Разрушение клеток

Разрушитель лабораторных клеток

Разрушение клеток — это метод или процесс высвобождения биологических молекул изнутри клетки .

Методы

Производство биологически интересных молекул с использованием методов клонирования и культивирования позволяет изучать и производить соответствующие молекулы. За исключением выделенных молекул, клетки, производящие интересующие молекулы, должны быть разрушены. На этой странице обсуждаются различные методы. Другой метод разрушения называется снятием крыши с ячейки .

Бисерный метод

В обычном лабораторном механическом методе разрушения клеток используются стеклянные , керамические или стальные шарики диаметром 0,1–2 мм (0,004–0,08 дюйма), смешанные с образцом, суспендированным в водном растворе . Впервые разработанная Тимом Хопкинсом в конце 1970-х годов, смесь образца и гранул подвергается интенсивному перемешиванию путем перемешивания или встряхивания. Шарики сталкиваются с клеточным образцом, раскалывая клетку и высвобождая внутриклеточные компоненты . В отличие от некоторых других методов, механический сдвиг является умеренным, во время гомогенизации что приводит к получению превосходных мембранных или субклеточных препаратов. Метод, часто называемый «бисерообразованием», хорошо работает для всех типов клеточного материала — от спор до животных и растений тканей . Это наиболее широко используемый метод дрожжей лизиса , степень разрушения которого может достигать более 50% (до 95%). Он имеет преимущество перед другими методами механического разрушения клеток, поскольку позволяет разрушать образцы очень небольшого размера, обрабатывать множество образцов одновременно без проблем перекрестного загрязнения и не выделять потенциально вредные аэрозоли в процессе .

В простейшем примере метода равный объем шариков добавляется к суспензии клеток или тканей в пробирке и образец энергично перемешивается в обычном лабораторном вихревом смесителе . Хотя время обработки медленное (в 3–10 раз больше, чем в специальных встряхивающих машинах) , оно хорошо работает с легко разрушаемыми клетками и стоит недорого.

Успешное взбалтывание шариков зависит не только от конструктивных особенностей встряхивателя (которые учитывают частоту колебаний встряхивания, ход или расстояние встряхивания, ориентацию встряхивания и ориентацию флакона), но и от выбора правильного размера шариков (0,1–6 мм (0,004 мм). –0,2 дюйма в диаметре), состав шариков (стекло, керамика, сталь) и нагрузка шариков во флаконе .

В большинстве лабораторий измельчение шариков производится партиями от одной до двадцати четырех запечатанных пластиковых флаконов или центрифужных пробирок . Образец и крошечные шарики перемешиваются со скоростью около 2000 колебаний в минуту в специально разработанных шейкерах возвратно-поступательного действия, приводимых в движение мощными электродвигателями . Разрушение клеток завершается через 1–3 минуты встряхивания. Значительно более высокие темпы разрушения клеток достигаются с помощью разновидности бисера под названием SoniBeast . В отличие от обычных машин, он перемешивает шарики с помощью вихревого движения со скоростью 20 000 колебаний в минуту. с глубокими лунками, Более крупные машины для взбивания шариков, которые содержат планшеты для микротитрования также сокращают время процесса, как и диспенсеры для шариков, предназначенные для быстрой загрузки шариков в несколько флаконов или микропланшетов. Также доступны предварительно загруженные флаконы и микропланшеты.

Все высокоэнергетические бисерные машины нагревают образец примерно на 10 градусов в минуту. Это происходит из-за фрикционных столкновений шариков при гомогенизации. Охлаждение образца во время или после измельчения шариков может быть необходимо для предотвращения повреждения термочувствительных белков, таких как ферменты. Нагревание пробы можно контролировать путем взбивания шариков в течение коротких интервалов времени с охлаждением на льду между каждым интервалом, путем обработки флаконов в предварительно охлажденных алюминиевых держателях для флаконов или путем циркуляции газообразного хладагента через машину во время взбивания шариков.

Другая конфигурация бисера, подходящая для больших объемов проб, использует вращающийся фторуглеродный ротор внутри камеры объемом 15, 50 или 200 мл для перемешивания гранул. В этой конфигурации камера может быть окружена статической рубашкой охлаждения. Используя ту же самую конфигурацию ротора/камеры, можно использовать большие коммерческие машины для обработки многих литров клеточной суспензии . В настоящее время эти машины ограничены переработкой одноклеточных организмов, таких как дрожжи, водоросли и бактерии .

Криопульверизация

Образцы с жестким внеклеточным матриксом, такие как соединительная ткань животных, некоторые образцы биопсии опухолей, венозная ткань, хрящ, семена и т. д., измельчаются в мелкий порошок путем ударного измельчения при температуре жидкого азота. Этот метод, известный как криопульверизация, основан на том факте, что биологические образцы, содержащие значительную долю воды, становятся хрупкими при чрезвычайно низких температурах. Эта техника была впервые описана Смакером и Пфистером в 1975 году, которые назвали ее криовоздействием. Авторы продемонстрировали, что клетки эффективно разрушаются этим методом, подтвердив с помощью фазовой и электронной микроскопии, что плоскости разрушения пересекают клеточные стенки и цитоплазматические мембраны.

Этот метод можно реализовать с использованием ступки и пестика, охлажденных до температуры жидкого азота, но использование этого классического аппарата трудоемко, и часто возникает проблема потери образца. Для этой цели также доступны специализированные измельчители из нержавеющей стали, известные как измельчители тканей. Они требуют меньше ручных усилий, обеспечивают хорошее извлечение проб и их легко чистить между пробами.Преимуществами этого метода являются более высокие выходы белков и нуклеиновых кислот из небольших образцов твердых тканей, особенно при использовании в качестве предварительного шага к упомянутым выше методам механического или химического разрушения клеток/растворителя.

Разрушение ячейки высокого давления

С 1940-х годов высокое давление использовалось в качестве метода разрушения клеток, в первую очередь во French Pressure Cell Press , или для краткости French Press. Этот метод был разработан Чарльзом Стейси Френчем и использует высокое давление для пропускания клеток через узкое отверстие, вызывая лизис клеток из-за сил сдвига, испытываемых при перепаде давления. Хотя френч-прессы стали основным продуктом во многих микробиологических лабораториях, их производство в значительной степени прекращено, что привело к возрождению альтернативных применений аналогичной технологии.

Современные физические разрушители клеток обычно работают под действием пневматического или гидравлического давления. Хотя пневматические машины обычно дешевле, их производительность может быть ненадежной из-за изменений рабочего давления на протяжении всего хода воздушного насоса. Обычно считается, что гидравлические машины обладают превосходной способностью к лизису, особенно при обработке трудноразрушаемых образцов, таких как дрожжи или грамположительные бактерии , благодаря их способности поддерживать постоянное давление на протяжении всего хода поршня. Поскольку френч-пресс, работающий под гидравлическим давлением, способен к лизису более 90% наиболее часто используемых типов клеток, его часто считают золотым стандартом в эффективности лизиса, и современные машины часто сравнивают с ним не только с точки зрения лизиса. эффективность, но также с точки зрения безопасности и простоты использования. Некоторые производители также пытаются улучшить традиционную конструкцию, изменяя свойства этих машин, помимо давления, прогоняющего пробу через отверстие. Одним из таких примеров является компания Constant Systems, которая недавно показала, что их устройства Cell Disruptors не только соответствуют производительности традиционной френч-прессы, но и стремятся достичь тех же результатов при гораздо меньшей мощности.

Технология циклического давления («PCT»). PCT — это запатентованная технологическая платформа, которая использует чередующиеся циклы гидростатического давления между окружающим и сверхвысоким уровнями (до 90 000 фунтов на квадратный дюйм) для безопасного, удобного и воспроизводимого контроля действий молекул в биологических образцах, например, разрыва (лиза). клеток и тканей человека, животных, растений и микробов, а также инактивация патогенов. Системы с поддержкой PCT (инструменты и расходные материалы) решают некоторые сложные проблемы, присущие подготовке биологических проб. Преимущества ПКТ включают: (а) экстракцию и восстановление большего количества мембранных белков, (б) улучшенное переваривание белков, (в) дифференциальный лизис в смешанной основе образца, (г) инактивацию патогенов, (д) ​​повышенное обнаружение ДНК и (е) изысканный контроль процесса подготовки проб.

Метод микрофлюидизации, используемый для разрушения клеток, сильно влияет на физико-химические свойства суспензии лизированных клеток, такие как размер частиц, вязкость, выход белка и активность фермента. В последние годы метод микрофлюидизации приобрел популярность при разрушении клеток благодаря простоте использования и эффективности разрушения многих различных типов клеток. Технология микрофлюидайзера была лицензирована компанией Arthur D. Little и впервые была разработана и использована в 1980-х годах, первоначально как инструмент для создания липосом . С тех пор он использовался в других приложениях, таких как наноэмульсии разрушения клеток и уменьшение размера твердых частиц, среди других.

За счет использования микроканалов с фиксированной геометрией и насоса-интенсификатора высокие скорости сдвига создаются , которые разрывают клетки. Этот метод лизиса клеток может привести к разрушению более 90% клеток E. coli.

Многие белки чрезвычайно чувствительны к температуре и во многих случаях могут начать денатурировать уже при температуре всего 4 градуса Цельсия. Внутри микроканалов температура превышает 4 градуса Цельсия, но машина спроектирована так, чтобы быстро охлаждаться, поэтому время воздействия на клетки повышенных температур чрезвычайно короткое ( время пребывания 25–40 мс). Благодаря эффективному контролю температуры микрофлюидизатор дает более высокие уровни активных белков и ферментов, чем другие механические методы, когда белки чувствительны к температуре.

Изменения вязкости также часто наблюдаются при разрушении клеток. Если вязкость клеточной суспензии высока, это может затруднить последующую обработку, например, фильтрацию и точное пипетирование. Изменения вязкости, наблюдаемые при использовании микрофлюидизатора, относительно невелики и уменьшаются при дальнейших дополнительных проходах через машину.

В отличие от других методов механического разрушения, микрофлюидизатор разрушает клеточные мембраны эффективно, но мягко, в результате чего образуются относительно большие фрагменты клеточной стенки (450 нм), что облегчает разделение клеточного содержимого. Это может привести к сокращению времени фильтрации и лучшему разделению центрифугированием.

Технология микрофлюидизации масштабируется от одного миллилитра до тысяч литров.

Декомпрессия азота

Для декомпрессии азота большие количества азота сначала растворяются в ячейке под высоким давлением в подходящем сосуде высокого давления . Затем, когда давление газа внезапно сбрасывается, азот выходит из раствора в виде расширяющихся пузырьков, которые растягивают мембраны каждой клетки до тех пор, пока они не разрываются и не высвобождают содержимое клетки.

Декомпрессия азота более защищает ферменты и органеллы , чем ультразвуковые и механические методы гомогенизации, и выгодно отличается от контролируемого разрушающего действия, получаемого в гомогенизаторе с пестиком и ступкой из ПТФЭ и стеклянной ступки. В то время как другие разрушающие методы зависят от трения или механического сдвига , вызывающего выделение тепла, процедура декомпрессии азота сопровождается адиабатическим расширением, которое охлаждает образец, а не нагревает его.

Подушка инертного азота, насыщающая клеточную суспензию и гомогенат, обеспечивает защиту от окисления клеточных компонентов. другие газы: диоксид углерода , закись азота , окись углерода Хотя в этом методе использовались и и сжатый воздух, азот предпочтителен из-за его нереакционной природы и потому, что он не изменяет pH суспендирующей среды. Кроме того, предпочтительным является азот, поскольку он обычно доступен по низкой цене и при давлениях, подходящих для этой процедуры.

После высвобождения субклеточные вещества не подвергаются постоянному истощению , которое может денатурировать образец или вызвать нежелательное повреждение. Нет необходимости следить за пиком между активностью фермента и процентом разрушения. Поскольку пузырьки азота генерируются внутри каждой ячейки, одна и та же разрушающая сила применяется равномерно по всему образцу, что обеспечивает необычайную однородность продукта. Могут быть получены бесклеточные гомогенаты.

Этот метод используется для гомогенизации клеток и тканей, высвобождения неповрежденных органелл , подготовки клеточных мембран , высвобождения лабильных биохимических веществ и получения однородных и воспроизводимых гомогенатов, не подвергая образец сильному химическому или физическому стрессу.

Этот метод особенно хорошо подходит для лечения клеток млекопитающих и других мембраносвязанных клеток. Его также успешно использовали для лечения растительных клеток , для высвобождения вируса из оплодотворенных яиц и для лечения хрупких бактерий . Не рекомендуется для необработанных бактериальных клеток. Дрожжи , грибки , споры и другие материалы с прочными клеточными стенками плохо реагируют на этот метод.

См. также

• Лизис
• Ультразвуковой гомогенизатор
• обработка ультразвуком
• Гомогенизация (химия)
• Гомогенизатор