Эос (белок)
EosFP представляет собой фотоактивируемый зелено-красный флуоресцентный белок . Его зеленая флуоресценция (516 нм) переключается на красную (581 нм) при УФ-облучении ~390 нм (фиолетовый/синий свет) из-за фотоиндуцированной модификации, возникающей в результате разрыва пептидного остова вблизи хромофора . [ 1 ] Эос был впервые обнаружен в виде тетрамерного белка в каменистом коралле Lobophyllia hemprichii. [ 2 ] . Как и другие флуоресцентные белки, Eos позволяет использовать такие приложения, как отслеживание слитых белков, многоцветное мечение и отслеживание движения клеток. [ 3 ] Несколько вариантов Eos были разработаны для использования в конкретных исследовательских системах, включая mEos2, mEos4 и CaMPARI.
История
[ редактировать ]
EosFP был впервые обнаружен в 2005 году во время крупномасштабного скрининга PAFP (фотоактивируемых флуоресцентных белков) в каменистом коралле Lobophyllia hemprichii . [ 2 ] С тех пор он был успешно клонирован в Escherichia coli , и слитые конструкции для использования в клетках человека. были разработаны [ 2 ] Эос была названа в честь греческой богини зари . [ 2 ]
В отличие от тетрамерных флуоресцентных белков, полученных из антозойных кораллов, которые могут мешать нормальному функционированию клеток из-за взаимодействий между белковыми субъединицами, EosFP был разбит на димерные и мономерные варианты посредством введения одноточечных мутаций . [ 4 ] Эти варианты успешно отслеживают клеточные компоненты, не нарушая функции клетки-хозяина, и сохраняют те же фотофизические свойства, что и Eos дикого типа. [ 5 ]
С момента своего открытия было показано, что мономерные зонды Eos (mEos) локализуются в цитозоле , плазматической мембране , эндосомах , превакуолярных везикулах , вакуолях , эндоплазматическом ретикулуме , тельцах Гольджи , пероксисомах , митохондриях , инвагинациях, нитевидном актине и кортикальных микротрубочках. [ 6 ] Слитые белки mEos позволяют осуществлять дифференциальную цветовую маркировку в отдельных клетках или группах клеток в развивающихся органах. Их также можно использовать для понимания пространственных/временных взаимодействий между органеллами и везикулами. Две флуоресцентные формы mEosFP (зеленая и красная) совместимы с CFP, GFP, YFP и RFP для многоцветной маркировки. [ 6 ]
Функция
[ редактировать ]EosFP излучает сильную зеленую флуоресценцию (516 нм), которая необратимо меняется на красную (581 нм) при облучении УФ-светом с длиной волны 390 нм. Эта модификация происходит из-за разрыва пептидного остова рядом с хромофором. [ 2 ] Этот механизм позволяет локализовать маркировку белка и делает EosFP подходящим инструментом для отслеживания движения белка внутри живых клеток. [ 7 ] Образование красного хромофора включает расщепление пептидного остова, но практически не включает других изменений в структуре белка. [ 8 ]
одиночных молекул Согласно данным флуоресцентной спектроскопии , EosFP является тетрамерным и демонстрирует сильное резонансное взаимодействие Форстера внутри отдельных флуорофоров. [ 2 ] Как и другие флуоресцентные белки, Eos можно использовать для передачи разнообразных сигналов в клетках , тканях и органах, не нарушая при этом сложные биологические механизмы. Хотя использование флуоресцентных белков когда-то ограничивалось зеленым флуоресцентным белком ( GFP ), в последние годы были клонированы многие другие флуоресцентные белки. В отличие от GFP, полученных из люминесцентной медузы Aequorea victoria, флуоресцентные белки, полученные из антозой , включая Eos, излучают флуоресценцию в красном спектральном диапазоне. Новое свойство фотоиндуцированного преобразования зеленого в красный у Eos полезно, поскольку оно позволяет локализовать отслеживание белков в живых клетках. [ 2 ] EosFP уникален, поскольку он имеет большое разделение длин волн, которые он может излучать, что позволяет легко идентифицировать пиковые цвета. [ 5 ] Все зелено-красные фотоиндуцируемые флуоресцентные белки, включая Eos, содержат хромофорную единицу, производную трипептида his-tyr-gly. Это преобразование зеленого в красный осуществляется светом, а не химическим окислением, как в других FP. [ 5 ]
Структура и поглощательные свойства
[ редактировать ]
Первичная структура
[ редактировать ]EosFP состоит из 226 аминокислот . Его молекулярная масса составляет 25,8 кДа, а его pI составляет 6,9. Эос имеет 84% остатков, идентичных Каеде , флуоресцентному белку, который произошел от другого склерактинового коралла Trachyphyllia geoffroyi , но также может быть необратимо преобразован из зеленой в красную излучающую форму с помощью УФ-света. [ 8 ] За исключением остатков Phe-61 и His-62, окружение хромофора и сам хромофор не подвержены фотохимической модификации. [ 7 ] EosFP дикого типа имеет тетрамерное расположение субъединиц, где каждая субъединица имеет ту же структуру β-кан, что и GFP. Эта структура включает 11-нитевой цилиндр и расположенную вдоль центральной оси спираль, содержащую флуорофор.
Структура зеленого EosFP
[ редактировать ]В своей анионной форме зеленый хромофор имеет максимумы поглощения при 506 нм и максимумы эмиссии при 516 нм. Он образуется автокаталитически из аминокислот His-62, Tyr-63 и Gly-64. Непосредственно вокруг хромофора находится кластер заряженных или полярных аминокислот, а также структурные молекулы воды. Над плоскостью хромофора имеется сеть взаимодействий водородных связей между Glu-144, His-194, Glu-212 и Gln-38. Arg-66 и Arg-91 участвуют в образовании водородных связей с карбонильным кислородом имидазолинонового фрагмента зеленого Эоса. Боковая цепь His-62 находится в неполярной среде. [ 7 ] Преобразование из зеленой формы в красную зависит от присутствия гистидина в первом положении трипептида HYG, образующего хромофор. Когда этот остаток гистидина заменяется на M, S, T или L, Eos излучает только ярко-зеленый свет и больше не действует как фотоконвертируемый флуоресцентный белок. [ 2 ]
Структура Red EosFP
[ редактировать ]Красный хромофор, который образуется в результате расщепления пептидного остова, в своей анионной форме имеет максимумы поглощения при 571 нм и максимумы эмиссии при 581 нм. Разрыв в пептидном остове, который приводит к образованию этого хромофора, находится между His-62 Nα и Cα. [ 5 ] Наблюдаемая красная флуоресценция возникает из-за расширения π-конъюгации хромофора, где имидазольное кольцо His-62 соединяется с имидазолиноном. Характер водородных связей красного и зеленого хромофоров практически идентичен. [ 7 ]
| Характеристики [ 9 ] | |
|---|---|
| Длина волны фотоконверсии | 390 нм |
| Зеленый пик поглощения | 506 нм |
| Пик зеленого выброса | 516 нм |
| Красный пик поглощения | 571 нм |
| Пик красного излучения | 581 нм |
| Яркость зеленого* | 1,3X |
| Яркость красного* | 0,7X |
| * Значения яркости указаны относительно EGFP . | |
Фотохимическая конверсия
[ редактировать ]Фотохимическое превращение происходит за счет взаимодействия хромофорного звена с остатками, находящимися вблизи него. Glu-212 действует как основание, которое удаляет протон из His-62, способствуя разрыву связи His-62-Nα-Cα. Замена Glu-212 глютамином предотвращает фотоконверсию. При низком pH выход Eos, участвующего в фотоконверсии, значительно увеличивается по мере увеличения доли молекул в протонированной форме. Спектр действия фотоконверсии тесно связан со спектром действия протонированной формы Эоса. Эти наблюдения позволяют предположить, что нейтральная форма зеленого хромофора, включающая протонированную боковую цепь Tyr-63, является структурой шлюза для фотоконверсии. Выброс протона из фенильной боковой цепи Tyr-63 является важным событием в механизме конверсии, при котором протон переносится от имидазола His-62, который связан водородной связью с карбонилом Phe-61. Дополнительный протон заставляет His-62 отдавать протон карбонилу Phe-61, образуя уходящую группу из пептидной связи между His и Phe в реакции элиминирования. Боковая цепь His-62 протонируется во время фотовозбуждения и способствует реакции, отдавая протон карбонилу Phe-61 в уходящей группе. После расщепления основной цепи водородная связь между His-62 и Phe-61 восстанавливается. Когда His-62 заменяется другими аминокислотами, EosFP теряет способность к фотоконверсии, что доказывает, что His-62 является необходимым компонентом механизма фотоконверсии. [ 7 ] Распределение внутреннего заряда зеленого хромофора изменяется во время фотовозбуждения, что способствует реакции элиминирования. [ 5 ]
Спектроскопия
[ редактировать ]флуоресценции Спектры возбуждения и испускания EosFP дикого типа смещаются примерно на 65 нм вправо при возбуждении в сторону красного конца спектра. Это спектральное изменение вызвано удлинением хромофора, сопровождающимся разрывом пептидного остова между Phe-61 и His-62 по необратимому механизму. [ 1 ] Наличие четкой изобестической точки при 432 нм также предполагает взаимопревращение между двумя видами. Виден пик поглощения при 280 нм, обусловленный ароматическими аминокислотами , которые передают свою энергию возбуждения зеленому хромофору. Квантовый выход зеленой формы Eos составляет 0,7. [ 2 ] В красносмещенных частицах в спектре возбуждения и спектре излучения соответственно имеются выраженные вибронные боковые полосы, отдельные от основного пика при 533 нм и 629 нм. В спектре красного возбуждения имеется еще один пик при 502 нм, вероятно, обусловленный FRET-возбуждением красного флуорофора. [ 1 ] Квантовый выход красноизлучающей формы составляет 0,55. [ 2 ]
Варианты EosFP практически не различаются по спектроскопическим свойствам, поэтому вполне вероятно, что структурные модификации, возникающие в результате разделения интерфейсов, практически не влияют на структуру сайта связывания флуорофора. [ 4 ]
Приложения
[ редактировать ]Отслеживание слитых белков
[ редактировать ]С использованием EosFP и его инженерных вариантов было создано множество различных гибридных белков. Эти слитые белки позволяют отслеживать белки внутри живых клеток, сохраняя при этом сложные биологические функции, такие как белок-белковые взаимодействия и взаимодействия белок-ДНК. Слитые конструкции Eos включают конструкции, содержащие рекомбинационный сигнал-связывающий белок (RBP) и цитокератин . [ 2 ] Исследования показали, что интересующий белок выгодно прикрепить к N-концевой стороне метки EosFP. [ 3 ] Эти слитые конструкции использовались для визуализации ядерной транслокации с помощью андрогенных рецепторов , динамики цитоскелета с актином и винкулином и внутриядерного движения белков с помощью RBP. [ 3 ]
Многоцветная маркировка
[ редактировать ]Поскольку EosFP можно использовать в слитых конструкциях, сохраняя при этом функциональность интересующего белка, он является популярным выбором для исследований многоцветной маркировки. [ 3 ] В эксперименте по двухцветному мечению для картирования стадий митоза слитой клетки HEK293 тубулинсвязывающего белка, сначала были стабильно трансфицированы кДНК с EGFP, для визуализации веретенообразного аппарата . Затем для визуализации начала митоза использовали временную трансфекцию белка, связывающего рекомбинационный сигнал (RBP), слитого с d2EosFP. Фотоконверсия была завершена с помощью флуоресцентной микроскопии и выявила разделение между двумя наборами хромосом во время анафазы , телофазы и цитокинеза . [ 4 ]
Отслеживание движения клеток в биологии развития
[ редактировать ]EosFP использовался для отслеживания движений клеток во время эмбрионального развития Xenopus laevis. На стадии двухклеточной/ранней гаструлы кэпированная мРНК, кодирующая димерный EosFP (d2EosFP), вводилась в клетки и локально фотоконвертировалась с помощью флуоресцентной микроскопии. [ 3 ] Эти флуоресцентные эмбрионы продемонстрировали динамику движения клеток во время нейруляции. EosFP был обнаружен в части хорды , что показывает возможность использования EosFP в экспериментах по картированию судеб . [ 4 ]
Инженерные варианты
[ редактировать ]мЭос4
[ редактировать ]Было разработано множество новых мономерных версий EosFP, которые имеют преимущества перед EosFP дикого типа. Разработанный командой исследовательского кампуса Janelia Farm при Медицинском институте Говарда Хьюза, mEos4 обладает более высокой фотостабильностью и более длительной способностью визуализации, чем EosFP. Он также обладает высокой устойчивостью к химическим фиксаторам, таким как PFA, глютеральдегид и OsO4, которые используются для консервации образцов. mEos4 эффективен при более высоких температурах, чем EosFP, фотоконвертируется с повышенной скоростью и имеет более высокую амплитуду излучения как в зеленом, так и в красном флуоресцентном состоянии. Применения белка mEos4 включают микроскопию локализации фотоактивации (PALM), корреляционную световую/электронную микроскопию (CLEM), индикацию активности белка и интеграцию активности (апостериорная визуализация активности белка с течением времени). [ 10 ]
мЭос2
[ редактировать ]mEosFP — еще один мономерный вариант Eos, который эффективно сворачивается при 37 градусах Цельсия. Там, где tdEos (тандемный димер) не может сливаться с такими мишенями, как гистоны , тубулин , промежуточные нити и щелевые соединения , а mEos (мономерный), который можно успешно использовать только при 30 градусах Цельсия, mEos2 представляет собой инженерный вариант, который может эффективно складываться при 37 градусах. Цельсия и успешно метят цели, нетерпимые к слиянию с другими димерами флуоресцентного белка. mEos2 демонстрирует почти идентичные спектральные свойства, яркость, pKa, фотоконверсию, контрастность и свойства созревания, что и WT Eos. Точность локализации mEos2 в два раза выше, чем у других мономерных флуоресцентных белков. [ 10 ]
КамПАРИ
[ редактировать ]Также в исследовательском кампусе Джанелия с использованием EosFP были разработаны новые флуоресцентные молекулы, известные как CaMPARI (фотоактивируемый кальцием логометрический интегратор). [ 11 ] Постоянный сигнал преобразования зеленого в красный был связан с чувствительным к кальцию белком кальмодулином , так что изменение цвета в слитой конструкции зависело от высвобождения кальция, сопровождаемого нервной активностью. CaMPARI способен постоянно отмечать нейроны , которые активны в любое время, а также может быть нацелен на синапсы . [ 12 ] Эта визуализация возможна в широком объеме ткани мозга, в отличие от ограниченного обзора, доступного с помощью микроскопа. Это также позволяет визуализировать нервную активность во время сложного поведения, поскольку исследуемому организму разрешено двигаться свободно, а не под микроскопом. Это также позволяет наблюдать за нейронами в определенные периоды поведения. CaMPARI до сих пор использовался для маркировки активных нейронных цепей у мышей , рыбок данио и плодовых мух . [ 13 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с Иванченко Сергей; Рёкер, Карлхайнц; Освальд, Франц; Виденманн, Йорг; Ниенхаус, Г. Ульрих (2005). «Направленная зелено-красная фотоконверсия EosFP, флуоресцентного маркерного белка» . Журнал биологической физики . 31 (3–4): 249–259. дои : 10.1007/s10867-005-0174-z . ISSN 0092-0606 . ПМЦ 3456337 . ПМИД 23345897 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж к Виденманн, Йорг; Иванченко Сергей; Освальд, Франц; Шмитт, Флориан; Рёкер, Карлхайнц; Салих, Аня; Шпиндлер, Клаус-Дитер; Ниенхаус, Г. Ульрих (9 ноября 2004 г.). «EosFP, флуоресцентный маркерный белок с УФ-индуцируемым преобразованием флуоресценции из зеленого в красный» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 101 (45): 15905–15910. Бибкод : 2004PNAS..10115905W . дои : 10.1073/pnas.0403668101 . ISSN 0027-8424 . ПМК 528746 . ПМИД 15505211 .
- ^ Jump up to: а б с д и Виденманн, Йорг; Ниенхаус, Г. Ульрих (2006). «Визуализация живых клеток с помощью EosFP и других фотоактивируемых маркерных белков семейства GFP». Экспертное обозрение по протеомике . 3 (3): 361–374. дои : 10.1586/14789450.3.3.361 . ПМИД 16771707 . S2CID 20234668 .
- ^ Jump up to: а б с д Ниенхаус, Г. Ульрих; Ниенхаус, Карин; Хёльцле, Анжела; Иванченко Сергей; Ренци, Фабиана; Освальд, Франц; Вольф, Майкл; Шмитт, Флориан; Рёкер, Карлхайнц (2006). «Фотоконвертируемый флуоресцентный белок EosFP: биофизические свойства и применение в клеточной биологии». Фотохимия и фотобиология . 82 (2): 351–8. дои : 10.1562/2005-05-19-ra-533 . ПМИД 16613485 . S2CID 24752546 .
- ^ Jump up to: а б с д и Мизуно, Хидеаки; Мал, Тапас Кумар; Тонг, Кит И.; Андо, Рёко; Фурута, Тошиаки; Икура, Мицухико; Мияваки, Ацуши (1 октября 2003 г.). «Фотоиндуцированное расщепление пептида при превращении зеленого в красный флуоресцентного белка» . Молекулярная клетка . 12 (4): 1051–1058. дои : 10.1016/S1097-2765(03)00393-9 . ПМИД 14580354 .
- ^ Jump up to: а б Матур, Джайдип; Радхамони, Ресми; Синклер, Элисон М.; Доносо, Ана; Данн, Натали; Роуч, Элиз; Рэдфорд, Девон; Мохагех, П.С. Мохаммад; Логан, Дэвид К. (1 декабря 2010 г.). «Фотоконвертируемые субклеточные зонды зеленого цвета в красный на основе mEosFP для растений» . Физиология растений . 154 (4): 1573–1587. дои : 10.1104/стр.110.165431 . ISSN 0032-0889 . ПМК 2996014 . ПМИД 20940350 .
- ^ Jump up to: а б с д и Ниенхаус, Карин; Ниенхаус, Г. Ульрих; Виденманн, Йорг; Нар, Герберт (28 июня 2005 г.). «Структурная основа фотоиндуцированного расщепления белка и преобразования зеленого в красный флуоресцентного белка EosFP» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (26): 9156–9159. Бибкод : 2005PNAS..102.9156N . дои : 10.1073/pnas.0501874102 . ISSN 0027-8424 . ПМК 1166600 . ПМИД 15964985 .
- ^ Jump up to: а б Андо, Рёко; Хама, Хироши; Ямамото-Хино, Мики; Мизуно, Хидеаки; Мияваки, Ацуши (01 октября 2002 г.). «Оптический маркер, основанный на индуцированной УФ-излучением фотоконверсии флуоресцентного белка из зеленого в красный» . Труды Национальной академии наук . 99 (20): 12651–12656. Бибкод : 2002PNAS...9912651A . дои : 10.1073/pnas.202320599 . ISSN 0027-8424 . ПМЦ 130515 . ПМИД 12271129 .
- ^ Лукьянов; и др. (2005). «Фотоактивируемые флуоресцентные белки». Nature Reviews Молекулярно-клеточная биология . 6 (11): 885–91. дои : 10.1038/nrm1741 . ПМИД 16167053 . S2CID 23734846 .
- ^ Jump up to: а б «mEos2 и mEos4 | Исследовательский кампус Джанелия» . www.janelia.org . Проверено 28 ноября 2017 г.
- ^ Фоске, Б.Ф.; Сан, Ю.; Дана, Х.; Ян, Коннектикут; Охяма, Т.; Тадросс, MR; Патель, Р.; Златич, М. ; Ким, Д.С.; Аренс, МБ; Джаяраман, В. (13 февраля 2015 г.). «Метки активных нейронных цепей in vivo с помощью разработанных интеграторов кальция» . Наука . 347 (6223): 755–760. Бибкод : 2015Sci...347..755F . дои : 10.1126/science.1260922 . ISSN 0036-8075 . ПМИД 25678659 . S2CID 206562601 .
- ^ Перес-Альварес, Альберт; Фири, Бренна С.; О'Тул, Райан Дж.; Ян, Вэй; Арганда-Расинг, Игнатий; Ламот-Молина, Пол Дж.; Мойерт, Бенджамин; Мор, Мануэль А.; Панзера, Лорен С.; Шульце, Кристиан; Шрайтер, Эрик Р. (2020). «Стоп-кадровая визуализация синаптической активности с использованием SynTagMA» . Природные коммуникации . 11 (1): 2464. Бибкод : 2020NatCo..11.2464P . дои : 10.1038/s41467-020-16315-4 . ISSN 2041-1723 . ПМК 7235013 . ПМИД 32424147 .
- ^ «Новый флуоресцентный белок навсегда маркирует нейроны, которые срабатывают» . HHMI.org . Проверено 1 декабря 2017 г.