Количественное определение вируса

Количественная оценка вируса — это подсчет или расчет количества вирусных частиц (вирионов) в образце для определения концентрации вируса. Он используется как в исследованиях и разработках (НИОКР) в академических и коммерческих лабораториях, так и в производственных ситуациях, где количество вируса на различных этапах является важной переменной, которую необходимо контролировать. Например, производство вакцин на основе вирусов , рекомбинантных белков с использованием вирусных векторов и вирусных антигенов требует количественного определения вируса для постоянного мониторинга и/или модификации процесса с целью оптимизации качества продукции и выхода продукции, а также реагирования на постоянно меняющиеся потребности и приложения. Другие примеры конкретных случаев, когда вирусы необходимо количественно оценить, включают клонов скрининг , оптимизацию множественности инфекции (MOI) и адаптацию методов к клеточной культуре .

Существует множество способов классификации методов количественного определения вирусов. Здесь методы сгруппированы в зависимости от того, что измеряется и в каком биологическом контексте. Например, клеточные анализы обычно измеряют инфекционные единицы (активный вирус). Другие методы позволяют измерять концентрацию вирусных белков, ДНК, РНК или молекулярных частиц, но не обязательно измеряют инфекционность. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, что часто определяет, какой метод используется для конкретных приложений. ^{[ 1 ]}

Клеточные анализы

Анализ бляшек

Анализы на основе бляшек являются широко используемым методом определения концентрации вируса с точки зрения инфекционной дозы . Анализы бляшек определяют количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) в образце вируса, что является одним из показателей количества вируса. Этот анализ основан на микробиологическом методе, проводимом в чашках Петри или многолуночных планшетах для клеточных культур . В частности, сливающийся монослой - хозяев клеток заражается путем нанесения образца, содержащего вирус в различных разведениях, а затем покрытия полутвердой средой , такой как агар или карбоксиметилцеллюлоза , чтобы предотвратить беспорядочное распространение вирусной инфекции, как это происходит при жидкая среда. образуется Вирусная бляшка после того, как вирус заражает клетку внутри фиксированного клеточного монослоя. ^{[ 2 ]} Зараженная вирусом клетка будет лизировать и распространять инфекцию на соседние клетки, где цикл заражения-лизиса повторяется. Это создаст область инфицированных, лизированных клеток (вирусная бляшка), окруженную неинфицированными неповрежденными клетками. Бляшку можно увидеть с помощью оптического микроскопа или визуально, используя методы окрашивания клеток (например, окрашивание раствором кристаллического фиолетового для визуализации интактных и лизированных клеток). ^{[ 3 ]} Образование бляшек может занять 3–14 дней, в зависимости от анализируемого вируса. Бляшки обычно подсчитываются вручную, и количество бляшек в сочетании с коэффициентом разведения инфекционного раствора (образца, первоначально нанесенного на клетки) используется для расчета количества единиц, образующих бляшки, на единицу объема образца (БОЕ/мл). . Число БОЕ/мл представляет собой концентрацию инфекционных вирусных частиц в образце и основано на предположении, что каждая образовавшаяся бляшка представляет собой первоначальное заражение одной инфекционной вирусной частицей. ^{[ 4 ]}^{[ 5 ]}

Анализ формирования фокуса (FFA)

Анализ формирования фокуса (FFA) представляет собой разновидность анализа бляшек, но вместо того, чтобы зависеть от лизиса клеток для обнаружения образования бляшек, FFA использует иммуноокрашивания методы с использованием флуоресцентно-меченых антител, специфичных для вирусного антигена, для обнаружения инфицированных клеток-хозяев и инфекционных клеток. вирусные частицы до того, как образуется настоящий зубной налет. FFA особенно полезен для количественного определения классов вирусов, которые не лизируют клеточные мембраны, поскольку эти вирусы не поддаются анализу бляшек. Как и при анализе бляшек, монослои клеток-хозяев инфицируются различными разведениями образца вируса и инкубируются в течение относительно короткого периода инкубации (например, 24–72 часа) в полутвердой среде, которая ограничивает распространение инфекционного вируса, создавая локализованные скопления (очаги) инфицированных клеток. Затем планшеты исследуют флуоресцентно меченными антителами против вирусного антигена и используют флуоресцентную микроскопию для подсчета и количественного определения количества очагов. Метод FFA обычно дает результаты за меньшее время, чем анализы бляшек или пятипроцентная инфекционная доза в тканевой культуре (TCID). ₅₀ ) анализов (см. ниже), но они могут быть более дорогими с точки зрения необходимых реагентов и оборудования. Время завершения анализа также зависит от размера площади, которую считает пользователь. Большая площадь потребует больше времени, но может обеспечить более точное представление образца. Результаты FFA выражаются в единицах формирования фокуса на миллилитр или FFU/мл. ^{[ 6 ]}

TCID ₅₀Анализ разведения конечной точки

Анализ TCID ₅₀ (50% инфекционной дозы в тканевой культуре) является мерой титра инфекционного вируса . Этот анализ конечного разведения позволяет количественно определить количество вируса, необходимое для уничтожения 50% инфицированных хозяев или для оказания цитопатического эффекта в 50% инокулированных клеток тканевой культуры. Этот анализ может быть более распространенным в клинических исследованиях, где необходимо определить смертельную дозу вируса или если вирус не образует бляшек. ^{[ нужна ссылка ]} При использовании в культуре тканей клетки-хозяева высеивают и добавляют серийные разведения вируса. После инкубации процент гибели клеток (т.е. инфицированных клеток) вручную наблюдают и записывают для каждого разведения вируса, а результаты используют для математического расчета результата TCID ₅₀ . ^{[ 6 ]}^{[ 7 ]} Из-за явных различий в методах и принципах анализа результаты TCID ₅₀ и БОЕ/мл или других анализов на инфекционность не эквивалентны. Этот метод может занять до недели из-за времени инфекционности клеток. ^{[ 8 ]}

Два метода, обычно используемые для расчета TCID ₅₀ (также могут использоваться для расчета других типов конечной точки 50%, таких как EC50 , IC50 и LD50 ):

Копейщик-Кербер ^{[ 9 ]}
Метод Рида-Мюнха

Теоретическая 50 связь между TCID ₅₀ и PFU составляет примерно 0,69 PFU = 1 TCID _на основе распределения Пуассона , ^{[ 10 ]} распределение вероятностей , которое описывает, сколько случайных событий (вирусных частиц), происходящих с известной средней скоростью (титр вируса), вероятно, произойдет в фиксированном пространстве (количество вирусной среды в лунке). Однако следует подчеркнуть, что на практике эта взаимосвязь может не соблюдаться даже для одной и той же комбинации вирус + клетка, поскольку два типа анализа проводятся по-разному, а инфекционность вируса очень чувствительна к различным факторам, таким как возраст клеток, накладываемая среда. , и т. д. Но следующая ссылка определяет отношения по-другому:

Из ATTC : «Предполагая, что используется одна и та же клеточная система, что вирус образует бляшки на этих клетках и что не добавляются никакие процедуры, которые ингибировали бы образование бляшек, можно ожидать, что 1 мл исходного вируса будет содержать около половины количества бляшкообразующие единицы (БОЕ) как TCID ₅₀ . Это всего лишь оценка, но она основана на том, что изначально ожидается, что предельное разведение, которое заразит 50% пораженных клеточных слоев. производят одну бляшку в слоях клеток, которые инфицированы. В некоторых случаях случайно могут образоваться две или более бляшек, и поэтому фактическое количество БОЕ следует определять экспериментально.

«Математически ожидаемые PFU будут несколько больше половины TCID ₅₀ , поскольку отрицательные трубки в TCID ₅₀ представляют собой нулевые единицы, образующие бляшки, а каждая из положительных трубок представляет одну или несколько единиц, образующих бляшки. Получается более точная оценка. применив распределение Пуассона Где ⁠ . $P(o)$ ⁠ — доля отрицательных пробирок, m — среднее количество инфекционных единиц в объёме (БОЕ/мл), ⁠ $P(o)=\exp(-m)$ ⁠ . Для любого титра, выраженного как TCID ₅₀ , ⁠ $P(o)=0.5$ ⁠ . Таким образом ⁠ $\exp(-m)=0.5$ ⁠ и ⁠ $m=-\ln 0.5$ ⁠ что составляет ~ 0,7.

«Поэтому можно умножить титр TCID ₅₀ (на мл) на 0,7, чтобы предсказать среднее количество БОЕ/мл. При фактическом применении таких расчетов помните, что рассчитанное среднее значение будет действительным только в том случае, если изменения в протоколе, необходимые для визуализации бляшек, оправдают себя. не изменяют экспрессию инфекционного вируса по сравнению с экспрессией в условиях, используемых для TCID ₅₀ .

«Таким образом, в качестве рабочей оценки можно принять материал с TCID ₅₀ , равным 1 × 10. ⁵ TCID ₅₀ /мл даст 0,7 × 10 ⁵ БОЕ/мл». ^{[ 11 ]}

Анализы на основе белков и антител

Существует несколько вариантов количественного анализа вируса на основе белков и антител. Как правило, эти методы количественно определяют либо количество всего белка, либо количество конкретного вирусного белка в образце, а не количество инфицированных клеток или вирусных частиц. Количественная оценка обычно основана на колориметрическом или флуоресцентном обнаружении. Некоторые варианты анализа определяют количество белков непосредственно в образце, в то время как другие варианты требуют инфицирования клеток-хозяев и инкубации, чтобы обеспечить рост вируса перед количественным определением. Используемый вариант зависит, прежде всего, от количества белка (т.е. вирусного белка) в исходном образце и чувствительности самого анализа. Если требуется инкубация и рост вируса, перед анализом часто проводят лизис/переваривание клеток и/или вируса. Большинство белковых методов являются относительно быстрыми и чувствительными. ^{[ нужна ссылка ]} но требуют стандартов качества для точной калибровки и количественного определения белка, а не фактической концентрации вирусных частиц. Ниже приведены конкретные примеры широко используемых анализов на основе белков.

Анализ гемагглютинации

Анализ гемагглютинации (НА) является распространенным нефлуоресцентным количественным анализом белка, специфичным для гриппа . Он основан на том факте, что гемагглютинин , поверхностный белок вирусов гриппа, агглютинирует эритроциты (т.е. заставляет эритроциты слипаться). В этом анализе разведения образца вируса гриппа инкубируют с 1% раствором эритроцитов в течение одного часа и визуально определяют разведение вируса, при котором впервые происходит агглютинация. Анализ дает результат в единицах гемагглютинации (HAU) с типичным соотношением PFU к HAU в 10 единицах. ⁶ диапазон. ^{[ 12 ]}^{[ 13 ]}^{[ 14 ]} Этот анализ занимает ~ 1–2 часа.

Анализ ингибирования гемагглютинации представляет собой распространенную разновидность анализа НА, используемого для измерения уровней гриппоспецифичных антител в сыворотке крови. В этом варианте сывороточные антитела к вирусу гриппа будут препятствовать прикреплению вируса к эритроцитам. Следовательно, гемагглютинация ингибируется, когда антитела присутствуют в достаточной концентрации. ^{[ 15 ]}

Анализ бицинхониновой кислоты (BCA)

Анализ бицинхониновой кислоты (BCA; также известный как анализ Смита) основан на простом колориметрическом измерении и является широко используемым анализом количественного определения белка. ^{[ 16 ]} BCA аналогичен анализам белка Лоури или Брэдфорда . Реагент для анализа BCA был впервые разработан и произведен на коммерческой основе компанией Pierce Chemical Company (сейчас принадлежит Thermo Fisher Scientific ), которая владела патентом до 2006 года. ^{[ 17 ]}^{[ 18 ]}

В анализе BCA пептидные связи белка количественно восстанавливают Cu. ²⁺ в Cu ¹⁺, что дает светло-голубой цвет. BCA хелатирует Cu ¹⁺ в соотношении 2:1, что приводит к более интенсивно окрашенному виду, поглощающему длину волны 562 нм. Поглощение образца при длине волны 562 нм используется для определения объемной концентрации белка в образце. Результаты анализа сравниваются с известными стандартными кривыми после анализа с помощью спектрофотометра или планшет-ридера . ^{[ 19 ]} Общее время анализа составляет от 30 минут до одного часа. Хотя этот анализ является повсеместным и быстрым, ему не хватает специфичности к вирусным белкам, поскольку он подсчитывает весь белок в образце. Таким образом, препарат вируса, подлежащий количественному определению, должен содержать очень низкие уровни белков клетки-хозяина.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Иммуноферментный анализ ( ELISA ) — это анализ на основе антител , в котором используется антиген -специфическое антитело, химически связанное с ферментом (или связанное со вторым антителом, связанным с ферментом), для обнаружения присутствия неизвестного количества антигена ( например, вирусный белок) в образце. Событие связывания антитело-антиген обнаруживается и/или количественно оценивается посредством способности фермента преобразовывать реагент- субстрат для получения детектируемого сигнала, который затем можно использовать для расчета концентрации целевого антигена в образце. ^{[ 20 ]} Пероксидаза хрена (HRP) является распространенным ферментом, используемым в схемах ELISA из-за его способности усиливать сигнал и повышать чувствительность анализа.

Существует множество разновидностей или типов анализов ELISA, но их обычно можно классифицировать как непрямые , конкурентные , сэндвич-анализы или обратные . ^{[ 21 ]}

Анализ одиночной радиальной иммунодиффузии (SRID)

Анализ одиночной радиальной иммунодиффузии (SRID), также известный как метод Манчини, представляет собой анализ белка, который определяет количество специфического вирусного антигена путем иммунодиффузии в полутвердой среде (например, агаре). Среда содержит антисыворотку, специфичную к интересующему антигену, и антиген помещается в центр диска. По мере того как антиген диффундирует в среду, он создает кольцо преципитата, которое растет до тех пор, пока не будет достигнуто равновесие. Время анализа может варьироваться от 10 часов до дней в зависимости от времени установления равновесия антигена и антитела. Диаметр зоны кольца линейно связан с логарифмом концентрации белка и сравнивается с диаметрами зон известных стандартов белка для количественного определения. ^{[ 22 ]}

Анализы ДНК и РНК

Количественная полимеразная цепная реакция (кПЦР)

Количественная ПЦР использует полимеразной цепной реакции химию для амплификации вирусной ДНК или РНК для получения достаточно высоких концентраций для обнаружения и количественного определения с помощью флуоресценции. В общем, количественная оценка с помощью кПЦР основана на серийных разведениях стандартов известной концентрации, которые анализируются параллельно с неизвестными образцами для калибровки и сравнения. Количественное обнаружение может быть достигнуто с использованием широкого спектра стратегий флуоресцентного обнаружения, включая зонды, специфичные для последовательности , или неспецифические флуоресцентные красители, такие как SYBR Green . ^{[ 23 ]} Зонды, специфичные для последовательности, такие как TaqMan Molecular Beacons или Skorpion, связываются только с ДНК соответствующей последовательности, образующейся в ходе реакции. Краситель SYBR Green связывается со всей двухцепочечной ДНК. ^{[ 24 ]} вырабатывается в ходе реакции.

Хотя SYBR Green прост в использовании, его недостаточная специфичность и низкая чувствительность вынуждают большинство лабораторий использовать схемы обнаружения qPCR на основе зондов. ^{[ нужна ссылка ]} Существует множество вариантов кПЦР, включая метод сравнительного порога, который позволяет провести относительную количественную оценку путем сравнения значений Ct (циклы ПЦР, которые показывают статистически значимое увеличение продукта) из нескольких образцов, включающих внутренний стандарт. ^{[ 25 ]}

ПЦР амплифицирует все нуклеиновые кислоты- мишени , включая те, которые происходят из интактных инфекционных вирусных частиц, из дефектных вирусных частиц, а также из свободных нуклеиновых кислот в растворе. По этой причине результаты количественной ПЦР (выраженные в количестве копий генома на мл), вероятно, будут выше, чем результаты TEM. Для количественной оценки вируса соотношение целых вирионов и копий нуклеиновой кислоты редко составляет один к одному. Это связано с тем, что во время репликации вируса нуклеиновая кислота и вирусные белки не всегда образуются в соотношении 1:1, и процесс сборки вируса приводит к образованию полных вирионов, а также пустых капсидов и/или избытка свободных вирусных геномов. На примере вируса ящура соотношение целых вирионов и копий РНК в активно реплицирующейся клетке-хозяине составляет примерно 1:1000. ^{[ 26 ]} Преимущества титрования с помощью кПЦР включают быстрое время выполнения (1–4 часа) и чувствительность (можно обнаружить гораздо меньшую концентрацию вирусов, чем другие методы).

Анализы частиц

Настраиваемое резистивное импульсное считывание (TRPS)

Настраиваемое резистивное импульсное зондирование (TRPS) — это метод, который позволяет проводить высокопроизводительные измерения отдельных вирусных частиц, когда они проходят через нанопоры с регулируемым размером. по одной ^{[ 27 ]} Преимущество этого метода заключается в одновременном определении размера и концентрации вирусных частиц в растворе с высоким разрешением. Это можно использовать для оценки стабильности образца и вклада агрегатов, а также общей концентрации вирусных частиц (vp/мл). ^{[ 28 ]}

Измерение на основе TRPS происходит в ионном буфере, и предварительное окрашивание образцов перед анализом не требуется, поэтому этот метод является более быстрым, чем те, которые требуют предварительной обработки флуоресцентными красителями, при этом общее время подготовки и измерения составляет менее 10 минут на образец. ^{[ нужна ссылка ]} Анализ вирусов на основе TRPS коммерчески доступен через системы qViro-X , которые имеют возможность химической дезинфекции путем автоклавирования после проведения измерения.

Масс-спектроскопия одиночного вируса с индуктивно связанной плазмой (SV ICP-MS)

Этот метод аналогичен масс-спектроскопии одночастичной индуктивно связанной плазмы (SP ICP-MS ), открытой Дегельдре и Фаваргером (2003). ^{[ 29 ]} и позже адаптирован для других наночастиц (например, коллоидов золота, см. Degueldre et al. (2006)). ^{[ 30 ]} SP ICP-MS был адаптирован для анализа масс-спектроскопии одиночного вируса с индуктивно связанной плазмой (SV ICPMS) в комплексном исследовании, например Degueldre (2021). ^{[ 31 ]} Данное исследование предлагает адаптировать этот метод для идентификации и подсчета одиночных вирусов (ВВ). Благодаря записям ИСП-МС многоканального секторного поля высокого разрешения (MC SF) в режиме обнаружения SV подсчет основных и ключевых ионов может позволить анализировать и идентифицировать отдельные вирусы. Подсчет 2–500 вириальных единиц можно выполнить за 20 с. Анализы предлагается проводить в Ar-горелке на мастер -ионы : 12C+, 13C+, 14N+, 15N+ и ключевые ионы 31P+, 32S+, 33S+ и 34S+. Все помехи подробно обсуждаются. Рекомендуется использовать MC ICP-MS высокого разрешения, в то время как изучаются варианты с анаэробной/аэробной атмосферой для улучшения анализа при использовании квадрупольного ICP-MS. Применение для двух типов вируса (SARS-COV2 и бактериофага T5) исследуется с использованием сканирования по времени и анализа фиксированной массы для выбранных ионов вируса, что позволяет охарактеризовать виды с использованием молярных соотношений N/C, P/C и S/C и количественного определения их численная концентрация.

Другие анализы

Проточная цитометрия

Хотя большинство проточных цитометров не обладают достаточной чувствительностью, ^{[ нужна ссылка ]} Существует несколько коммерчески доступных проточных цитометров, которые можно использовать для количественного определения вируса. Счетчик вирусов количественно определяет количество интактных вирусных частиц в образце, используя флуоресценцию для обнаружения колокализованных белков и нуклеиновых кислот. Образцы окрашиваются двумя красителями, специфичными для белков и специфичными для нуклеиновых кислот, и анализируются под воздействием лазерного луча. Количество частиц, вызывающих одновременные события на каждом из двух отдельных каналов флуоресценции, определяется вместе с измеренной скоростью потока пробы для расчета концентрации вирусных частиц (вп/мл). ^{[ 32 ]} Результаты, как правило, аналогичны по абсолютной величине результатам TEM. Анализ имеет линейный рабочий диапазон 10 ⁵–10 ⁹ у.п./мл и время анализа ~10 мин при коротком времени подготовки проб. ^{[ нужна ссылка ]}

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)

Отрицательное окрашивание вируса полиомиелита методом ПЭМ, полоска = 50 нм

Внедренный в ткань участок новых вирионов H1N1

ПЭМ — это специализированный тип микроскопии, в котором для получения изображения образца используется пучок электронов, сфокусированный магнитным полем. ПЭМ обеспечивает получение изображений с пространственным разрешением в 1000 раз большим, чем у светового микроскопа (разрешение до 0,2 нм). ^{[ 33 ]} ультратонкий, отрицательно окрашенный Требуется образец. Подготовка образцов включает нанесение образцов на сетку ПЭМ с покрытием и негативное окрашивание электронно-непрозрачной жидкостью. ^{[ 34 ]} Образцы тканей также можно исследовать, если их разделить на тонкие срезы. Подготовка проб варьируется в зависимости от протокола и пользователя, но обычно для ее завершения требуется несколько часов. На изображениях ПЭМ можно увидеть отдельные частицы вируса, а количественный анализ изображений можно использовать для определения концентрации вируса. Эти изображения с высоким разрешением также предоставляют информацию о морфологии частиц, которую не могут получить большинство других методов. Количественные результаты TEM часто превосходят результаты других анализов. ^{[ нужна ссылка ]} поскольку все частицы, независимо от инфекционности, количественно оцениваются в результате сообщаемых вирусоподобных частиц на мл (vlp/мл). Количественный ПЭМ обычно хорошо работает при концентрациях вируса более 10 ⁶ частиц/мл. Из-за высокой стоимости приборов и большого количества необходимых площадей и вспомогательных средств оборудование ТЕМ доступно только в нескольких лабораториях.

См. также

Ссылки

^ Науки, Благородная жизнь. «Методы количественного определения вирусов» . content.noblelifesci.com . Проверено 7 августа 2023 г.
^ Кауфманн, SH; Кабелиц, Д. (2002). Методы микробиологии Том 32: Иммунология инфекций . Академическая пресса . ISBN 0-12-521532-0 .
^ Баер, Алан; Кен-Холл, Кайлин (4 ноября 2014 г.). «Определение концентрации вируса с помощью анализа бляшек: использование традиционных и новых систем наложения» . Журнал визуализированных экспериментов (93): e52065. дои : 10.3791/52065 . ПМЦ 4255882 . ПМИД 25407402 .
^ Мартин, SJ (1978). Биохимия вирусов . Издательство Кембриджского университета . ISBN 0-12-402033-Х .
^ Якимович, Артур; Андриасян, Вардан; Витте, Роберт; Ван, И.-Сюань; Прасад, Вибху; Суомалайнен, Маарит; Гребер, Урс Ф. (28 сентября 2015 г.). «Plaque2.0 — высокопроизводительная система анализа для оценки передачи вируса между клетками и расширения клональных клеток» . ПЛОС ОДИН . 10 (9): e0138760. Бибкод : 2015PLoSO..1038760Y . дои : 10.1371/journal.pone.0138760 . ISSN 1932-6203 . ПМЦ 4587671 . ПМИД 26413745 .
^ Jump up to: ^а ^б Флинт, SJ; Энквист, В.; Раканиелло, ВР; Скалка, AM (2009). «Вирусологические методы». Принципы вирусологии . АСМ Пресс. ISBN 978-1-55581-443-4 .
^ Линденбах, Бретт Д. «Калькулятор Рида и Мюнха» .
^ «Архивная копия» (PDF) . Архивировано из оригинала (PDF) 27 сентября 2011 г. Проверено 26 февраля 2010 г. {{cite web}}: CS1 maint: архивная копия в заголовке ( ссылка )
^ Кербер, Г. (1931). «Вклад в коллективное лечение серийных фармакологических исследований». Архив экспериментальной патологии и фармакологии Наунина-Шмидеберга . 162 (4). Спрингер Верлаг: 480–483. дои : 10.1007/BF01863914 . S2CID 46017573 .
^ игла (16 апреля 2002 г.). «TCID50 и единица образования бляшек (PFU)» . Проверено 29 мая 2014 г.
^ «Руководство по вирусологической культуре» . www.atcc.org . Проверено 9 августа 2023 г.
^ Киллиан, ML (2008). «Анализ гемагглютинации вируса птичьего гриппа». В Спэкмане, Эрика (ред.). Вирус птичьего гриппа . Том. 436. Хумана Пресс. стр. 47–52. дои : 10.1007/978-1-59745-279-3_7 . ISBN 978-1-58829-939-0 . ПМИД 18370040 .
^ Риммельцваан, ГФ; Баарс, М.; Клаас, Европейский суд; Остерхаус, ADME (1998). «Сравнение гибридизации РНК, анализа гемааглютинации, титрования инфекционного вируса и иммунофлуоресценции как методов мониторинга репликации вируса гриппа in vitro ». Журнал вирусологических методов . 74 (1): 57–66. дои : 10.1016/S0166-0934(98)00071-8 . ПМИД 9763129 .
^ Като, А.; Киётани, К.; Сакаи, Ю.; Ёсида, Т.; Нагай, Ю. (1997). «Парамиксовирус, вирус Сендай, белок V кодирует роскошную функцию, необходимую для вирусного патогенеза» . Журнал ЭМБО . 16 (3): 578–587. дои : 10.1093/emboj/16.3.578 . ПМЦ 1169661 . ПМИД 9034340 .
^ «Анализ торможения гемагглютинации при гриппе» . 27 мая 2009 г.
^ «Анализ бицинхониновой кислоты - обзор | Темы ScienceDirect» . www.sciencedirect.com . Проверено 7 августа 2023 г.
^ Смит, ПК; Крон, Род-Айленд; Хермансон, GT; Маллиа, АК; Гартнер, Ф.Х.; Провенцано, доктор медицины; Фудзимото, ЕК; Гёк, Нью-Мексико; Олсон, Би Джей; Кленк, округ Колумбия (1 октября 1985 г.). «Измерение белка с помощью бицинхониновой кислоты» . Аналитическая биохимия . 150 (1): 76–85. дои : 10.1016/0003-2697(85)90442-7 . ISSN 0003-2697 . ПМИД 3843705 .
^ Ведомство США по патентам и товарным знакам. «Измерение белка с помощью бицинхониновой кислоты» . Гугл Патенты . Проверено 7 августа 2023 г.
^ «Биология белка Пирса» .
^ Кемени, DM; Чаллакомб, SJ (1988). ИФА и другие твердофазные иммуноанализы: теоретические и практические аспекты . Джон Уайли и сыновья . ISBN 0-471-90982-3 .
^ Куби, Дж.; Киндт, Ти Джей; Голдсби, РА; Осборн, бакалавр (2007). Куби Иммунология, 6-е издание . WH Фриман и компания. ISBN 978-1-4292-0211-4 .
^ Родда, С.Дж.; Галличио, штат Ха; Хэмпсон, AW (1981). «Одиночный радиальный иммунодиффузионный анализ выявил небольшие антигенные различия среди гемагглютининов вируса гриппа» . Журнал клинической микробиологии . 14 (5): 479–482. doi : 10.1128/JCM.14.5.479-482.1981 . ПМК 273972 . ПМИД 6171580 .
^ «Протоколы ПЦР/ПЦР в реальном времени» .
^ «Прикладные биосистемы - США» (PDF) .
^ О'Лири, Джей-Джей; Шейлс, О.; Мартин, К.; Кроули, А. (2003). «Технология Такмана и полимеразная цепная реакция в реальном времени». В Крокере, Дж.; Мюррей, П.Г. (ред.). Молекулярная биология в клеточной патологии . Джон Уайли и сыновья . стр. 251–268. ISBN 978-0-470-84475-5 .
^ Каллахан Дж. Д. и др., Использование портативного анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой в реальном времени для быстрого обнаружения вируса ящура. J Am Vet Med Assoc. 1 июня 2002 г.; 220 (11): 1636-42.
^ Стивен Дж. Сауэрби, Мюррей Ф. Брум, Джордж Б. Петерсен. «Апертуры нанометрового размера с динамическим изменением размера для молекулярного зондирования» Датчики и приводы B: Chemical Volume 123, выпуск 1 (2007), страницы 325–330
^ Г. Сет Робертс, Сэм Ю, Цинлу Цзэн, Лесли К.Л. Чан, Уилл Андерсон, Аарон Х. Колби, Марк В. Гринстафф, Стивен Рид, Роберт Фогель. «Настраиваемые поры для измерения концентраций дисперсий синтетических и биологических наночастиц» Биосенсоры и биоэлектроника, 31 стр. 17-25 (2012).
^ К. Дегельдре, П.-Ю. Фаваргер, Анализ коллоидов методом масс-спектроскопии с индуктивно связанной плазмой одночастичной: технико-экономическое обоснование, Коллоиды и поверхности A, 217 (2003) 137-142.
^ C Дегельдре, П.-Ю Фаваргер, С. Уолд, Анализ коллоида золота с помощью одночастичной масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой в одночастичном режиме, Anal Chim Acta, 555 (2006) 263-268.
^ К. Дегельдре, Анализ масс-спектроскопии индуктивно связанной плазмы одного вируса: всестороннее исследование. Таланта, том 228 февраля (2021 г.), 122211.
^ Стоффель, КЛ; Финч, Р.; Кристенсен, К.; Эдвардс, Д.; Роулен, КЛ (2005). «Быстрое определение титра бакуловируса с помощью двухканального счетчика вирусов». Американская биотехнологическая лаборатория . 37 (22): 24–25.
^ Шерман И. «Разрешающая способность электронного микроскопа» . Справочник по физике . Проверено 25 февраля 2010 г.
^ Стеффенс, WL (1998). «Использование трансмиссионной электронной микроскопии для диагностики вирусов у попугаев» . Материалы международных виртуальных конференций по ветеринарной медицине: болезни попугаев . Афины, Джорджия.

[1] Науки, Благородная жизнь. «Методы количественного определения вирусов» . content.noblelifesci.com . Проверено 7 августа 2023 г.

[2] Кауфманн, SH; Кабелиц, Д. (2002). Методы микробиологии Том 32: Иммунология инфекций . Академическая пресса . ISBN 0-12-521532-0 .

[3] Баер, Алан; Кен-Холл, Кайлин (4 ноября 2014 г.). «Определение концентрации вируса с помощью анализа бляшек: использование традиционных и новых систем наложения» . Журнал визуализированных экспериментов (93): e52065. дои : 10.3791/52065 . ПМЦ 4255882 . ПМИД 25407402 .

[4] Мартин, SJ (1978). Биохимия вирусов . Издательство Кембриджского университета . ISBN 0-12-402033-Х .

[5] Якимович, Артур; Андриасян, Вардан; Витте, Роберт; Ван, И.-Сюань; Прасад, Вибху; Суомалайнен, Маарит; Гребер, Урс Ф. (28 сентября 2015 г.). «Plaque2.0 — высокопроизводительная система анализа для оценки передачи вируса между клетками и расширения клональных клеток» . ПЛОС ОДИН . 10 (9): e0138760. Бибкод : 2015PLoSO..1038760Y . дои : 10.1371/journal.pone.0138760 . ISSN 1932-6203 . ПМЦ 4587671 . ПМИД 26413745 .

[Flint-6] Jump up to: ^а ^б Флинт, SJ; Энквист, В.; Раканиелло, ВР; Скалка, AM (2009). «Вирусологические методы». Принципы вирусологии . АСМ Пресс. ISBN 978-1-55581-443-4 .

[7] Линденбах, Бретт Д. «Калькулятор Рида и Мюнха» .

[8] «Архивная копия» (PDF) . Архивировано из оригинала (PDF) 27 сентября 2011 г. Проверено 26 февраля 2010 г. {{cite web}}: CS1 maint: архивная копия в заголовке ( ссылка )

[9] Кербер, Г. (1931). «Вклад в коллективное лечение серийных фармакологических исследований». Архив экспериментальной патологии и фармакологии Наунина-Шмидеберга . 162 (4). Спрингер Верлаг: 480–483. дои : 10.1007/BF01863914 . S2CID 46017573 .

[10] игла (16 апреля 2002 г.). «TCID50 и единица образования бляшек (PFU)» . Проверено 29 мая 2014 г.

[11] «Руководство по вирусологической культуре» . www.atcc.org . Проверено 9 августа 2023 г.

[12] Киллиан, ML (2008). «Анализ гемагглютинации вируса птичьего гриппа». В Спэкмане, Эрика (ред.). Вирус птичьего гриппа . Том. 436. Хумана Пресс. стр. 47–52. дои : 10.1007/978-1-59745-279-3_7 . ISBN 978-1-58829-939-0 . ПМИД 18370040 .

[13] Риммельцваан, ГФ; Баарс, М.; Клаас, Европейский суд; Остерхаус, ADME (1998). «Сравнение гибридизации РНК, анализа гемааглютинации, титрования инфекционного вируса и иммунофлуоресценции как методов мониторинга репликации вируса гриппа in vitro ». Журнал вирусологических методов . 74 (1): 57–66. дои : 10.1016/S0166-0934(98)00071-8 . ПМИД 9763129 .

[14] Като, А.; Киётани, К.; Сакаи, Ю.; Ёсида, Т.; Нагай, Ю. (1997). «Парамиксовирус, вирус Сендай, белок V кодирует роскошную функцию, необходимую для вирусного патогенеза» . Журнал ЭМБО . 16 (3): 578–587. дои : 10.1093/emboj/16.3.578 . ПМЦ 1169661 . ПМИД 9034340 .

[15] «Анализ торможения гемагглютинации при гриппе» . 27 мая 2009 г.

[16] «Анализ бицинхониновой кислоты - обзор | Темы ScienceDirect» . www.sciencedirect.com . Проверено 7 августа 2023 г.

[17] Смит, ПК; Крон, Род-Айленд; Хермансон, GT; Маллиа, АК; Гартнер, Ф.Х.; Провенцано, доктор медицины; Фудзимото, ЕК; Гёк, Нью-Мексико; Олсон, Би Джей; Кленк, округ Колумбия (1 октября 1985 г.). «Измерение белка с помощью бицинхониновой кислоты» . Аналитическая биохимия . 150 (1): 76–85. дои : 10.1016/0003-2697(85)90442-7 . ISSN 0003-2697 . ПМИД 3843705 .

[18] Ведомство США по патентам и товарным знакам. «Измерение белка с помощью бицинхониновой кислоты» . Гугл Патенты . Проверено 7 августа 2023 г.

[19] «Биология белка Пирса» .

[20] Кемени, DM; Чаллакомб, SJ (1988). ИФА и другие твердофазные иммуноанализы: теоретические и практические аспекты . Джон Уайли и сыновья . ISBN 0-471-90982-3 .

[21] Куби, Дж.; Киндт, Ти Джей; Голдсби, РА; Осборн, бакалавр (2007). Куби Иммунология, 6-е издание . WH Фриман и компания. ISBN 978-1-4292-0211-4 .

[22] Родда, С.Дж.; Галличио, штат Ха; Хэмпсон, AW (1981). «Одиночный радиальный иммунодиффузионный анализ выявил небольшие антигенные различия среди гемагглютининов вируса гриппа» . Журнал клинической микробиологии . 14 (5): 479–482. doi : 10.1128/JCM.14.5.479-482.1981 . ПМК 273972 . ПМИД 6171580 .

[23] «Протоколы ПЦР/ПЦР в реальном времени» .

[24] «Прикладные биосистемы - США» (PDF) .

[25] О'Лири, Джей-Джей; Шейлс, О.; Мартин, К.; Кроули, А. (2003). «Технология Такмана и полимеразная цепная реакция в реальном времени». В Крокере, Дж.; Мюррей, П.Г. (ред.). Молекулярная биология в клеточной патологии . Джон Уайли и сыновья . стр. 251–268. ISBN 978-0-470-84475-5 .

[26] Каллахан Дж. Д. и др., Использование портативного анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой в реальном времени для быстрого обнаружения вируса ящура. J Am Vet Med Assoc. 1 июня 2002 г.; 220 (11): 1636-42.

[27] Стивен Дж. Сауэрби, Мюррей Ф. Брум, Джордж Б. Петерсен. «Апертуры нанометрового размера с динамическим изменением размера для молекулярного зондирования» Датчики и приводы B: Chemical Volume 123, выпуск 1 (2007), страницы 325–330

[28] Г. Сет Робертс, Сэм Ю, Цинлу Цзэн, Лесли К.Л. Чан, Уилл Андерсон, Аарон Х. Колби, Марк В. Гринстафф, Стивен Рид, Роберт Фогель. «Настраиваемые поры для измерения концентраций дисперсий синтетических и биологических наночастиц» Биосенсоры и биоэлектроника, 31 стр. 17-25 (2012).

[29] К. Дегельдре, П.-Ю. Фаваргер, Анализ коллоидов методом масс-спектроскопии с индуктивно связанной плазмой одночастичной: технико-экономическое обоснование, Коллоиды и поверхности A, 217 (2003) 137-142.

[30] C Дегельдре, П.-Ю Фаваргер, С. Уолд, Анализ коллоида золота с помощью одночастичной масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой в одночастичном режиме, Anal Chim Acta, 555 (2006) 263-268.

[31] К. Дегельдре, Анализ масс-спектроскопии индуктивно связанной плазмы одного вируса: всестороннее исследование. Таланта, том 228 февраля (2021 г.), 122211.

[32] Стоффель, КЛ; Финч, Р.; Кристенсен, К.; Эдвардс, Д.; Роулен, КЛ (2005). «Быстрое определение титра бакуловируса с помощью двухканального счетчика вирусов». Американская биотехнологическая лаборатория . 37 (22): 24–25.

[33] Шерман И. «Разрешающая способность электронного микроскопа» . Справочник по физике . Проверено 25 февраля 2010 г.

[34] Стеффенс, WL (1998). «Использование трансмиссионной электронной микроскопии для диагностики вирусов у попугаев» . Материалы международных виртуальных конференций по ветеринарной медицине: болезни попугаев . Афины, Джорджия.

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

[ 16 ]

[ 17 ]

[ 18 ]

[ 19 ]

[ 20 ]

[ 21 ]

[ 22 ]

[ 23 ]

[ 24 ]

[ 25 ]

[ 26 ]

[ 27 ]

[ 28 ]

[ 29 ]

[ 30 ]

[ 31 ]

[ 32 ]

[ 33 ]

[ 34 ]