Анализ защиты гентамицина

Анализ о защите гентамицина или анализ выживания или анализ вторжения - это метод, используемый в микробиологии . Он используется для количественной оценки способности патогенных бактерий вторгаться в эукариотические клетки .

о способности интернализованных бактерий избегать убийства антибиотиками . Анализ основан на нескольких наблюдениях, сделанных в 1970 -х годах, в которых сообщалось ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]} Анализ начал использоваться в биологических исследованиях в начале 1980 -х годов.

Фон и принцип

Внутриклеточные бактерии должны вводить клетки -хозяева ( клетки организма инфицированного ) , чтобы воспроизвести и распространять инфекцию. Многие виды шигеллы (вызывает бацилл -дизентерию ), сальмонеллы ( брюшная лихорадка ), микобактерии ( проказа и туберкулез ) и листериа ( листериоз ), и это лишь некоторые из них, являются внутриклеточными.

Несколько антибиотиков не могут проникнуть в эукариотические клетки. Следовательно, эти антибиотики не могут повредить внутриклеточные бактерии, которые уже усваиваются. Использование таких антибиотиков позволяет нам различать бактерии, которые преуспевают в проникновении эукариотических клеток, и теми, которые этого не делают. Применение такого антибиотика к культуре эукариотических клеток, инфицированных бактериями, убило бы бактерии, которые остаются вне клеток, оставляя те, которые проникали. Антибиотиком выбора для этого анализа является аминогликозидный гентамицин .

Процедура

Клетки HeLa обычно используются в качестве эукариотических клеток в анализе защиты гентамицина, но также можно использовать другие клетки. Что касается бактерий, то можно проанализировать только виды, подверженные гентамицину.

Анализ проводится в пластиковых микротитровах , которые обычно используются в лабораториях для культивирования эукариотических клеток. Клетки могут расти в лунках в течение ночи, создавая плоский слой. Бактерии отдельно выращиваются в течение ночи. На следующий день эукариотические клетки инокулированы бактериями и инкубируются вместе в течение часа. Центрифугирование пластин в течение нескольких минут может помочь встроить клетки и бактерии в контакт и инициировать инфекцию.

После инфекции гентамицин добавляется в пластины, и они инкубируют в течение часа, что позволяет антибиотику убивать все бактерии, которые не могли проникнуть в клетки, и оставались на улице. Затем тарелки хорошо промывают, чтобы удалить мертвые бактерии. Далее эукариотические клетки лизируются с использованием моющего средства , чаще всего Triton X-100 .

Бактерии, которые проникли в клетки и оставались живыми, теперь высвобождаются, и они выложены на твердые средние пластины . Подсчет колоний, сформированных на пластинах на следующий день, и знание того, сколько бактерий использовалось в начале анализа, позволяет исследователю рассчитать процент бактерий, которые могли вторгаться в эукариотические клетки.

Использование, преимущества и предостережения

Анализ защиты гентамицина обычно используется в исследованиях патогенов. Вклад специфических генов или белков в способность бактерий вторгаться в клетки, можно легко проанализировать с помощью этого метода. Рассматриваемый ген может быть выбит , а инвазивность бактерий по сравнению с нормированными бактериями дикого типа . Условия окружающей среды, такие как уровень рН и температура , также могут быть проанализированы на их влияние на инвазивность.

Анализ защиты гентамицина очень чувствителен, так как он может обнаружить интернализацию даже отдельных бактерий. У него есть несколько недостатков:

Гентамицин иногда может проникать в эукариотические клетки и убивать интернализованные бактерии. Это может произойти, если проницаемость клеток каким -то образом увеличилась во время анализа, иногда из -за плохой обработки клеток.
Иногда интернализованные бактерии могут не быть полностью защищены от внешней среды, например, когда фагосома ( вакуоль , окружающая бактерию внутри клетки) в некотором роде дефективна. Гентамицин может убить эти бактерии.
Гентамицин может не убить все бактерии, которые остались вне клеток.

Чтобы оценить точность конкретного анализа, положительный и отрицательный контроль следует выполнять . При выполнении анализа, как описано выше, бактерии, которые, как известно, являются полностью инвазивными (положительный контроль), и бактерии, которые известны как неинвазивные (негативные контрольные), должны быть включены в анализ.

Альтернативный анализ инвазии - это дифференциальный анализ иммуноокрашивания , основанный на связывании антител с бактериями до и после инвазии. Антитела испускают флуоресцентный , цветной свет , и результаты этого анализа рассматриваются под микроскопом .

Смотрите также

Овергает внутриклеточный паразит

Ссылки

^ Манделл Г.Л. (1973). «Взаимодействие внутриалекоцитарных бактерий и антибиотиков» . J Clin Invest . 52 (7): 1673–1679. doi : 10.1172/jci107348 . PMC 302442 . PMID 4718959 .
^ Vaudaux P и Waldvogel FA (1979). «Антибактериальная активность гентамицина в присутствии человеческих полиморфноядерных лейкоцитов» . Антимикробные агенты химита . 16 (6): 743–749. doi : 10.1128/aac.16.6.743 . PMC 352946 . PMID 533256 .

[1] Манделл Г.Л. (1973). «Взаимодействие внутриалекоцитарных бактерий и антибиотиков» . J Clin Invest . 52 (7): 1673–1679. doi : 10.1172/jci107348 . PMC 302442 . PMID 4718959 .

[2] Vaudaux P и Waldvogel FA (1979). «Антибактериальная активность гентамицина в присутствии человеческих полиморфноядерных лейкоцитов» . Антимикробные агенты химита . 16 (6): 743–749. doi : 10.1128/aac.16.6.743 . PMC 352946 . PMID 533256 .

[ 1 ]

[ 2 ]