Perturb-seq

Perturb-seq (также известный как CRISP-seq и CROP-seq ) относится к высокопроизводительному методу выполнения секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) на объединенных скринингах генетических пертурбаций. Perturb-seq сочетает в себе мультиплексную инактивацию генов, опосредованную CRISPR , с секвенированием одноклеточной РНК для оценки комплексных экспрессии генов фенотипов для каждого нарушения. Вывод о функции гена путем применения генетических пертурбаций для нокдауна или выключения гена и изучения полученного фенотипа известен как обратная генетика . Perturb-seq — это метод обратной генетики, который позволяет исследовать фенотипы на уровне транскриптома , чтобы выяснить функции генов во многих клетках в массовом параллельном режиме.

Протокол Perturb-seq использует технологию CRISPR для инактивации определенных генов и штрих-кодирования ДНК каждой направляющей РНК, что позволяет объединить все возмущения вместе, а затем провести деконволюцию с присвоением каждого фенотипа определенной направляющей РНК . на основе капель Платформы микрофлюидики (или другие методы сортировки и разделения клеток) используются для выделения отдельных клеток, а затем выполняется секРНК-секвенирование для создания профилей экспрессии генов для каждой клетки. По завершении протокола проводятся биоинформатические анализы, чтобы связать каждую конкретную клетку и возмущение с транскриптомным профилем, характеризующим последствия инактивации каждого гена.

История

В декабрьском выпуске журнала Cell за 2016 год были опубликованы две сопутствующие статьи, каждая из которых представляла и описывала эту технику. Третья статья, описывающая концептуально аналогичный подход (названный CRISP-seq), также была опубликована в том же выпуске. В октябре 2016 года метод CROP-seq для скрининга одноклеточных CRISPR был представлен в препринте на сайте bioRxiv. и позже опубликовано в журнале Nature Methods . Хотя в каждой статье были описаны основные принципы сочетания возмущений, опосредованных CRISPR, с секвенированием scRNA, их экспериментальные, технологические и аналитические подходы различались в нескольких аспектах, чтобы исследовать отдельные биологические вопросы, демонстрируя широкую полезность этой методологии. Например, статья CRISPR-seq продемонстрировала осуществимость исследований in vivo с использованием этой технологии, а протокол CROP-seq облегчает большие скрининги, предоставляя вектор, который делает читаемой саму направляющую РНК (вместо того, чтобы полагаться на экспрессированные штрих-коды), что позволяет для одноэтапного клонирования направляющей РНК. В статье, опубликованной в журнале Cell в июне 2022 года , были опубликованы результаты одного из первых скринингов Perturb-seq в масштабе генома, которые выявили новые пертурбации, способствующие хромосомной нестабильности, а также изменения в экспрессии митохондриально-кодируемых транскриптов в ответ на различные формы митохондриального стресса.

Экспериментальный рабочий процесс

Разработка и выбор единой библиотеки РНК CRISPR

Обзор рабочего процесса Perturb-seq

Объединенные библиотеки CRISPR , которые обеспечивают инактивацию генов, могут иметь форму либо нокаута, либо интерференции. Библиотеки нокаута воздействуют на гены посредством двухцепочечных разрывов, что приводит к возникновению склонного к ошибкам пути репарации негомологичного соединения концов, вызывающего разрушительные вставки или делеции. CRISPR-интерференция С другой стороны, (CRISPRi) использует каталитически неактивную нуклеазу для физического блокирования РНК-полимеразы , эффективно предотвращая или останавливая транскрипцию . Perturb-seq использовался как с нокаутным подходом, так и с CRISPRi в работе Dixit et al. бумага и Адамсон и др. бумага, соответственно.

Объединение всех направляющих РНК в единый экран основано на штрих-кодах ДНК, которые действуют как идентификаторы для каждой уникальной направляющей РНК. Существует несколько коммерчески доступных объединенных библиотек CRISPR, включая библиотеку направляющих штрих-кодов, использованную в исследовании Adamson et al. Библиотеки CRISPR также можно создавать по индивидуальному заказу с использованием инструментов для проектирования sgRNA, многие из которых перечислены на странице инструментов CRISPR/cas9 в Википедии.

Лентивирусные векторы

Дизайн вектора экспрессии sgRNA будет во многом зависеть от проведенного эксперимента, но требует следующих основных компонентов:

1. Промоутер
2. Сайты ограничения
3. праймеров Сайты связывания
4. огРНК
5. Руководство по штрих-коду
6. Репортерный ген :
   • Флуоресцентный ген: векторы часто конструируют так, чтобы они включали ген, кодирующий флуоресцентный белок, так что успешно трансдуцированные клетки можно визуально и количественно оценить по их экспрессии.
   • устойчивости к антибиотикам Ген : подобно флуоресцентным маркерам, гены устойчивости к антибиотикам часто включаются в векторы, чтобы обеспечить отбор успешно трансдуцированных клеток.
7. CRISPR-ассоциированная эндонуклеаза: Cas9 или другие CRISPR-ассоциированные эндонуклеазы, такие как Cpf1, должны быть введены в клетки, которые не экспрессируют их эндогенно. Из-за большого размера этих генов для экспрессии эндонуклеазы отдельно от вектора экспрессии sgRNA можно использовать двухвекторную систему.

Трансдукция и отбор

Клетки обычно трансдуцируются с множественностью заражения (MOI) от 0,4 до 0,6 лентивирусных частиц на клетку, чтобы максимизировать вероятность получения большинства клеток, содержащих одну направляющую РНК. Если представляют интерес эффекты одновременных возмущений, можно применить более высокий MOI для увеличения количества трансдуцированных клеток с более чем одной направляющей РНК. Затем проводят отбор успешно трансдуцированных клеток с использованием флуоресцентного анализа или анализа антибиотиков, в зависимости от репортерного гена, используемого в векторе экспрессии.

Подготовка одноклеточной библиотеки

После успешного отбора трансдуцированных клеток необходимо выделить отдельные клетки для проведения секРНК-секвенирования. Perturb-seq и CROP-seq были выполнены с использованием капельной технологии для изоляции отдельных клеток. в то время как близкородственный CRISP-seq выполнялся с использованием подхода на основе микролунков. После выделения клеток на уровне отдельных клеток обратная транскрипция происходит , амплификация и секвенирование для создания профилей экспрессии генов для каждой клетки. Многие подходы scRNA-seq включают уникальные молекулярные идентификаторы (UMI) и клеточные штрих-коды на этапе обратной транскрипции для индексации отдельных молекул РНК и клеток соответственно. Эти дополнительные штрих-коды помогают количественно оценить транскрипты РНК и связать каждую из последовательностей с клеткой их происхождения.

Биоинформатический анализ

Выравнивание и обработка считываний выполняются для сопоставления качественных считываний с эталонным геномом. Деконволюция клеточных штрих-кодов, направляющих штрих-кодов и UMI позволяет связать направляющие РНК с клетками, которые их содержат, тем самым позволяя связать профиль экспрессии генов каждой клетки с конкретным возмущением. Дальнейший анализ транскрипционных профилей будет полностью зависеть от интересующего биологического вопроса. T-распределенное стохастическое встраивание соседей (t-SNE) — это широко используемый алгоритм машинного обучения для визуализации многомерных данных, полученных в результате scRNA-seq, на двумерной диаграмме рассеяния. Авторы, которые впервые выполнили Perturb-seq, разработали собственную вычислительную систему под названием MIMOSCA, которая прогнозирует эффекты каждого возмущения с использованием линейной модели и доступна в открытом репозитории программного обеспечения.

Преимущества и ограничения

Perturb-seq использует современные технологии молекулярной биологии для интеграции многоэтапного рабочего процесса, сочетающего высокопроизводительный скрининг со сложными фенотипическими результатами. По сравнению с альтернативными методами, используемыми для нокдауна или нокаута генов, такими как РНКи , нуклеазы с цинковыми пальцами или эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN), применение возмущений на основе CRISPR обеспечивает большую специфичность, эффективность и простоту использования. Еще одним преимуществом этого протокола является то, что, хотя большинство подходов скрининга позволяют анализировать только простые фенотипы, такие как жизнеспособность клеток, scRNA-seq позволяет получить гораздо более богатые фенотипические данные с количественными измерениями экспрессии генов во многих клетках одновременно. Таким образом, Perturb-seq может сочетать высокую производительность прямой генетики с точки зрения количества генетических нарушений с богатым фенотипическим измерением обратной генетики .

Однако, хотя большой и полный объем данных может быть преимуществом, он также может представлять собой серьезную проблему. Известно, что показатели экспрессии РНК в отдельных клетках дают «зашумленные» данные со значительным количеством ложноположительных результатов. И большой размер, и шум, связанные с scRNA-seq, вероятно, потребуют новых и мощных вычислительных методов и биоинформатических конвейеров, чтобы лучше понять полученные данные. Еще одна проблема, связанная с этим протоколом, — создание крупномасштабных библиотек CRISPR. Подготовка этих обширных библиотек зависит от сравнительного увеличения ресурсов, необходимых для культивирования огромного количества клеток, необходимых для успешного скрининга многих нарушений.

Параллельно с этими одноклеточными методами были разработаны другие подходы для реконструкции генетических путей с использованием секвенирования РНК всего организма. Эти методы используют единую совокупную статистику, называемую коэффициентом эпистаза всего транскриптома, для управления реконструкцией пути. В отличие от статистической основы описанных выше методов, этот коэффициент может быть более устойчивым к шуму и интуитивно интерпретируется с точки зрения бейтсоновского эпистаза. Этот подход был использован для выявления нового состояния в жизненном цикле нематоды C. elegans .

Приложения

Perturb-seq или другие концептуально подобные протоколы могут использоваться для решения широкого круга биологических вопросов, и области применения этой технологии, вероятно, со временем будут расширяться. Три статьи на эту тему, опубликованные в декабрьском номере журнала Journal Cell за 2016 год, продемонстрировали полезность этого метода, применив его к исследованию нескольких различных биологических функций. В статье «Perturb-Seq: анализ молекулярных цепей с помощью масштабируемого профилирования одноклеточной РНК объединенных генетических экранов» авторы использовали Perturb-seq для проведения нокаутов транскрипционных факторов, связанных с иммунным ответом, в сотнях тысяч клеток для исследования клеточные последствия их инактивации. Они также исследовали влияние факторов транскрипции на состояния клеток в контексте клеточного цикла . В исследовании, проведенном UCSF , «Мультиплексная одноклеточная скрининговая платформа CRISPR позволяет систематически анализировать ответ развернутого белка», исследователи подавили несколько генов в каждой клетке, чтобы изучить путь ответа развернутого белка (UPR). Используя аналогичную методологию, но с использованием термина CRISP-seq вместо Perturb-seq, в статье «Рассечение иммунных цепей путем связывания скринингов, полученных из пула CRISPR, с одноклеточной РНК-Seq» был проведен эксперимент для проверки концепции, используя эту технику для исследования. регуляторные пути, связанные с врожденным иммунитетом у мышей. летальность каждого возмущения и анализ эпистаза В этих работах также исследовалась в клетках с множественными возмущениями. Perturb-seq до сих пор использовался с очень небольшим количеством изменений за эксперимент, но теоретически его можно масштабировать для охвата всего генома. Наконец, препринт за октябрь 2016 г. и последующий документ продемонстрировать биоинформационную реконструкцию сигнального пути рецептора Т-клеток в клетках Jurkat на основе данных CROP-seq.

Недавно рабочий процесс Perturb-seq (CROP-seq) был адаптирован для обеспечения возможности скрининга CRISPRi (интерференция CRISPR) в масштабе генома в клетках Jurkat с разрешением одной клетки. Был проведен первый в своем роде скрининг CRISPRi в масштабе генома для проверки факторов, участвующих в сигнальных путях TCR. Более подробно, библиотека направляющих РНК, нацеленная на 18 595 генов человека, была использована для нокдауна генов на основе CRISPR в клетках Jurkat, экспрессирующих эндонуклеазу слияния dCas9- KRAB . В общей сложности один миллион клеток Jurkat был обработан для секвенирования одноклеточной РНК , что позволило получить транскриптомное считывание окончательного списка из 374 маркерных генов, участвующих в передаче сигналов TCR. Биоинформатический анализ подтвердил наличие более 70 известных активаторов и репрессоров сигнальных каскадов TCR, тем самым продемонстрировав потенциал скрининга Perturb-seq (CROP-seq) для поддержки трансляционных исследований.

Хотя в этих публикациях эти протоколы использовались для ответа на сложные биологические вопросы, эту технологию также можно использовать в качестве проверочного анализа, чтобы гарантировать специфичность любого нокдауна или нокаута на основе CRISPR; уровни экспрессии целевых генов, а также других, могут быть измерены параллельно с разрешением одной клетки, чтобы определить, было ли вмешательство успешным, и оценить эксперимент на предмет нецелевых эффектов. Кроме того, эти протоколы позволяют проводить скрининг возмущений в гетерогенных тканях, одновременно получая ответы на экспрессию генов, специфичные для типа клеток.