Фаллоидин
 | |
 | |
| Идентификаторы | |
|---|---|
3D model ( JSmol ) | |
| ЧЭБИ | |
| ХимическийПаук | |
| Информационная карта ECHA | 100.037.697 |
ПабХим CID | |
| НЕКОТОРЫЙ | |
Панель управления CompTox ( EPA ) | |
| Характеристики | |
| С 35 Ч 48 Н 8 О 11 С | |
| Молярная масса | 788.87 g·mol −1 |
| Появление | Иглы |
| Температура плавления | 281 ° C (538 ° F, 554 К) (гидравлический) |
Если не указано иное, данные приведены для материалов в стандартном состоянии (при 25 °C [77 °F], 100 кПа). | |
Фаллоидин принадлежит к классу токсинов, называемых фаллотоксинами , которые обнаружены в грибе-смертнике ( Amanita phalloides ) . Это жесткий бициклический гептапептид , который приводит к летальному исходу через несколько дней при попадании в кровоток. Основным симптомом отравления фаллоидином является острый голод из-за разрушения клеток печени. Он действует путем связывания и стабилизации нитевидного актина ( F-актина ) и эффективно предотвращает деполимеризацию актиновых волокон. Благодаря тесному и избирательному связыванию с F-актином производные фаллоидина, содержащие флуоресцентные метки , широко используются в микроскопии для визуализации F-актина в биомедицинских исследованиях.
Открытие и предыстория
[ редактировать ]Фаллоидин был одним из первых циклических пептидов открытых . Он был выделен из гриба смертельной шапки и кристаллизован Федором Линеном и Ульрихом Виландом. [1] в 1937 году. [2] Его структура необычна тем, что содержит связь цистеин - триптофан, образующую бициклический гептапептид. Эта связь ранее не была охарактеризована и значительно затрудняет выяснение структуры фаллоидина. Они определили присутствие атома серы с помощью УФ-спектроскопии и обнаружили, что эта кольцевая структура имеет слегка сдвинутую длину волны. Эксперименты с никелем Ренея подтвердили наличие серы в триптофановом кольце. Исследователи обнаружили, что десульфуризированный фаллоидин по-прежнему имеет круглую форму, что продемонстрировало, что структура фаллоидина обычно является бициклической. После линеаризации аминокислотная последовательность десульфурированного фаллоидина была выяснена путем деградации по Эдману Виландом и Шоном в 1955 году. [3]
Благодаря его высокому сродству к актину ученые обнаружили его потенциальное использование в качестве окрашивающего реагента для эффективной визуализации актина в микроскопии. Производные, конъюгированные с флуорофорами, широко продаются. Благодаря своей способности избирательно связывать нитевидный актин (F-актин), а не мономеры актина (G-актин), флуоресцентно меченный фаллоидин более эффективен, чем антитела против актина. [4]
Синтез
[ редактировать ]Биосинтез
[ редактировать ]Фаллоидин представляет собой бициклический гептапептид, содержащий необычную связь цистеин-триптофан. Ген, кодирующий синтез фаллоидина, является частью семейства MSDIN гриба Смертельной шапки и кодирует пропептид из 34 аминокислот. Остаток пролина фланкирует область из семи остатков, которая позже станет фаллоидином. После трансляции пептид должен быть протеолитически вырезан, циклизован, гидроксилирован, сшит Trp-Cys с образованием триптатионина и эпимеризован с образованием D-Thr. Порядок и точный биохимический механизм этих стадий еще полностью не изучены. В настоящее время считается, что необходимые гены биосинтеза сгруппированы рядом с генами MSDIN. [5]
Первой посттрансляционной модификацией 34-мера является протеолитическое расщепление с помощью пролилолигопептидазы (POP) для удаления «лидерного» пептида из 10 аминокислот. Затем POP циклизирует гептапептид Ala-Trp-Leu-Ala-Thr-Cys-Pro путем транспептидации между аминокислотой 1 (Ala) и аминокислотой 7 (Pro). Считается, что затем происходит образование триптатионина посредством сшивания Trp-Cys. [5]
Химический синтез
[ редактировать ]Поскольку фаллоидин используется из-за его способности связывать и стабилизировать полимеры актина, но клетки не могут легко его усвоить, ученые обнаружили, что производные фаллоидина более полезны в исследованиях. По сути, это соответствует типичному синтезу малых пептидов с использованием гидроксил-пролина. Основной трудностью синтеза является образование триптатиониновой связи (цистеин-триптофановая сшивка).
Ниже представлен общий синтетический механизм, реализованный Anderson et al. в 2005 году для твердофазного синтеза ала 7 -фаллоидин, который по остатку 7 отличается от фаллоидина, как указано ниже. [6] THPP означает тетрагидропиранил-полистироловый линкер, который используется для соединения молекулы с твердой основой во время синтеза. Обратите внимание, что приведенный ниже синтез представляет собой просто общую схему, показывающую порядок образования связей для соединения исходных материалов. Ала 7 -фаллоидин, а также многие другие подобные варианты фаллоидина полезны для увеличения поглощения клетками по сравнению с фаллоидином и для прикрепления флуорофора, помогающего визуализировать F-актин в микроскопии.
Первый полный синтез фаллоидина был достигнут посредством сочетания твердофазного и растворофазного синтеза (Baosheng Liu и Jianheng Zhang, патент США, US 8569452 B2). Физические и химические свойства синтетического фаллоидина такие же, как и у природного фаллоидина.
Механизм действия
[ редактировать ]
Фаллоидин связывает F- актин , предотвращая его деполимеризацию и отравление клетки. Фаллоидин специфически связывается на границе между субъединицами F-актина, связывая соседние субъединицы вместе. Фаллоидин, бициклический гептапептид, связывается с актиновыми нитями гораздо прочнее, чем с актиновыми мономерами, что приводит к уменьшению константы скорости диссоциации субъединиц актина от концов нитей, что существенно стабилизирует актиновые нити за счет предотвращения деполимеризации нитей. [7] Более того, обнаружено, что фаллоидин ингибирует активность гидролиза АТФ F-актина. [8] Таким образом, фаллоидин захватывает мономеры актина в конформацию, отличную от G-актина, и стабилизирует структуру F-актина за счет значительного снижения константы скорости диссоциации мономера, события, связанного с захватом АДФ. [8] В целом обнаружено, что фаллоидин стехиометрически реагирует с актином, сильно способствует полимеризации актина и стабилизирует полимеры актина. [9]
Фаллоидин действует по-разному при различных концентрациях в клетках. При введении в цитоплазму в низких концентрациях фаллоидин рекрутирует менее полимеризованные формы цитоплазматического актина, а также филамин в стабильные «островки» агрегированных полимеров актина, однако он не мешает стрессовым волокнам, т.е. толстым пучкам микрофиламентов. [9] Веланд и др. также отмечает, что при более высоких концентрациях фаллоидин вызывает сокращение клеток. [9]
Симптомы
[ редактировать ]Вскоре после его открытия ученые вводили фаллоидин мышам и обнаружили, что его ЛД 50 составляет 2 мг/кг при внутрибрюшинной инъекции . При воздействии минимальной смертельной дозы этим мышам потребовалось несколько дней, чтобы умереть. Единственным очевидным побочным эффектом отравления фаллоидином является сильный голод. Это связано с тем, что фаллоидин поглощается печенью только через мембранные транспортные белки желчных солей. [10] Попадая в печень, фаллоидин связывает F-актин, предотвращая его деполимеризацию. Этот процесс требует времени, чтобы разрушить клетки печени. Почки также могут поглощать фаллоидин, но не так эффективно, как печень. Здесь фаллоидин вызывает нефроз. [11]
Использование в качестве инструмента визуализации
[ редактировать ]
Свойства фаллоидина делают его полезным инструментом для изучения распределения F-актина в клетках путем мечения фаллоидина флуоресцентными аналогами и использования их для окрашивания актиновых нитей для световой микроскопии. Флуоресцентные производные фаллоидина оказались чрезвычайно полезными для локализации актиновых нитей в живых или фиксированных клетках, а также для визуализации отдельных актиновых нитей in vitro . [7] Была разработана методика высокого разрешения для обнаружения F-актина на световом и электронном микроскопическом уровнях с использованием фаллоидина, конъюгированного с флуорофором эозином , который действует как флуоресцентная метка. [12] В этом методе, известном как флуоресцентное фотоокисление, флуоресцентные молекулы можно использовать для запуска окисления диаминобензидина (DAB) с созданием продукта реакции, который можно сделать электронно-плотным и обнаружить с помощью электронной микроскопии. [12] Количество визуализируемой флуоресценции можно использовать в качестве количественной меры количества нитчатого актина в клетках, если использовать насыщающие количества флуоресцентного фаллоидина. [7] Следовательно, иммунофлуоресцентная микроскопия наряду с микроинъекцией фаллоидина может быть использована для оценки прямых и непрямых функций цитоплазматического актина на разных стадиях формирования полимера. [9] Таким образом, флуоресцентный фаллоидин можно использовать как важный инструмент при изучении актиновых сетей с высоким разрешением.
Использование и ограничения
[ редактировать ]
Фаллоидин намного меньше антитела, которое обычно используется для мечения клеточных белков для флуоресцентной микроскопии, что позволяет гораздо более плотно маркировать нитчатый актин и получать гораздо более подробные изображения, особенно при более высоком разрешении.
Немодифицированные фаллоидины не проникают через клеточные мембраны, что делает их менее эффективными в экспериментах с живыми клетками. Синтезированы производные фаллоидина со значительно повышенной клеточной проницаемостью.
Клетки, обработанные фаллоидинами, проявляют ряд токсических эффектов и часто погибают. [7] Кроме того, важно отметить, что клетки, обработанные фаллоидином, будут иметь более высокие уровни актина, связанного с их плазматическими мембранами, а микроинъекция фаллоидина в живые клетки изменит распределение актина, а также подвижность клеток. [7]
См. также
[ редактировать ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Г. Семенца, ЕС Слейтер, Р. Йенике. Избранные темы истории биохимии. Личные воспоминания – Google книги
- ^ Линен Ф., Виланд У (18 ноября 1937 г.). «О токсинах смертоносного гриба. IV». Анналы химии Юстуса Либиха (на немецком языке). 533 (1): 93–117. дои : 10.1002/jlac.19385330105 .
- ^ Виланд Т., Шон В. (16 января 1955 г.). «О токсинах зеленого смертоносного гриба X. Связь. Состав фаллоидина». «Анналы химии» Юстуса Либиха . 593 (2): 157–178. дои : 10.1002/jlac.19555930204 .
- ^ Иммуногистохимия: основы и методы . Springer Science & Business Media. 2010. стр. 92–3. ISBN 978-3-642-04609-4 .
- ^ Перейти обратно: а б Уолтон Джей Ди; Халлен-Адамс Хе; Ло Х (4 августа 2010 г.). «Рибосомальный биосинтез циклических пептидных токсинов грибов мухоморов» . Пептидная наука . 94 (5): 659–664. дои : 10.1002/bip.21416 . ПМК 4001729 . ПМИД 20564017 .
- ^ Андерсон М.О., Шелат А.А., Киплан Гай Р. (16 апреля 2005 г.). «Твердофазный подход к фаллотоксинам: полный синтез [ала 7 ]-фаллоидин». J. Org. Chem . 70 (12): 4578–84. doi : 10.1021/jo0503153 . PMID 15932292 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и Купер Дж. А. (октябрь 1987 г.). «Влияние цитохалазина и фаллоидина на актин» . Дж. Клеточная Биол . 105 (4): 1473–8. дои : 10.1083/jcb.105.4.1473 . ПМК 2114638 . ПМИД 3312229 .
- ^ Перейти обратно: а б Барден Дж.А., Мики М., Хэмбли Б.Д., Дос Ремедиос К.Г. (февраль 1987 г.). «Локализация фаллоидинов и сайтов связывания нуклеотидов на актине» . Евро. Дж. Биохим . 162 (3): 583–8. дои : 10.1111/j.1432-1033.1987.tb10679.x . ПМИД 3830158 .
- ^ Перейти обратно: а б с д Веланд Дж., Осборн М., Вебер К. (декабрь 1977 г.). «Вызванная фаллоидином полимеризация актина в цитоплазме культивируемых клеток препятствует передвижению и росту клеток» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 74 (12): 5613–7. Бибкод : 1977PNAS...74.5613W . дои : 10.1073/pnas.74.12.5613 . ПМК 431831 . ПМИД 341163 .
- ^ Виланд Т. (1963). «Химико-токсикологические исследования с циклопептидами Amanita phalloides» . Чистая и прикладная химия . 3 (6): 339–350. дои : 10.1351/pac196306030339 .
- ^ Шредер, Эберхард; Любке, Клаус (2014). Пептиды, Том II: Синтез, появление и действие биологически активных полипептидов . Эльзевир. п. 475. ИСБН 978-1-4832-5986-4 . Специализируется на синтезе биологически активных полипептидов и аналогов.
- ^ Перейти обратно: а б Капани Ф., Диринк Т.Дж., Эллисман М.Х., Бушонг Э., Бобик М., Мартоне М.Е. (1 ноября 2001 г.). «Фаллоидин-эозин с последующим фотоокислением: новый метод локализации F-актина на световом и электронном микроскопическом уровнях» . Дж. Гистохим. Цитохим . 49 (11): 1351–61. дои : 10.1177/002215540104901103 . ПМИД 11668188 .
Ядовитые Мухомор грибы |
|---|
