Анализ защиты гентамицина

Анализ защиты гентамицина , или анализ выживаемости , или анализ инвазии — это метод, используемый в микробиологии . Он используется для количественной оценки способности патогенных бактерий проникать в эукариотические клетки .

о способности интернализованных бактерий избегать уничтожения антибиотиками . Анализ основан на нескольких наблюдениях, сделанных в 1970-х годах, в которых сообщалось ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]} Этот анализ начали использовать в биологических исследованиях в начале 1980-х годов.

Предыстория и принцип

Внутриклеточным бактериям необходимо проникнуть в клетки-хозяева ( клетки организма инфицированного ) , чтобы реплицировать и распространять инфекцию. Многие виды шигелл (вызывают бактериальную дизентерию ), сальмонелл ( брюшной тиф ), микобактерий ( проказа и туберкулез ) и листерий ( листериоз ), и это лишь некоторые из них, являются внутриклеточными.

Некоторые антибиотики не могут проникать в эукариотические клетки. Следовательно, эти антибиотики не могут повредить внутриклеточные бактерии, которые уже интернализовались. Использование таких антибиотиков позволяет нам различать бактерии, которым удается проникать в эукариотические клетки, и те, которым это не удается. Применение такого антибиотика к культуре эукариотических клеток, инфицированных бактериями, убьет бактерии, оставшиеся вне клеток, сохранив при этом те, которые проникли. Антибиотиком выбора для этого анализа является аминогликозид гентамицин .

Процедура

Клетки HeLa обычно используются в качестве эукариотических клеток в анализе защиты от гентамицина, но можно использовать и другие клетки. Что касается бактерий, можно анализировать только виды, чувствительные к гентамицину.

Анализ проводится на пластиковых микропланшетах , которые обычно используются в лабораториях для культивирования эукариотических клеток. Клеткам позволяют расти в лунках в течение ночи, создавая плоский слой. Бактерии выращивают отдельно в течение ночи. На следующий день эукариотические клетки инокулируют бактериями и инкубируют вместе в течение часа. Центрифугирование планшетов в течение нескольких минут может помочь привести клетки и бактерии в контакт и инициировать инфекцию.

После заражения в пластинки добавляют гентамицин и инкубируют их в течение часа, позволяя антибиотику убить все бактерии, которые не смогли проникнуть в клетки и остались снаружи. Затем планшеты хорошо промывают, чтобы удалить мертвые бактерии. Затем эукариотические клетки лизируются с использованием детергента , чаще всего Тритона Х-100 .

Бактерии, проникшие в клетки и оставшиеся живыми, теперь высвобождаются, и их высевают на чашки с твердой средой . Подсчет колоний, образовавшихся на чашках на следующий день, и знание того, сколько бактерий было использовано в начале анализа, позволяет исследователю рассчитать процент бактерий, которые смогли проникнуть в эукариотические клетки.

Использование, преимущества и предостережения

Анализ защиты гентамицина обычно используется в исследованиях патогенов. С помощью этого метода можно легко оценить вклад конкретных генов или белков в способность бактерий проникать в клетки. Ген, о котором идет речь, может быть нокаутирован , и инвазивность бактерий сравнится с инвазивностью нормальных бактерий дикого типа . Условия окружающей среды, такие как уровень pH и температура , также можно оценить на предмет их влияния на инвазивность.

Анализ защиты гентамицина очень чувствителен, поскольку он может обнаружить проникновение даже отдельных бактерий. У него есть несколько недостатков:

Гентамицин иногда может проникать в эукариотические клетки и убивать интернализированные бактерии. Это может произойти, если проницаемость клеток каким-либо образом увеличилась во время анализа, иногда из-за плохого обращения с клетками.
Интернализированные бактерии иногда могут быть не полностью защищены от внешней среды, например, когда фагосома ( вакуоль , окружающая бактерию внутри клетки) каким-то образом дефектна. Гентамицин может убить эти бактерии.
Гентамицин может не уничтожить все бактерии, оставшиеся вне клеток.

Чтобы помочь оценить точность конкретного анализа, положительный и отрицательный контроль следует выполнить . При проведении анализа, как описано выше, в анализ следует включать бактерии, которые известны как полностью инвазивные (положительный контроль), и бактерии, известные как неинвазивные (отрицательный контроль).

Альтернативным анализом инвазии является дифференциальный иммуноокрашивающий анализ, основанный на связывании антител с бактериями до и после инвазии. Антитела излучают флуоресцентный цветной свет , и результаты этого анализа просматриваются под микроскопом .

См. также

Облигатный внутриклеточный паразит

Ссылки

^ Манделл Г.Л. (1973). «Взаимодействие внутрилейкоцитарных бактерий и антибиотиков» . Джей Клин Инвест . 52 (7): 1673–1679. дои : 10.1172/JCI107348 . ПМК 302442 . ПМИД 4718959 .
^ Водо П. и Вальдфогель Ф.А. (1979). «Антибактериальная активность гентамицина в присутствии полиморфноядерных лейкоцитов человека» . Противомикробные средства Химиотер . 16 (6): 743–749. дои : 10.1128/aac.16.6.743 . ПМК 352946 . ПМИД 533256 .

[1] Манделл Г.Л. (1973). «Взаимодействие внутрилейкоцитарных бактерий и антибиотиков» . Джей Клин Инвест . 52 (7): 1673–1679. дои : 10.1172/JCI107348 . ПМК 302442 . ПМИД 4718959 .

[2] Водо П. и Вальдфогель Ф.А. (1979). «Антибактериальная активность гентамицина в присутствии полиморфноядерных лейкоцитов человека» . Противомикробные средства Химиотер . 16 (6): 743–749. дои : 10.1128/aac.16.6.743 . ПМК 352946 . ПМИД 533256 .

[ 1 ]

[ 2 ]