Подсчет клеток

Подсчет клеток – это любой из различных методов подсчета или аналогичной количественной оценки в клеток науках о жизни , включая медицинскую диагностику и лечение . Это важный раздел цитометрии , имеющий применение в исследованиях и клинической практике. Например, общий анализ крови может помочь врачу определить, почему пациент чувствует себя плохо и что нужно сделать, чтобы помочь. Количество клеток в жидких средах (таких как кровь , плазма , лимфа или лабораторный смыв ) обычно выражается в количестве клеток на единицу объема , таким образом выражая концентрацию (например, 5000 клеток на миллилитр).

Использование

Многочисленные процедуры в биологии и медицине требуют подсчета клеток. путем подсчета клеток в известном небольшом объеме Концентрацию можно определить . Примеры необходимости подсчета клеток включают в себя:

В медицине концентрация различных клеток крови , таких как эритроциты и лейкоциты , может дать важную информацию о состоянии здоровья человека (см.: общий анализ крови ).
В клеточной терапии для контроля дозы клеток, вводимых пациенту.
Точно так же концентрация бактерий , вирусов и других патогенов в крови или других жидкостях организма может дать информацию о ходе инфекционного заболевания и о степени успеха, с которым иммунная система справляется с инфекцией .
в области молекулярной биологии необходимо знать концентрацию клеток Для многих экспериментов , чтобы соответствующим образом скорректировать количество реагентов и химикатов, которые будут применяться в эксперименте.
Исследования, изучающие скорость роста микроорганизмов , (другими словами, насколько быстро они делятся образуя новые клетки), требуют подсчета клеток.
Расчет соотношения мертвых и живых клеток как меры жизнеспособности клеток, например клеток, подвергшихся воздействию яда.

Ручной подсчет клеток

Существует несколько методов подсчета клеток. Некоторые из них примитивны и не требуют специального оборудования, поэтому их можно провести в любой биологической лаборатории , тогда как другие полагаются на сложные электронные приборы.

Счетная камера

Счетная камера — предметное стекло микроскопа , специально разработанное для подсчета клеток. Гемоцитометры и счетные камеры Sedgewick Rafter представляют собой два типа счетных камер. Гемоцитометр имеет посередине две сетчатые камеры, которые при подсчете закрываются специальным предметным стеклом. Каплю клеточной культуры помещают в пространство между камерой и стеклянной крышкой, заполняя его за счет капиллярного действия . ^{[ 1 ]} Глядя на образец под микроскопом , исследователь с помощью сетки вручную подсчитывает количество клеток в определенной области известного размера. Расстояние между камерой и крышкой заранее задано, поэтому можно рассчитать объем подсчитанной культуры, а вместе с ней и концентрацию клеток. Жизнеспособность клеток также можно определить, если в жидкость добавить красители жизнеспособности.

Их преимущество в том, что они дешевы и быстры; это делает их предпочтительным методом подсчета в быстрых биологических экспериментах, где необходимо только определить, выросла ли культура клеток ожидаемым образом. Обычно исследуемую культуру необходимо развести, иначе высокая плотность клеток сделает подсчет невозможным. Необходимость разведения является недостатком, поскольку каждое разбавление увеличивает неточность измерения. ^{[ 2 ]}

Посев и подсчет КОЕ

Фотография *колоний Staphylococcus aureus,* растущих на чашке с агаром (сфотографировано в проходящем свете ). Такие равномерно распределенные колонии подходят для подсчета КОЕ.

Чтобы количественно определить количество клеток в культуре, клетки можно просто высеять на чашку Петри с питательной средой . Если клетки эффективно распределены на чашке, обычно можно предположить, что каждая клетка даст начало одной колонии или колониеобразующей единице (КОЕ) . Затем можно подсчитать колонии и на основании известного объема культуры, нанесенной на чашку, рассчитать концентрацию клеток. Это часто выполняется в соответствии со стандартом ASTM D5465. ^{[ 3 ]}

Как и в случае со счетными камерами, перед посевом культуры обычно необходимо сильно разбавлять; в противном случае вместо получения единичных колоний, которые можно подсчитать, образуется так называемый «лужайка»: тысячи колоний, лежащих друг над другом. Кроме того, посевы — самый медленный метод из всех: большинству микроорганизмов требуется не менее 12 часов, чтобы сформировать видимые колонии.

Хотя этот метод может занять много времени, он дает точную оценку количества жизнеспособных клеток (поскольку только они смогут расти и образовывать видимые колонии). Поэтому он широко используется в экспериментах, направленных на количественную оценку количества клеток, устойчивых к лекарствам или другим внешним условиям (например, эксперимент Лурии-Дельбрюка или анализ защиты от гентамицина ). Кроме того, подсчет колоний на чашках с агаром можно значительно облегчить, используя счетчики колоний .

Автоматический подсчет клеток

Электрическое сопротивление

Счетчик Коултера — это прибор, который может подсчитывать клетки, а также измерять их объем. Он основан на том факте, что клетки обладают большим электрическим сопротивлением ; другими словами, они почти не проводят электричество . В счетчике Коултера клетки, плавающие в проводящем электричество растворе, засасываются одна за другой в крошечную щель. По бокам зазора расположены два электрода , проводящие электричество. Когда ни одна ячейка не находится в зазоре, электричество течет не ослабевает, но когда ячейка всасывается в зазор, току оказывается сопротивление. Счетчик Коултера подсчитывает количество таких событий, а также измеряет ток (и, следовательно, сопротивление), который напрямую коррелирует с объемом захваченной клетки. Аналогичной системой является технология подсчета клеток CASY .

Счетчики Coulter и CASY намного дешевле, чем проточные цитометры, и для приложений, требующих количества и размера клеток, таких как исследование клеточного цикла , они являются предпочтительным методом. Его преимуществом перед вышеописанными методами является большое количество ячеек, которые можно обработать за короткое время, а именно: тысячи ячеек в секунду. Это обеспечивает большую точность и статистическую значимость .

Проточная цитометрия

Проточная цитометрия — безусловно, самый сложный и дорогой метод подсчета клеток. В проточном цитометре клетки текут узким потоком перед лазерным лучом. Луч попадает на них один за другим, а светоприемник улавливает свет, отраженный от клеток.

Проточные цитометры обладают множеством других возможностей, таких как анализ формы клеток, их внутренней и внешней структуры, а также измерение количества специфических белков и других биохимических веществ в клетках. Поэтому проточные цитометры редко приобретаются исключительно с целью подсчета клеток. ^{[ нужна ссылка ]}

Анализ изображений

Недавние подходы рассматривают использование высококачественных микроскопических изображений, на которых статистической классификации используется алгоритм для автоматического обнаружения и подсчета клеток, в качестве задачи анализа изображений . ^{[ 4 ]} Обычно выполняется с постоянной частотой ошибок как процесс автономного (пакетного) типа. ряд методов классификации изображений . Для этой цели можно использовать ^{[ 5 ]}

Стереологический подсчет клеток

В настоящее время стереологический подсчет клеток с ручным решением о включении объекта в соответствии с правилами объективного стереологического подсчета остается единственным адекватным методом объективного количественного определения клеток в гистологических срезах тканей, поэтому он недостаточно адекватен для полной автоматизации. ^{[ 6 ]}

Косвенный подсчет клеток

Спектрофотометрия

Клеточные суспензии мутные . Клетки поглощают и рассеивают свет. Чем выше концентрация клеток, тем выше мутность. Спектрофотометры могут очень точно измерять интенсивность света. Культуру клеток помещают в прозрачную кювету и измеряют поглощение только по отношению к среде. Оптическая плотность (ОП) прямо пропорциональна биомассе клеточной суспензии в заданном диапазоне, специфичном для типа клеток. Использование спектрофотометрии для измерения мутности культур известно как турбидометрия .

Это сделало спектрофотометрию предпочтительным методом измерения роста бактерий и связанных с этим приложений. Недостатком спектрофотометрии является ее неспособность обеспечить абсолютное подсчет или различие между живыми и мертвыми клетками.

Импедансная микробиология

Импедансная микробиология — это быстрый микробиологический метод, используемый для измерения концентрации микробов (в основном бактерий, но также и дрожжей ) в образце путем мониторинга электрических параметров питательной среды. Он основан на том, что метаболизм бактерий превращает незаряженные (или слабозаряженные) соединения в высокозаряженные соединения, изменяя тем самым электрические свойства питательной среды . Концентрацию микроорганизмов оценивают по времени, необходимому для отклонения контролируемых электрических параметров от исходного исходного значения.

Доступны различные инструменты (либо изготовленные в лаборатории, либо коммерчески доступные) для измерения концентрации бактерий с использованием импедансной микробиологии. ^{[ 7 ]}^{[ 8 ]}^{[ 9 ]}^{[ 10 ]}^{[ 11 ]}

Ссылки

^ «Протокол гемоцитометра» . 04 апреля 2013 г.
^ «Основы использования гемоцитометра» .
^ Ханаор, Дориан А.Х.; Микелацци, Марко; Чену, Джереми В.; Леонелли, Кристина; Соррелл, Чарльз (март 2013 г.). «Влияние условий обжига на свойства электрофоретически осажденных пленок диоксида титана на графитовых подложках» . Журнал Европейского керамического общества . 31 (15): 2877–2885. arXiv : 1303.2757 . doi : 10.1016/j.jeurceramsoc.2011.07.007 . S2CID 93406448 .
^ Хан, JW; Брекон, ТП; Рэнделл, округ Колумбия; Ландини, Г. (2012). «Применение машинной классификации опорных векторов для обнаружения ядер клеток для автоматизированной микроскопии» (PDF) . Машинное зрение и его приложения . 23 (1): 15–24. дои : 10.1007/s00138-010-0275-y . S2CID 12446454 . Проверено 8 апреля 2013 г.
^ Хан, JW; Брекон, ТП; Рэнделл, округ Колумбия; Ландини, Г. (июль 2008 г.). «Классификация радикулярных кист и одонтогенных кератоцист эпителия с использованием каскадных классификаторов Хаара» (PDF) . Учеб. 12-я ежегодная конференция по пониманию и анализу медицинских изображений . стр. 54–58 . Проверено 8 апреля 2013 г.
^ Шмитц; и др. (7 мая 2014 г.). «Современные методы автоматического трехмерного обнаружения клеток не являются подходящей заменой ручному стереологическому подсчету клеток» . Границы нейроанатомии . 8:27 . дои : 10.3389/fnana.2014.00027 . ПМК 4019880 . ПМИД 24847213 .
^ Приего, Р.; Медина, LM; Джордано, Р. (2011). «Система бактометра в сравнении с традиционными методами мониторинга популяций бактерий в сальчичоне во время процесса его созревания» . Журнал защиты пищевых продуктов . 74 (1): 145–148. дои : 10.4315/0362-028X.JFP-10-244 . ПМИД 21219778 .
^ «Инструмент РАБИТ» .
^ «Инструмент Bac Trac» .
^ Гросси, М.; Ланцони, М.; Помпеи, А.; Лаццарини, Р.; Маттеуцци, Д.; Рикко, Б. (2010). «Встроенная портативная биосенсорная система для определения концентрации бактерий» . Биосенсоры и биоэлектроника (Представлена рукопись). 26 (3): 983–990. дои : 10.1016/j.bios.2010.08.039 . ПМИД 20833014 . S2CID 21062717 .
^ Гросси, М.; Лаццарини, Р.; Ланцони, М.; Помпеи, А.; Маттеуцци, Д.; Рикко, Б. (2013). «Портативный датчик с одноразовыми электродами для оценки бактериального качества воды» (PDF) . Журнал датчиков IEEE . 13 (5): 1775–1781. Бибкод : 2013ISenJ..13.1775G . дои : 10.1109/JSEN.2013.2243142 . S2CID 24631451 .

[1] «Протокол гемоцитометра» . 04 апреля 2013 г.

[2] «Основы использования гемоцитометра» .

[3] Ханаор, Дориан А.Х.; Микелацци, Марко; Чену, Джереми В.; Леонелли, Кристина; Соррелл, Чарльз (март 2013 г.). «Влияние условий обжига на свойства электрофоретически осажденных пленок диоксида титана на графитовых подложках» . Журнал Европейского керамического общества . 31 (15): 2877–2885. arXiv : 1303.2757 . doi : 10.1016/j.jeurceramsoc.2011.07.007 . S2CID 93406448 .

[han12cell-4] Хан, JW; Брекон, ТП; Рэнделл, округ Колумбия; Ландини, Г. (2012). «Применение машинной классификации опорных векторов для обнаружения ядер клеток для автоматизированной микроскопии» (PDF) . Машинное зрение и его приложения . 23 (1): 15–24. дои : 10.1007/s00138-010-0275-y . S2CID 12446454 . Проверено 8 апреля 2013 г.

[han08cell-5] Хан, JW; Брекон, ТП; Рэнделл, округ Колумбия; Ландини, Г. (июль 2008 г.). «Классификация радикулярных кист и одонтогенных кератоцист эпителия с использованием каскадных классификаторов Хаара» (PDF) . Учеб. 12-я ежегодная конференция по пониманию и анализу медицинских изображений . стр. 54–58 . Проверено 8 апреля 2013 г.

[6] Шмитц; и др. (7 мая 2014 г.). «Современные методы автоматического трехмерного обнаружения клеток не являются подходящей заменой ручному стереологическому подсчету клеток» . Границы нейроанатомии . 8:27 . дои : 10.3389/fnana.2014.00027 . ПМК 4019880 . ПМИД 24847213 .

[7] Приего, Р.; Медина, LM; Джордано, Р. (2011). «Система бактометра в сравнении с традиционными методами мониторинга популяций бактерий в сальчичоне во время процесса его созревания» . Журнал защиты пищевых продуктов . 74 (1): 145–148. дои : 10.4315/0362-028X.JFP-10-244 . ПМИД 21219778 .

[8] «Инструмент РАБИТ» .

[9] «Инструмент Bac Trac» .

[10] Гросси, М.; Ланцони, М.; Помпеи, А.; Лаццарини, Р.; Маттеуцци, Д.; Рикко, Б. (2010). «Встроенная портативная биосенсорная система для определения концентрации бактерий» . Биосенсоры и биоэлектроника (Представлена рукопись). 26 (3): 983–990. дои : 10.1016/j.bios.2010.08.039 . ПМИД 20833014 . S2CID 21062717 .

[11] Гросси, М.; Лаццарини, Р.; Ланцони, М.; Помпеи, А.; Маттеуцци, Д.; Рикко, Б. (2013). «Портативный датчик с одноразовыми электродами для оценки бактериального качества воды» (PDF) . Журнал датчиков IEEE . 13 (5): 1775–1781. Бибкод : 2013ISenJ..13.1775G . дои : 10.1109/JSEN.2013.2243142 . S2CID 24631451 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]