клетками. [ 16 ]

Компоненты
[ 9 ]
  • Для выделения ядер компоненты включают фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS), трипсин или диспазу (в зависимости от типа клеток), трипановый синий, гемоцитометр, лизирующий буфер и промывочный буфер.
  • Для обработки ядер с помощью M.CviPl компоненты включают буфер GpC, S-аденозилгомоцистеин (SAM), M.CviPl, сахарозу, воду, не содержащую нуклеазы, и стоп-буфер.
  • Для выделения ДНК, обработанной M.CviPl, компоненты включают NaCl, протеиназу K, фенол:хлороформ (1:1), этанол, буфер TE и спектрофотометр Nandrop с ЭДТА, pH 8.
  • Для фрагментации ДНК, обработанной M.CviPI, компоненты включают ультразвуковой аппарат Covaris, колпачок Covaris MicroTUBE AFA с предварительной прорезью Snap-Cap 6x16 мм, спектрофотометр Nanodrop и набор для высокочувствительной ДНК (Agilent) для использования с биоанализатором Agilent 2100.
  • Для бисульфитной конверсии ДНК, обработанной M.CviPI, компоненты включают набор для метилирования ДНК EZ.
  • Компоненты для создания библиотеки NOMe-seq включают набор библиотеки ДНК Accel-NGS Mmethyl-Seq для платформ Illumina, набор для индексирования Mmethyl-Seq Set A, магнитные шарики, набор для анализа dsDNA HS и набор для высокой чувствительности ДНК.
Рабочий процесс
[ 1 ] [ 9 ]
Экспериментальный и аналитический рабочий процесс NOMe-seq
  • Изолировать ядра : Лизация осажденных клеток
  • Обработка ядер M. CviPl для метилирования GpC : инкубация с буфером GpC и M.CviPI.
  • Очистите и фрагментируйте ядра, обработанные MCviPl
  • Обработка ядер, обработанных MCviPI, бисульфитом : преобразование неметилированного Cs в Ts
  • Создайте библиотеку NOME-seq.
  • Библиотека последовательностей NOMe-seq
  • Выполнение проверки качества : анализ последовательности путем сопоставления секвенированных геномных клонов с последовательностью, преобразованной в бисульфит.
  • Постобработка : анализ дубликатов и качества покрытия.
  • Требование к метилированию в сайтах CpG и GpC : CpG обнаружен во всех тринуклеотидах ХГЧ; GpC содержится во всех тринуклеотидах GCH.
  • Призыв к отчетам о недоставке
  • Выполнение анализа качества метилирования и выявление NDR : Визуализация уровней метилирования.

Использовать

[ редактировать ]

Преимущества

[ редактировать ]
  • Высокое разрешение [ нужна ссылка ]
  • Идентифицирует регуляторные элементы без необходимости понимания модификаций нуклеосом (по сравнению с CHIP-seq ). [ нужна ссылка ]
  • Более подробная информация о положении нуклеосом (по сравнению с DNase-seq , FAIRE-seq и ATAC-seq . [ 9 ]
  • Идентифицирует информацию о положении двойной нуклеосомы
  • Идентифицирует метилирование ДНК с разрешением одной молекулы ДНК.
  • Относительно короткое время реакции: 15 минут при использовании примерно 200 000 клеток. [ 1 ]

Ограничения

[ редактировать ]
  • Зависит от присутствия остатков GpC: хотя широкое распространение GpC дает глубокую информацию, картирование по-прежнему основано на присутствии GpC в регионах, не связанных нуклеосомами или факторами транскрипции, и поэтому не может обеспечить разрешение отдельных нуклеотидов. [ 18 ]
  • Более высокие затраты по сравнению с другими методами секвенирования из-за глубины получаемой информации. [ 19 ]

Другие приложения и дополнительные методы

[ редактировать ]

scNOMe-seq — это метод, адаптированный на основе NOMe-seq для использования в исследованиях отдельных клеток. Было обнаружено, что это дает результаты, аналогичные NOMe-seq, при использовании объемных образцов культур клеток человека. Анализ отдельных клеток имеет много преимуществ в тех случаях, когда экспрессия генов может варьироваться в разных клетках. Например, для дальнейшей разработки методов лечения рака было бы полезно понять различия, возникающие между отдельными клетками с помощью метода scNOMe-seq. [ 16 ]

nanoNOMe — это метод, адаптированный из NOMe-seq, который использует секвенирование нанопор вместо бисульфитного секвенирования. Секвенирование нанопор — это метод секвенирования с длинным считыванием, который также обнаруживает метилирование ДНК, что дает дополнительную информацию о закономерностях дальнего действия в отдельных молекулах. [ 17 ]

NOMePlot — это биоинформатический инструмент, разработанный для наборов данных, полученных с помощью NOMe-seq. Этот инструмент легко получает информацию, специфичную для локусов отдельных молекул, в полногеномных наборах данных из популяций клеток и был проверен с использованием эмбриональных стволовых клеток мыши. [ 20 ]

См. также

[ редактировать ]
  1. ^ Jump up to: а б с д Лэй, Фидес Д.; Келли, Тереза ​​К.; Джонс, Питер А. (2018), Тост, Йорг (редактор), «Заселение нуклеосом и секвенирование метилома (NOMe-seq)» , Протоколы метилирования ДНК , Методы молекулярной биологии, том. 1708, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Springer, стр. 267–284, doi : 10.1007/978-1-4939-7481-8_14 , ISBN.  978-1-4939-7481-8 , PMID   29224149 , получено 28 февраля 2023 г.
  2. ^ Ли, Юаньюань; Толлефсбол, Трюгве О. (2011). «Обнаружение метилирования ДНК: анализ бисульфитного геномного секвенирования». Протоколы эпигенетики . Методы молекулярной биологии. Том. 791. стр. 11–21. дои : 10.1007/978-1-61779-316-5_2 . ISBN  978-1-61779-315-8 . ISSN   1064-3745 . ПМЦ   3233226 . ПМИД   21913068 .
  3. ^ Jump up to: а б Цомпана, Мария; Бак, Майкл Дж. (20 ноября 2014 г.). «Доступность хроматина: окно в геном» . Эпигенетика и хроматин . 7 (1): 33. дои : 10.1186/1756-8935-7-33 . ISSN   1756-8935 . ПМК   4253006 . ПМИД   25473421 .
  4. ^ «NOMe-Seq (заселенность нуклеосом и секвенирование метилома)» . www.activemotif.com . Проверено 28 февраля 2023 г.
  5. ^ Джонсон, Стивен М.; Тан, Фредерик Дж.; Маккалоу, Хизер Л.; Риордан, Дэниел П.; Файер, Эндрю З. (декабрь 2006 г.). «Гибкость и ограничения в ядерном ландшафте нуклеосом хроматина Caenorhabditis elegans» . Геномные исследования . 16 (12): 1505–1516. дои : 10.1101/гр.5560806 . ISSN   1088-9051 . ПМЦ   1665634 . ПМИД   17038564 .
  6. ^ Бойл, Алан П.; Дэвис, Шон; Шульха, Геннадий П.; Мельцер, Пол; Маргулис, Эллиот Х.; Вэн, Чжипин; Фьюри, Терренс С.; Кроуфорд, Грегори Э. (25 января 2008 г.). «Картирование высокого разрешения и характеристика открытого хроматина по всему геному» . Клетка . 132 (2): 311–322. дои : 10.1016/j.cell.2007.12.014 . ISSN   1097-4172 . ПМЦ   2669738 . ПМИД   18243105 .
  7. ^ Гирези, Пол Г.; Ким, Джонхван; МакДэниел, Райан М.; Айер, Вишванат Р.; Либ, Джейсон Д. (19 декабря 2006 г.). «FAIRE (выделение регуляторных элементов с помощью формальдегида) изолирует активные регуляторные элементы из хроматина человека» . Геномные исследования . 17 (6): 877–885. дои : 10.1101/гр.5533506 . ISSN   1088-9051 . ЧВК   1891346 . ПМИД   17179217 .
  8. ^ Буэнростро, Джейсон Д.; Ву, Пекин; Чанг, Ховард Ю.; Гринлиф, Уильям Дж. (январь 2015 г.). «ATAC-seq: метод анализа доступности хроматина по всему геному» . Современные протоколы молекулярной биологии . 109 (1): 21.29.1–21.29.9. дои : 10.1002/0471142727.mb2129s109 . ISSN   1934-3639 . ПМЦ   4374986 . ПМИД   25559105 .
  9. ^ Jump up to: а б с д Ри, Сон Кён; Шрайнер, Шеннон; Фарнхэм, Пегги Дж. (2018). «Определение регуляторных элементов в геноме человека с использованием занятости нуклеосом и секвенирования метилома (NOMe-Seq)». Острова ЦПГ . Методы молекулярной биологии. Том. 1766. стр. 209–229. дои : 10.1007/978-1-4939-7768-0_12 . ISBN  978-1-4939-7767-3 . ISSN   1940-6029 . ПМК   6019634 . ПМИД   29605855 .
  10. ^ Сюй, М.; Кладде, член парламента; Ван Эттен, JL; Симпсон, RT (1 сентября 1998 г.). «Клонирование, характеристика и экспрессия гена, кодирующего цитозин-5-ДНК-метилтрансферазу, узнающую GpC» . Исследования нуклеиновых кислот . 26 (17): 3961–3966. дои : 10.1093/нар/26.17.3961 . ISSN   0305-1048 . ПМК   147793 . ПМИД   9705505 .
  11. ^ Джессен, Уолтер Дж; Дхасарати, Арчана; Хуз, Скотт А; Карвин, Кристофер Д.; Райзингер, Эйприл Л.; Кладде, Майкл П. (1 мая 2004 г.). «Картирование структуры хроматина in vivo с использованием ДНК-метилтрансфераз» . Методы . In vitro анализ структуры хроматина в модельных системах. 33 (1): 68–80. дои : 10.1016/j.ymeth.2003.10.025 . ISSN   1046-2023 . ПМИД   15039089 .
  12. ^ Jump up to: а б Келли, Тереза ​​К.; Лю, Япин; Лэй, Фидес Д.; Лян, Ганнин; Берман, Бенджамин П.; Джонс, Питер А. (декабрь 2012 г.). «Полногеномное картирование положения нуклеосом и метилирования ДНК внутри отдельных молекул ДНК» . Геномные исследования . 22 (12): 2497–2506. дои : 10.1101/гр.143008.112 . ISSN   1088-9051 . ПМЦ   3514679 . ПМИД   22960375 .
  13. ^ Фатеми, Мерназ; Пао, Марта М.; Чон, Шинву; Гал-Ям, Эйнав Нили; Эггер, Герда; Вайзенбергер, Дэниел Дж.; Джонс, Питер А. (27 ноября 2005 г.). «Отпечаток промоторов млекопитающих: использование ДНК-метилтрансферазы CpG, выявляющей положения нуклеосом на уровне одной молекулы» . Исследования нуклеиновых кислот . 33 (20): е176. дои : 10.1093/nar/gni180 . ISSN   1362-4962 . ПМК   1292996 . ПМИД   16314307 .
  14. ^ Jump up to: а б Вольф, Эрика М.; Бён, Хян Мин; Хан, Хан Ф.; Шарма, Шикхар; Николс, Питер В.; Зигмунд, Кимберли Д.; Ян, Аллен С.; Джонс, Питер А.; Лян, Ганнин (22 апреля 2010 г.). «Гипометилирование промотора LINE-1 активирует альтернативный транскрипт онкогена MET в мочевом пузыре с раком» . ПЛОС Генетика . 6 (4): e1000917. дои : 10.1371/journal.pgen.1000917 . ISSN   1553-7404 . ПМЦ   2858672 . ПМИД   20421991 .
  15. ^ Хан, Хан; Кортес, Конни С.; Ян, Сяоцзин; Николс, Питер В.; Джонс, Питер А.; Лян, Ганнин (15 ноября 2011 г.). «Метилирование ДНК напрямую подавляет гены с промоторами, не относящимися к CpG-островкам, и устанавливает промотор, занятый нуклеосомой» . Молекулярная генетика человека . 20 (22): 4299–4310. дои : 10.1093/hmg/ddr356 . ISSN   1460-2083 . ПМК   3196883 . ПМИД   21835883 .
  16. ^ Jump up to: а б с Потт, Себастьян (27 июня 2017 г.). Рен, Бинг (ред.). «Одновременное измерение доступности хроматина, метилирования ДНК и фазировки нуклеосом в отдельных клетках» . электронная жизнь . 6 : е23203. doi : 10.7554/eLife.23203 . ISSN   2050-084X . ПМК   5487215 . ПМИД   28653622 .
  17. ^ Jump up to: а б Ли, Исак; Разаги, Рохам; Гилпатрик, Тимоти; Молнар, Майкл; Гершман, Ариэль; Садовский, Нора; Седлажек, Фриц Дж.; Хансен, Каспер Д.; Симпсон, Джаред Т.; Тимп, Уинстон (декабрь 2020 г.). «Одновременное профилирование доступности и метилирования хроматина на линиях клеток человека с помощью секвенирования нанопор» . Природные методы . 17 (12): 1191–1199. дои : 10.1038/s41592-020-01000-7 . ISSN   1548-7105 . ПМК   7704922 . ПМИД   33230324 .
  18. ^ Исии, Харухико; Кадонага, Джеймс Т.; Рен, Бинг (07 июля 2015 г.). «MPE-seq — новый метод полногеномного анализа структуры хроматина» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 112 (27): Е3457–Е3465. Бибкод : 2015PNAS..112E3457I . дои : 10.1073/pnas.1424804112 . ISSN   0027-8424 . ПМК   4500276 . ПМИД   26080409 .
  19. ^ Нордстрем, Карл СП; Шмидт, Флориан; Гаспарони, Нина; Салхаб, Абдулрахман; Гаспарони, Жиль; Каттлер, Кэтрин; Мюллер, Фабиан; Эберт, Питер; Коста, Иван Г.; консорциум DEEP; Пфайфер, Нико; Ленгауэр, Томас; Шульц, Марсель Х.; Вальтер, Йорн (18 ноября 2019 г.). «Уникальные и специфические особенности анализа данных NOMe-, ATAC- и DNase I-seq» . Исследования нуклеиновых кислот . 47 (20): 10580–10596. дои : 10.1093/nar/gkz799 . ISSN   1362-4962 . ПМК   6847574 . ПМИД   31584093 .
  20. ^ Рекена, Франциско; Асенджо, Хелена Г.; Бартурен, Гильермо; Марторелл-Маруган, Хорди; Кармона-Саес, Педро; Ландейра, Дэвид (31 мая 2019 г.). «NOMePlot: анализ метилирования ДНК и занятости нуклеосом в отдельной молекуле» . Научные отчеты . 9 (1): 8140. Бибкод : 2019НатСР...9.8140Р . дои : 10.1038/s41598-019-44597-2 . ISSN   2045-2322 . ПМК   6544651 . ПМИД   31148571 .
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 9e2ae31694cea804e4d91d7b8ff6227f__1709796720
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/9e/7f/9e2ae31694cea804e4d91d7b8ff6227f.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
NOMe-seq - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)