ВЫПРАВЛЯТЬСЯ
Рекомендации по минимальной информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени ( MIQE ) представляют собой набор протоколов для проведения и отчетности по количественным экспериментам ПЦР в реальном времени и данных, разработанных Бастином и др. в 2009 году. [ 1 ] Они были разработаны после того, как в 2002 году была опубликована статья, в которой утверждалось, что вирус кори можно обнаружить у детей с аутизмом с помощью RT-qPCR, но результаты оказались совершенно невоспроизводимыми другими учеными. [ 2 ] Сами авторы также не пытались их воспроизвести, а исходные данные содержали большое количество ошибок и принципиальных ошибок при анализе. Этот инцидент побудил Стивена Бастина создать рекомендации MIQE, чтобы обеспечить базовый уровень качества данных qPCR, публикуемых в научной литературе. [ 2 ]
Цель
[ редактировать ]Рекомендации MIQE были созданы из-за низкого качества данных qPCR, представленных в то время в академических журналах, что становилось все более распространенным, поскольку оборудование для секвенирования следующего поколения позволяло проводить такие эксперименты по более низкой цене. Поскольку этот метод используется во всей науке в различных областях, инструменты, методы и схемы использования qPCR сильно различаются. Чтобы улучшить общее качество, рекомендации MIQE были составлены в виде обобщенных предложений по основным экспериментальным процедурам и формам данных, которые следует собирать в виде минимального уровня сообщаемой информации, чтобы другие исследователи могли понять и использовать их при чтении опубликованных материалов. Создание признанного и в значительной степени согласованного набора руководящих принципов, подобных этим, было сочтено важным научным сообществом, особенно из-за постоянно растущего объема научной работы, поступающей из развивающихся стран с множеством разных языков и протоколов. [ 3 ]
История
[ редактировать ]Разработка оригинальной версии
[ редактировать ]В 2009 году Стивен Бастин возглавил международную группу ученых, в том числе Микаэля Кубисту , чтобы составить набор рекомендаций о том, как выполнять qPCR и какие формы данных следует собирать и публиковать в этом процессе. [ 1 ] Это также позволило редакторам и рецензентам научных журналов использовать эти рекомендации при просмотре представленной статьи, содержащей данные qPCR. Таким образом, руководящие принципы были составлены как своего рода контрольный список для каждого этапа процедуры, при этом определенные пункты были помечены как важные (E) при подаче данных для публикации, а другие помечены как просто желательные (D). [ 4 ]
Дополнительная версия рекомендаций была опубликована в сентябре 2010 года для использования с количественной ПЦР в реальном времени на основе флуоресценции. Оно также послужило кратким описанием более широкой формы руководящих принципов. [ 5 ] Другие исследователи создают дополнительные версии для конкретных форм qPCR, для проверки которых может потребоваться дополнительный или другой набор элементов, включая qPCR для отдельных клеток. [ 6 ] и цифровая ПЦР (дПЦР). [ 7 ] Надлежащее соблюдение существующих рекомендаций MIQE также рассматривалось в других научных областях, включая фотобиомодуляцию. [ 8 ] и клинические биомаркеры . [ 9 ]
В 2014 году (и снова в 2017 году) Бастин отметил, что рекомендации MIQE в некоторой степени были приняты и использованы в научном сообществе, но все еще было слишком много опубликованных статей с экспериментами по qPCR, в которых не хватало даже самых основы представления данных и надлежащее подтверждение эффективности указанных данных. В этих исследованиях сохранялись серьезные проблемы с воспроизводимостью, поскольку выводы их доказательств не могли быть воспроизведены другими исследователями, что ставило под сомнение первоначальные результаты. И все это несмотря на то, что многие статьи прямо цитировали оригинальную публикацию Бастина MIQE, но не следовали контрольному списку материалов в своих собственных экспериментах. [ 2 ] [ 10 ] Тем не менее, некоторые исследователи отмечают, по крайней мере, некоторый успех: ряд статей были отклонены академическими журналами для публикации из-за того, что они не прошли контрольные списки MIQE. Другие исследования были отозваны после того, как было отмечено и публично указано редакторам журналов на отсутствие в них надлежащих данных для соответствия рекомендациям MIQE. [ 11 ]
Ужесточение руководящих принципов
[ редактировать ]Создавая в 2017 году свою новую сравнительную систему qPCR под названием «Точки в коробках», компания New England Biolabs заявила, что они разработали часть сбора данных в соответствии с рекомендациями MIQE, чтобы данные соответствовали всем контрольным спискам минимальных параметров в протоколах. [ 12 ] Другие компании, производящие научные приборы, помогли обеспечить соответствие рекомендациям, целенаправленно адаптируя для них свои устройства, в том числе Bio-Rad, создавшая мобильное приложение , которое позволяет активно отмечать контрольный список MIQE по мере выполнения каждого шага. [ 13 ]
Обзор 10-летия со дня публикации рекомендаций MIQE был проведен в июне 2020 года и обсуждал научные исследования, которые дали лучшие и более организованные результаты при следовании рекомендациям. [ 14 ] В августе 2020 года была опубликована обновленная версия рекомендаций по методу цифровой ПЦР с учетом усовершенствований оборудования, технологий и методов с момента первоначальной версии 2013 года. Были добавлены дополнительные рекомендации для анализа данных, а также предоставлена более упрощенная контрольная таблица для использования исследователями. [ 15 ] RT-qPCR В декабре 2020 года совместно со Стивеном Бастином был разработан целевой анализ с использованием рекомендаций MIQE для клинических биомаркеров с целью выявления клинического присутствия COVID-19 вирусных частиц во время пандемии COVID-19 . [ 16 ]
Обзор руководящих принципов
[ редактировать ]Рекомендации MIQE разделены на 9 различных разделов, составляющих контрольный список. Сюда входят не только соображения по проведению самой qPCR, но и то, как собираются, анализируются и представляются полученные данные. Важной частью последнего является включение информации, касающейся используемого программного обеспечения для анализа, а также передача необработанных данных в соответствующие базы данных. [ 1 ]
Экспериментальный дизайн
[ редактировать ]Большая часть руководств включает в себя основные действия, которые обычно включаются в эксперименты и публикации, например, пункт для описания различий в экспериментальной и контрольной группах. Другая подобная информация включает в себя количество отдельных единиц, использованных в каждой группе в эксперименте. Эти две части считаются необходимыми для любого исследования. Этот раздел также включает два желательных пункта, в которых указывается, проводила ли анализ qPCR сама лаборатория автора или основная лаборатория университета или организации, а также признание любых других лиц, внесших вклад в работу. [ 1 ]
Образец
[ редактировать ]Основные требования, которым должны соответствовать образцы и материал образцов, включают описание образца, какая форма вскрытия использовалась, какой метод обработки применялся, были ли образцы заморожены или зафиксированы, сколько времени это заняло и какие условия отбора проб использовались. . Также желательно знать объем или массу образца, обработанного для количественной ПЦР. [ 1 ]
Экстракция нуклеиновой кислоты
[ редактировать ]Для процесса выделения ДНК/РНК существует ряд важных правил. Сюда входит описание проведенного процесса экстракции, заявление о том, какой набор для экстракции ДНК использовался и любые изменения, внесенные в инструкции, подробная информация о том, использовалась ли какая-либо обработка ДНКазой или РНКазой , заявление о том, была ли оценена какая-либо контаминация, количественная оценка количество извлеченного генетического материала, описание инструментов, использованных для экстракции, методы, используемые для сохранения целостности РНК, сведения о количестве целостности РНК и индикаторе качества, а также о достигнутом цикле количественного определения (Cq) и, наконец, какое тестирование было проведено. определить наличие или отсутствие ингибиторов . Четыре желаемых фрагмента информации: откуда были получены используемые реагенты, какой уровень генетической чистоты был получен, какой выход был получен, а также изображение геля электрофореза для подтверждения. [ 1 ]
Обратная транскрипция
[ редактировать ]Основные важные части этого этапа включают полное описание условий реакции с указанием как количества используемой РНК, так и общего объема реакции, предоставление информации об олигонуклеотиде, используемом в качестве праймера, и его концентрации, концентрации и типе обратной транскриптазы. используемая температура и, наконец, температура и количество времени, затраченное на реакцию. Также желательно иметь каталожные номера использованных реагентов и их производителей, стандартное отклонение Cq с участием транскриптазы и без нее, а также способы кДНК . хранения [ 1 ]
целевая информация qPCR
[ редактировать ]Здесь необходима вся основная информация о мишени, включая символ гена, номер базы данных доступа для рассматриваемой последовательности, длину амплифицированной последовательности, информацию об используемом скрининге специфичности, таком как BLAST , какие варианты сплайсинга существуют для последовательность и местонахождение экзона или интрона для каждого праймера. Для этого раздела есть несколько желательных, но не обязательных фрагментов информации, таких как расположение ампликона , существуют ли какие-либо псевдогены или гомологи , было ли выполнено выравнивание последовательностей и полученные из него данные, а также любые данные о вторичной структуре амплифицированная последовательность. [ 1 ]
олигонуклеотиды кПЦР
[ редактировать ]Для создания олигонуклеотидов требуется всего две части важной информации: используемые последовательности праймеров, а также расположение и подробности любых модификаций, внесенных в последовательность. Но есть несколько желательных данных, в том числе идентификационный номер из базы данных RTPrimerDB, последовательности зондов , производитель, использованный для изготовления олигонуклеотидов, и способы их очистки. [ 1 ]
протокол qPCR
[ редактировать ]Контрольный список для самого процесса количественной ПЦР является одним из основных разделов руководства и содержит несколько важных частей. Сюда входит полный набор условий, использованных для реакции, объем как реакции, так и кДНК, концентрации зондов, ионов магния и dNTP , тип полимеразы и ее концентрация, какой набор использовался и его производитель, какие добавки в реакции использовались, кто изготовил аппарат для ПЦР и какие параметры были установлены для процесса термоциклирования . Единственная дополнительная необходимая информация — это химический состав используемого буфера, производитель использованных планшетов и пробирок, их каталожный номер, а также была ли реакция организована вручную или с помощью машины. [ 1 ] [ 17 ]
проверка qPCR
[ редактировать ]Чтобы подтвердить эффективность и качество проведенного процесса количественной ПЦР, необходимо предоставить несколько действий и последующие данные. Сюда входит объяснение конкретного метода проверки функционирования процесса, например, использование геля, прямое секвенирование генетического материала, демонстрация профиля плавления или расщепление ферментом рестрикции . Если использовался SYBR Green I , то необходимо указать Cq контрольной группы без матричной ДНК. Дополнительные важные данные включают калибровку машинных кривых с учетом наклона и точки пересечения оси y, эффективность процесса ПЦР, определенную по вышеупомянутому наклону, коэффициенты корреляции (r в квадрате) для калибровочных кривых, динамический диапазон линейных кривых. , Cq обнаружен при самой низкой концентрации, при которой 95% результатов все еще были положительными ( LOD ) вместе с доказательствами самого LOD, и, наконец, если мультиплекс , то эффективность и LOD должны быть указаны для каждого выполненного анализа. используется [ 1 ] [ 17 ]
Дополнительная желаемая информация включает доказательства того, что оптимизация qPCR произошла за счет использования градиентов, доверительных интервалов , показывающих эффективность qPCR, и доверительных интервалов для всего протестированного диапазона. [ 1 ]
Анализ данных
[ редактировать ]Последний раздел рекомендаций содержит информацию о том, как проводился анализ данных qPCR. Важнейшие части этого включают в себя программу и версию программы, использованные для анализа, метод определения Cq, выяснение точек выбросов в данных, а также то, как они используются или исключаются, а также почему, какие результаты были получены для элементов управления. без шаблонного генетического материала, объяснение того, почему были выбраны используемые эталонные гены и почему было выбрано их количество, метод, использованный для нормализации данных, сколько технических повторов было включено, насколько воспроизводимыми были данные в анализах, что методы использовались для определения значимости результатов и какое программное обеспечение использовалось для этой части качественного анализа. [ 1 ]
Также желательно включить информацию о количестве биологических повторов и о том, соответствуют ли они результатам технических повторов, данные воспроизводимости для вариантов концентрации, данные анализа мощности и, наконец, чтобы исследователи представили необработанные данные в RDML — формат файла. [ 1 ] [ 18 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж к л м н Бастин С.А., Бенес В., Гарсон Дж.А., Хеллеманс Дж., Хаггетт Дж., Кубиста М., Мюллер Р., Нолан Т., Пфаффл М.В., Шипли Г.Л., Вандесомпель Дж., Виттвер К.Т. (апрель 2009 г.). «Руководство MIQE: минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени» . Клиническая химия . 55 (4): 611–622. дои : 10.1373/clinchem.2008.112797 . ПМИД 19246619 .
- ^ Jump up to: а б с Бустин С.А. (декабрь 2014 г.). «Воспроизводимость биомедицинских исследований: спящие проснулись!» . Биомолекулярное обнаружение и количественный анализ . 2 : 35–42. дои : 10.1016/j.bdq.2015.01.002 . ПМК 5121206 . ПМИД 27896142 .
- ^ Абдель Нур А.М., Азхар Э., Даманхури Г., Бустин С.А. (февраль 2014 г.). «Пять лет рекомендаций MIQE: пример арабских стран» . ПЛОС Один . 9 (2): e88266. Бибкод : 2014PLoSO...988266A . дои : 10.1371/journal.pone.0088266 . ПМЦ 3913779 . ПМИД 24505456 .
- ^ Фаррелл, Роберт Э. (август 2017 г.). «Руководство MIQE». Методологии РНК: Лабораторное руководство по выделению и характеристике . Академическая пресса . стр. 287–288. ISBN 978-0128046791 .
- ^ Бастин С.А., Болье Дж.Ф., Хаггетт Дж., Джагги Р., Кибенге Ф.С., Олсвик П.А., Пеннинг Л.К., Тогель С. (сентябрь 2010 г.). «Краткое описание MIQE: Практическая реализация минимальных стандартных рекомендаций для количественных экспериментов с помощью флуоресцентной ПЦР в реальном времени» . BMC Молекулярная биология . 11:74 . дои : 10.1186/1471-2199-11-74 . ПМК 2955025 . ПМИД 20858237 .
- ^ Штальберг А., Кубиста М. (февраль 2018 г.). «Технические аспекты и рекомендации для одноклеточной кПЦР». Молекулярные аспекты медицины . 59 : 28–35. дои : 10.1016/j.mam.2017.07.004 . ПМИД 28756182 .
- ^ Хаггетт Дж.Ф., Фой К.А., Бенес В., Эмсли К., Гарсон Дж.А., Хейнс Р., Хеллеманс Дж., Кубиста М., Мюллер Р.Д., Нолан Т., Пфаффл М.В., Шипли Г.Л., Вандесомпель Дж., Виттвер К.Т., Бастин С.А. (июнь 2013 г.). «Руководство по цифровому MIQE: минимум информации для публикации количественных экспериментов по цифровой ПЦР» . Клиническая химия . 59 (6): 892–902. дои : 10.1373/clinchem.2013.206375 . ПМИД 23570709 .
- ^ Хурелд Н.Н. (февраль 2017 г.). «Соблюдаются ли рекомендации MIQE при проведении qPCR-исследований в экспериментах по фотобиомодуляции?». Фотомедицина и лазерная хирургия . 35 (2): 69–70. дои : 10.1089/pho.2016.4220 . ПМИД 28056213 .
- ^ Ридмайер И., Спорнрафт М., Кирхнер Б., Пфаффль М.В. (январь 2016 г.). «Соответствие MIQE при определении профиля экспрессии и открытии клинических биомаркеров» . Европейский фармацевтический обзор . 20 (6): 32–36 . Проверено 13 июня 2019 г.
- ^ Бастин С.А., Нолан Т. (август 2017 г.). «Говорить, но не ходить: RT-qPCR как парадигма отсутствия воспроизводимости в молекулярных исследованиях» . Европейский журнал клинических исследований . 47 (10): 756–774. дои : 10.1111/eci.12801 . ПМИД 28796277 .
- ^ Тейлор С.К., Лаперьер Г., Жермен Х. (май 2017 г.). «Капельная цифровая ПЦР в сравнении с кПЦР для анализа экспрессии генов с небольшим количеством мишеней: от переменной ерунды до данных о качестве публикации» . Научные отчеты . 7 (1): 2409. Бибкод : 2017НатСР...7.2409Т . дои : 10.1038/s41598-017-02217-x . ПМК 5445070 . ПМИД 28546538 .
- ^ Марусина, Катя (1 октября 2017 г.). «Позиционирование цифровой ПЦР для более четкого представления генома» . Новости генной инженерии и биотехнологии . Проверено 8 июня 2019 г.
- ^ Перкель Дж. (май 2015 г.). «Руководство нашими экспериментами по ПЦР» . БиоТехники . 58 (5): 217–221. дои : 10.2144/000114283 . ПМИД 25967899 .
- ^ Нур А., Нернер Г., Халил А. (июнь 2020 г.). «Десятая годовщина Руководства MIQE: хорошие и плохие студенты» . Джин сообщает . 19 : 100630. doi : 10.1016/j.genrep.2020.100630 . S2CID 212994609 . Проверено 12 февраля 2021 г.
- ^ Группа dMIQE (август 2020 г.). «Обновление рекомендаций по цифровому MIQE: Минимальная информация для публикации количественных экспериментов по цифровой ПЦР на 2020 год» . Клиническая химия . 66 (8): 1012–1029. дои : 10.1093/clinchem/hvaa125 . hdl : 1854/LU-8688167 . ПМИД 32746458 . Проверено 12 февраля 2021 г.
- ^ Бастин С., Кауард А., Сэдлер Дж., Тир Л., Нолан Т. (17 декабря 2020 г.). «CoV2-ID, совместимый с MIQE 5-плексный RT-PCR-анализ продолжительностью менее 20 минут, нацеленный на SARS-CoV-2, для диагностики COVID-19» . Научные отчеты . 10 (1): 22214. Бибкод : 2020NatSR..1022214B . дои : 10.1038/s41598-020-79233-x . ПМЦ 7747624 . ПМИД 33335187 .
- ^ Jump up to: а б Бирни, Эндрю (14 мая 2015 г.). «Влияние новых технологий на соблюдение рекомендаций MIQE» . Новости генной инженерии и биотехнологии . Проверено 13 июня 2019 г.
- ^ Руйтер Дж. М., Лефевер С., Анкарт Дж., Хеллеманс Дж., Пфаффл М.В., Бенеш В., Бустин С.А., Вандесомпель Дж., Унтергассер А. (июнь 2015 г.). «RDML-Ninja и RDMLdb для стандартизированного обмена данными qPCR» . БМК Биоинформатика . 16 (197): 197. дои : 10.1186/s12859-015-0637-6 . ПМЦ 4474546 . ПМИД 26087842 .
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]- Шипли, Грег (2011). «Разоблаченные рекомендации MIQE». В Кеннеди, Сюзанна; Освальд, Ник (ред.). Устранение неполадок и оптимизация ПЦР: основное руководство . Горизонт Научная Пресса . стр. 151–166. ISBN 978-1904455721 .