ChIL-секвенирование
Секвенирование ChIL (ChIL-seq), также известное как секвенирование с маркировкой интеграции хроматина , представляет собой метод, используемый для анализа взаимодействий белка с ДНК . Секвенирование ChIL сочетает в себе контролируемое расщепление, направленное на антитела, транспозазой Tn5 с массово-параллельным секвенированием ДНК для идентификации сайтов связывания ДНК-ассоциированных белков. Его можно использовать для картирования глобальных сайтов связывания ДНК с точностью до любого интересующего белка. В настоящее время ChIP-Seq является наиболее распространенным методом, используемым для изучения отношений белок-ДНК, однако он страдает рядом практических и экономических ограничений, которых нет у ChIL-секвенирования. ChIL-Seq — это точная методика, позволяющая уменьшить потери образцов и применимая к одиночным клеткам. [ 1 ]
Использование
[ редактировать ]Секвенирование ChIL можно использовать для изучения регуляции генов или для анализа факторов транскрипции и связывания других белков, связанных с хроматином. Взаимодействия белок-ДНК регулируют экспрессию генов и ответственны за многие биологические процессы и болезненные состояния. Эта эпигенетическая информация дополняет анализ генотипа и экспрессии. ChIL-Seq является альтернативой текущему стандарту ChIP-seq . ChIP-Seq имеет ограничения из-за этапа перекрестного связывания в протоколах ChIP-Seq, который может способствовать маскировке эпитопа и генерировать ложноположительные сайты связывания. [ 2 ] [ 3 ] Кроме того, ChIP-seq страдает неоптимальным соотношением сигнал/шум и плохим разрешением. [ 4 ] Преимущество ChIL-секвенирования заключается в том, что он является более простым методом, подходящим для ввода небольшого количества образцов из-за высокого отношения сигнал/шум, требующего меньшей глубины секвенирования для более высокой чувствительности. [ 5 ]
Специфические участки ДНК, находящиеся в прямом физическом взаимодействии с белками, такими как факторы транскрипции, могут быть выделены с помощью , конъюгированного с белком-А (pA), Tn5 связанного с интересующим белком. Расщепление, опосредованное Tn5, приводит к образованию библиотеки сайтов-мишеней ДНК, связанных с интересующим белком in situ . Секвенирование подготовленных библиотек ДНК и сравнение с базами данных последовательностей всего генома позволяет исследователям анализировать взаимодействия между целевыми белками и ДНК, а также различия в эпигенетических хроматина модификациях . Таким образом, метод ChIL-Seq может применяться к белкам и их модификациям, включая факторы транскрипции , полимеразы , структурные белки , модификации белков и модификации ДНК.
Протоколы
[ редактировать ]Подробные рабочие процессы ChIL-Seq доступны в репозитории методов с открытым доступом. [ 6 ]
Ограничения
[ редактировать ]Основным ограничением ChIL-seq является вероятность чрезмерного переваривания ДНК из-за неправильного времени магний-зависимой реакции Tn5. Это смещено в сторону открытого хроматина, такого как ATAC-Seq и подобные методы. [ 5 ] Аналогичное ограничение существует для современных протоколов ChIP-Seq, где необходимо оптимизировать ферментативный или ультразвуковой сдвиг ДНК. Как и в случае с ChIP-Seq , требуется антитело хорошего качества, нацеленное на интересующий белок. Как и в случае с другими методами с использованием Tn5, подготовка библиотеки имеет сильную погрешность GC и низкую чувствительность в областях с низким содержанием GC или геномах с высокой дисперсией содержания GC. [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]
ChIL-Seq требует многочисленных лабораторных шагов и занимает больше времени, чем другие методы, такие как CUT&RUN или CUT&Tag . Это по-прежнему широко применимый метод, позволяющий избежать потери образца и подходящий для небольшого количества клеток. Однако стоимость расходных материалов для ChIL-Seq существенно ниже, что позволяет обрабатывать больше образцов. [ 10 ]
Похожие методы
[ редактировать ]- Sono-Seq : Идентичен ChIP-Seq, но без этапа иммунопреципитации.
- HITS-CLIP : также называется CLIP-Seq и используется для обнаружения взаимодействий с РНК , а не с ДНК.
- PAR-CLIP : метод идентификации сайтов связывания клеточных РНК-связывающих белков .
- RIP-Chip : аналогичен ChIP-Seq, но не использует методы перекрестного связывания и использует микрочиповый анализ. вместо секвенирования
- SELEX : используется для определения консенсусных последовательностей связывания.
- Конкурс-ЧИП : измеряет относительную динамику замены ДНК.
- ChiRP-Seq : измеряет ДНК и белки, связанные с РНК.
- ChIP-exo : использует обработку экзонуклеазой для достижения разрешения до одной пары оснований.
- ChIP-nexus : потенциальное улучшение ChIP-exo , способное достичь разрешения до одной пары оснований.
- DRIP-seq : использует антитела S9.6 для осаждения трехцепочечных гибридов DND:РНК, называемых R-петлями .
- TCP-seq : Принципиально аналогичный метод измерения динамики трансляции мРНК.
- DamID : использует обогащение метилированных последовательностей ДНК для обнаружения взаимодействия белок-ДНК без антител.
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ «Когда меньше значит больше: многообещающий подход к эпигеномному профилированию с низким количеством клеток» . Наука Дейли. 11 декабря 2018 года . Проверено 24 декабря 2019 г.
- ^ Мейер Калифорния, Лю XS (ноябрь 2014 г.). «Выявление и смягчение систематической ошибки в методах секвенирования нового поколения для биологии хроматина» . Обзоры природы. Генетика . 15 (11): 709–21. дои : 10.1038/nrg3788 . ПМЦ 4473780 . ПМИД 25223782 .
- ^ Баранелло Л., Кузин Ф., Сэнфорд С., Левенс Д. (май 2016 г.). «Смещение ChIP как функция времени сшивки» . Хромосомные исследования . 24 (2): 175–81. дои : 10.1007/s10577-015-9509-1 . ПМК 4860130 . ПМИД 26685864 .
- ^ Хе С, Бонасио Р (февраль 2017 г.). «На голову выше» . электронная жизнь . 6 . дои : 10.7554/eLife.25000 . ПМК 5310838 . ПМИД 28199181 .
- ^ Перейти обратно: а б Харада А., Маэхара К., Ханда Т., Аримура Ю., Ногами Дж., Хаяси-Таканава Ю., Сирахигэ К., Курумизака Х., Кимура Х., Окава Ю. (декабрь 2018 г.). «Метод маркировки интеграции хроматина позволяет проводить эпигеномное профилирование с меньшими затратами». Природная клеточная биология . 21 (2): 287–296. дои : 10.1038/s41556-018-0248-3 . ПМИД 30532068 . S2CID 54463772 .
- ^ Окава И., Кимура Х., Ханда Т., Харада А., Маэхара К. (20 декабря 2018 г.). «Подробный протокол ─ Мечение интеграции хроматина» . Протокол обмена . дои : 10.1038/protex.2018.122 .
- ^ Лан, Джеймс Х.; Инь, Юйсинь; Рид, Элейн Ф.; Моуа, Кевин; Томас, Кимберли; Чжан, Цюхэн (март 2015 г.). «Влияние трех методов создания библиотеки Illumina на смещение GC и определение генотипа HLA» . Иммунология человека . 76 (2–3): 166–175. дои : 10.1016/j.humimm.2014.12.016 . ПМК 5089167 . ПМИД 25543015 .
- ^ Сато, Мицухико П; Огура, Ёситоши; Накамура, Кейджи; Нисида, Рюрико; Гото, Ясухиро; Хаяси, Масахиро; Хисацунэ, Дзюнзо; Сугай, Мотоюки; Такэхико, Ито; Хаяси, Тецуя (1 октября 2019 г.). «Сравнение систематической ошибки секвенирования доступных в настоящее время наборов для подготовки библиотек для секвенирования бактериальных геномов и метагеномов Illumina» . Исследование ДНК . 26 (5): 391–398. дои : 10.1093/dnares/dsz017 . ПМК 6796507 . ПМИД 31364694 .
- ^ Чен, Йен-Чун; Лю, Цунглин; Ю, Чун-Хуэй; Чан, Цзэн-Ю; Хван, Чи-Чуан (29 апреля 2013 г.). «Влияние смещения GC в данных секвенирования следующего поколения на сборку генома De Novo» . ПЛОС ОДИН . 8 (4): e62856. Бибкод : 2013PLoSO...862856C . дои : 10.1371/journal.pone.0062856 . ПМЦ 3639258 . ПМИД 23638157 .
- ^ Ханда, Тецуя; Харада, Акихито; Маэхара, Кадзумицу; Сато, Сёко; Накао, Масару; Гото, Наоки; Курумизака, Хитоши; Окава, Ясуюки; Кимура, Хироши (октябрь 2020 г.). «Метка интеграции хроматина для картирования ДНК-связывающих белков и модификаций с низкими затратами» . Протоколы природы . 15 (10): 3334–3360. дои : 10.1038/s41596-020-0375-8 . ПМИД 32807906 . S2CID 221145784 . Проверено 3 декабря 2020 г.