Шишка и дырка
Метод ударов и дырок — это инструмент химической генетики , позволяющий изучать конкретную изоформу семейства белков, не затрагивая других членов семейства. Недостижимость избирательного ингибирования изоформ из-за структурной гомологии семейств белков является серьезной проблемой химической генетики. С помощью подхода «выступ и отверстие» интерфейс белок-лиганд разрабатывается для достижения селективности за счет стерической комплементарности при сохранении биохимической компетентности и ортогональности паре дикого типа. Обычно аналог лиганда/ингибитора с «ударом» предназначен для связывания соответствующего белка с «модифицированными дырками». Ударные лиганды обычно представляют собой более объемистые производные кофактора целевого белка. Белки, модифицированные по дырке, рекомбинантно экспрессируются с заменой аминокислоты с большего на меньший остаток, например глицин или аланин, в сайте связывания кофактора. Разработанный лиганд/ингибитор обладает специфичностью к сконструированному белку из-за стерической комплементарности, но не к нативному аналогу из-за стерической интерференции. [1]
История
[ редактировать ]Вдохновением для метода «бамп-и-дырка» послужили мутантные штаммы E. coli , которые несли мутантную версию фенилаланин- тРНК-синтетазы A294S и выжили при воздействии p -FluoroPhe, слегка измененного аналога фенилаланина, который является цитотоксичным при включении в трансляцию . Мутантный штамм A294S был способен включать Phe, но не увеличенный p -FluoroPhe из-за стерического скученности гидроксиметилена S294. [2] Более поздние работы в лабораториях Питера Г. Шульца и Дэвида А. Тиррелла показали, что мутант фенилаланин-тРНК-синтетазы A294G с модифицированной дыркой способен включать в трансляцию увеличенный p -FluoroPhe, демонстрируя, что стерические манипуляции могут успешно расширить диапазон субстратов, даже для высокоспецифичная аминоацилсинтетаза. [3]
Первая пара «выступ-и-дырка», разработанная Стюартом Шрайбером и его коллегами, представляла собой небольшую молекулу циклоспорина A с выступом, в которой Ile заменяет Val в положении 11, и мутант циклофилина с модифицированной дыркой (S99T/F113A) . [5] Циклоспорин А является химическим индуктором димеризации (CID) циклофилина. Эта первая пара выступов и отверстий была разработана для повышения эффективности связывания между циклоспорином А дикого типа и циклофилином, тем самым обеспечивая более эффективный CID. Было обнаружено, что увеличенный циклоспорин А эффективно взаимодействует с мутантом циклофилина, модифицированным по дыркам, но не с эндогенным циклофилином. Ортогональную пару CID использовали для ингибирования кальциневрином опосредованного дефосфорилирования ядерного фактора активированных Т-клеток клеточно- и тканеспецифичным образом. [6] Совсем недавно эта первая пара выступов и отверстий была использована для индукции сборки диоксигеназы десять-одиннадцать транслокации 2 в клетках для контролируемого во времени деметилирования ДНК . [7]
Приложения
[ редактировать ]Когда стала доступна структурная информация о интерфейсах белок-лиганд, пары выступов и отверстий стали использоваться для выяснения субстратов конкретных белков из различных классов белков, а также для разработки ортогональных неоферментно-неосубстратных терапевтических средств.
Киназы
[ редактировать ]
Человеческие протеинкиназы используют АТФ в качестве кофактора для фосфорилирования белков-субстратов. Киназы играют решающую роль в сложных сигнальных сетях клеток. Консервативные сайты связывания АТФ и подобные каталитические механизмы создают проблему избирательного ингибирования конкретной киназы для определения ее функции. Лаборатория Кевана Шоката разработала пары «выступ и отверстие», используя мутанты киназы с объемистыми остатками «привратника» в АТФ-связывающем кармане, замененными Gly или Ala, и объемистыми аналогами АТФ. В ранних работах было показано, что мутанты киназы v-Src I338A/G акцептируют [γ- 32 P]-меченный выпуклый N 6 -циклопентил и N 6 Аналоги -бензил-АТФ в качестве альтернативных кофакторов для радиоактивной метки его субстратов. [8] Только мутантная киназа была способна связывать поврежденные аналоги АТФ, что позволяло маркировать субстраты, специфичные для сконструированной киназы v-Src. Очистка и протеомика на основе МС позволили получить субстраты киназы v-Src. Пары аналогов киназы, модифицированной по дырке, и пар аналогов АТФ с ударами позволили составить профиль субстрата нескольких других киназ, включая CDK1 , Pho85, ERK2 и JNK. [9]
Хотя аналоги ATM с ударами могут помочь деконволюции профилей субстратов киназы, одним из недостатков этой стратегии является клеточная непроницаемость аналогов с ударами. Чтобы обойти эту проблему, группа Шоката продемонстрировала, что увеличенный аналог АТФ, кинетин АТФ или КТР, может синтезироваться эндогенно в клетках, культивируемых с кинетином . После синтеза он может активировать мутант киназы PINK1 , который в противном случае неактивен в отсутствие измененного аналога. Неактивный PINK1 вовлечен в болезнь Паркинсона (БП). В контексте БП мутантная пара PINK1-KTP представляет собой ортогональный неофермент-неосубстратный терапевтический препарат. [10]
Группа Шоката также применила метод «удар и отверстие» для разработки селективных, проницаемых для клеток ингибиторов мутантных киназ. Для киназы I338G v-Src используется производное 4-амино-1- - бутил-3-( п -метилфенил)пиразоло[3,4-d]пиримидина (PP1), называемое p- трет т ButPhe-PP1 был разработан для избирательного ингибирования; стерическая масса препятствовала связыванию с киназой v-Src дикого типа. В клеточных линиях млекопитающих активная киназа v-Src необходима для трансформации вирусом саркомы Рауса . экспрессирующих киназу I338G v-Src и трансфицированных RSV, обработка p- В клеточных линиях , т Но Phe-PP1 вызвал обратную трансформацию, что указывает на ингибирование мутанта киназы. [11] Позже группа разработала ударные ингибиторы 1-нафтил PP1 (NA-PP1) и 1-метилнафтил PP1 (MN-PP1), которые ингибировали модифицированные дырками киназы дрожжей со значениями IC50 в низких наномолярных концентрациях. [12]
БЭТ-белки
[ редактировать ]
Семейство белков BET (бромодомены и экстратерминальные) содержит консервативные мотивы, известные как бромодомены (BD), ответственные за распознавание ацетилированного лизина на нуклеосомных гистонах. [14] Недавно четыре члена семейства BET, BRD2, 3, 4 и BRDT, каждый из которых содержит два бромодомена, были идентифицированы как важные регуляторы транскрипции. [15] Чтобы исследовать специфичные для бромодомена функции членов семейства BET, были разработаны низкомолекулярные ингибиторы JQ1 и I-BET, но им не хватало меж- и внутри-BET (между BD на одном и том же белке) селективности. [16] В лаборатории Алессио Чиулли были созданы пары выступов и отверстий, состоящие из ET, производного I-BET с этильным выступом, и различных членов семейства BET с мутацией L94A в их BD1. [13] Было обнаружено, что ET обладает в 160 раз большей специфичностью к модифицированному по дырке BD1 мутантов BET по сравнению с BD белков BET дикого типа, что обеспечивает BD-специфическое ингибирование. Пары выступов и отверстий BD-ET использовали, чтобы показать, что избирательное ингибирование BD1 в белке BET нарушает взаимодействие хроматина. Недавно группа Чиулли разработала новую пару «бамп-и-дырка», состоящую из мутантов BET с мутацией Leu в Val в BD и ударного низкомолекулярного ингибитора 9-ME-1. Было обнаружено, что этот ударный ингибитор имеет IC50 200 нМ и более чем 100-кратную специфичность в отношении BD мутанта L/V BET по сравнению с BD дикого типа. Эта пара выступов и отверстий позволила избирательно ингибировать специфические BD в конкретных белках BET, что объясняет их роль в клетках человека. Было обнаружено, что, хотя BD1 важен для локализации белков BET в хроматине, BD2 регулирует экспрессию генов путем связывания и рекрутирования негистоновых ацетилированных белков, таких как факторы транскрипции. [17]
Гликозидазы
[ редактировать ]
Гликозидазы — семейство ферментов, катализирующих гидролиз гликозидных связей . Эти ферменты могут расщеплять гликаны из гликозилированных белков, что является одной из наиболее распространенных форм посттрансляционной модификации . В недавнем терапевтическом применении метода «удар и отверстие» модифицированную по отверстиям галактозидазу использовали в сочетании с «ударным» галактозил-пролекарством. Джингли Хоу и его коллеги стремились доставить оксид азота , важный посредник, способствующий процессам роста тканей, таким как ангиогенез и васкулогенез , пространственно-временно контролируемым образом. Они выбрали систему пролекарств , высвобождающий NO , в которой NONOate , изначально гликозилирован. Как только гликозилированный NONOate проникает в клетки и подвергается воздействию гликозидаз, NO высвобождается. Однако из-за широкого распространения эндогенных гликозидаз было очевидно неспецифическое системное высвобождение NO из этих пролекарств, которое может снижать терапевтическую эффективность и вызывать вредные побочные эффекты. Чтобы обойти это, Хоу и др. разработал улучшенный пролекарство через метилирование О6 галактозного фрагмента галактозил-НОНОата. Они создали соответствующий мутант β-галактозидазы с модифицированной дыркой, A4-β-GalH363A, обладающий специфичностью к увеличенному галактозил-NONOату. Ударенное пролекарство избегало расщепления β-галактозидазой дикого типа благодаря метилированному О6 галактозного фрагмента и строгой региоселективности гликозидаз. NO высвобождался в тканях только в присутствии как галактозил-НОНОата, так и мутанта β-галактозидазы с модифицированной дыркой, что обеспечивало пространственно-временной контроль доставки. Хоу и др. обнаружили заметно повышенную терапевтическую эффективность доставки NO через систему, спроектированную с помощью ударов и отверстий, по сравнению с немодифицированным пролекарством, на ишемии задних конечностей у крыс и остром повреждении почек у мышей. моделях [18]
N -ацетилгалактозаминилтрансферазы
[ редактировать ]
Семейство N- ацетилгалактозаминилтрансфераз (GalNac Ts) переносит N-ацетилгалактозамин на боковые цепи Ser/Thr ( O-связанное гликозилирование ) своих субстратов, используя UDP-GalNac в качестве кофактора. Как и в случае с киназами, профилирование субстрата для конкретных изоформ GalNac Ts было затруднено. Отсутствие консенсусной последовательности гликозилирования и вариабельность образования гликанов представляют проблему для изучения гликопротеинов O-GalNac. Кроме того, стратегии нокаута трансферазы GalNac неэффективны, поскольку активность изоформ в семействе является как избыточной, так и конкурентной, так что компенсация происходит при нокауте. Недавно Шуман и др. применил стратегию «бамп-и-дырка» для конструирования алкинсодержащих аналогов UDP -GalNac и модифицированного с двойной дыркой мутанта GalNac Ts I253A/L310A (BH GalNac Ts). Аналоги UDP-алкина были специфичны по отношению к комплементарным BH GalNac Ts, которые, как было показано, сохраняли биохимическую компетентность GalNac Ts дикого типа в отношении структуры, локализации и субстратной специфичности. Эта пара выступов и отверстий прикрепила биоортогональную метку, визуализируемую через щелкните химию на субстратах различных изоформ GalNac T, деконволюцию профилей субстрата, демонстрируя при этом сложность выработки гликанов в секреторном пути. [19]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Ислам, Кабирул (октябрь 2018 г.). «Тактика ударов и дырок: расширение возможностей химической генетики» . Клеточная химическая биология . 25 (10): 1171–1184. doi : 10.1016/j.chembiol.2018.07.001 . ПМК 6195450 . ПМИД 30078633 .
- ^ Каст, Питер; Хеннеке, Хауке (ноябрь 1991 г.). «Специфичность аминокислотного субстрата фенилаланил-тРНК-синтетазы Escherichia coli, измененная различными мутациями». Журнал молекулярной биологии . 222 (1): 99–124. дои : 10.1016/0022-2836(91)90740-W . ПМИД 1942071 .
- ^ Лю, Чанг С.; Шульц, Питер Г. (7 июня 2010 г.). «Добавление новых химических элементов в генетический код». Ежегодный обзор биохимии . 79 (1): 413–444. doi : 10.1146/annurev.biochem.052308.105824 . ISSN 0066-4154 . ПМИД 20307192 .
- ^ Белшоу, Питер Дж.; Шепфер, Джозеф Г.; Лю, Карен-Цянье; Моррисон, Ким Л.; Шрайбер, Стюарт Л. (16 октября 1995 г.). «Рациональный дизайн ортогональных комбинаций рецептора и лиганда». Angewandte Chemie International Edition на английском языке . 34 (19): 2129–2132. дои : 10.1002/anie.199521291 . ISSN 0570-0833 .
- ^ Шрайбер, Стюарт Л. (1 августа 1998 г.). «Химическая генетика, возникшая в результате увлечения синтетической органической химией» . Биоорганическая и медицинская химия . 6 (8): 1127–1152. дои : 10.1016/S0968-0896(98)00126-6 . ISSN 0968-0896 . ПМИД 9784856 .
- ^ Белшоу, Питер Дж.; Шрайбер, Стюарт Л. (февраль 1997 г.). «Клеточно-специфическое ингибирование кальциневрина модифицированным циклоспорином». Журнал Американского химического общества . 119 (7): 1805–1806. дои : 10.1021/ja9636146 . ISSN 0002-7863 .
- ^ Ли, Цзя; Ма, Голин, Цзисян; Ли, Цянь; Сунь, Чжоу, Юбин; «Инженерный фермент Split-TET2 для индуцируемого эпигенетического ремоделирования» . Журнал Американского химического общества . 139 ): 4659–4662 doi : 10.1021 . ISSN 0002-7863 . jacs.7b01459 / . 08 ( 13 .
- ^ Jump up to: а б Лю, Йи; Шах, Кавита; Ян, Фэн; Витуки, Лори; Шокат, Кеван М. (февраль 1998 г.). «Разработка протеинкиназ семейства Src с неестественной нуклеотидной специфичностью» . Химия и биология . 5 (2): 91–101. дои : 10.1016/S1074-5521(98)90143-0 . ПМИД 9495830 .
- ^ Уберсакс, Джеффри А.; Вудбери, Эрика Л.; Куанг, Фуонг Н.; Параз, Мария; Блетроу, Джастин Д.; Шах, Кавита; Шокат, Кеван М.; Морган, Дэвид О. (октябрь 2003 г.). «Мишени циклинзависимой киназы Cdk1» . Природа . 425 (6960): 859–864. Бибкод : 2003Natur.425..859U . дои : 10.1038/nature02062 . ISSN 0028-0836 . ПМИД 14574415 . S2CID 4391711 .
- ^ Герц, Николас Т.; Берте, Амандин; Сос, Мартин Л.; Торн, Курт С.; Берлингейм, Эл Л.; Накамура, Кен; Шокат, Кеван М. (август 2013 г.). «Неосубстрат, усиливающий каталитическую активность киназы PINK1, связанной с болезнью Паркинсона» . Клетка . 154 (4): 737–747. дои : 10.1016/j.cell.2013.07.030 . ПМЦ 3950538 . ПМИД 23953109 .
- ^ Бишоп, Энтони К.; Шах, Кавита; Лю, Йи; Витуки, Лори; Кунг, Чи-юнь; Шокат, Кеван М. (февраль 1998 г.). «Разработка аллель-специфичных ингибиторов для исследования передачи сигналов протеинкиназы» . Современная биология . 8 (5): 257–266. дои : 10.1016/S0960-9822(98)70198-8 . ПМИД 9501066 .
- ^ Бишоп, Энтони К.; Уберсакс, Джеффри А.; Петш, Дея Т.; Матеос, Дина П.; Грей, Натаниэль С.; Блетроу, Джастин; Симидзу, Эйдзи; Цянь, Джо З.; Шульц, Питер Г.; Роуз, Марк Д.; Вуд, Джон Л. (сентябрь 2000 г.). «Химический переключатель для чувствительных к ингибиторам аллелей любой протеинкиназы» . Природа . 407 (6802): 395–401. Бибкод : 2000Natur.407..395B . дои : 10.1038/35030148 . ISSN 0028-0836 . ПМИД 11014197 . S2CID 4430890 .
- ^ Jump up to: а б Бод, MGJ; Линь-Шяо, Э.; Кардоте, Т.; Таллант, К.; Пщибул, А.; Чан, К.-Х.; Ценгерле, М.; Гарсия-младший; Кван, ТТ-Л.; Фергюсон, FM; Чулли, А. (31 октября 2014 г.). «Методический подход к инженерно-контролируемой селективности химических зондов с бромодоменом БЭТ» . Наука . 346 (6209): 638–641. Бибкод : 2014Sci...346..638B . дои : 10.1126/science.1249830 . ISSN 0036-8075 . ПМЦ 4458378 . ПМИД 25323695 .
- ^ Филиппакопулос, Панагис; Ци, Цзюнь; Пико, Сара; Шен, Яо; Смит, Уильям Б.; Федоров Олег; Морс, Элизабет М.; Китс, Трейси; Хикман, Тайлер Т.; Феллетар, Ильдико; Филпотт, Мартин (декабрь 2010 г.). «Селективное ингибирование бромодоменов BET» . Природа . 468 (7327): 1067–1073. Бибкод : 2010Natur.468.1067F . дои : 10.1038/nature09504 . ISSN 0028-0836 . ПМК 3010259 . ПМИД 20871596 .
- ^ Ши, Цзянь; Ван, Ифань; Цзэн, Лей; Ву, Яди; Дэн, Цзюн; Чжан, Цян; Линь, Ивэй; Ли, Цзюньлинь; Канг, Тибанг; Тао, Мин; Русинова, Елена (февраль 2014 г.). «Нарушение взаимодействия BRD4 с диацетилированным твистом подавляет опухолегенез при базальноподобном раке молочной железы» . Раковая клетка . 25 (2): 210–225. дои : 10.1016/j.ccr.2014.01.028 . ПМК 4004960 . ПМИД 24525235 .
- ^ Филиппакопулос, Панагис; Ци, Цзюнь; Пико, Сара; Шен, Яо; Смит, Уильям Б.; Федоров Олег; Морс, Элизабет М.; Китс, Трейси; Хикман, Тайлер Т.; Феллетар, Ильдико; Филпотт, Мартин (декабрь 2010 г.). «Селективное ингибирование бромодоменов BET» . Природа . 468 (7327): 1067–1073. Бибкод : 2010Natur.468.1067F . дои : 10.1038/nature09504 . ISSN 0028-0836 . ПМК 3010259 . ПМИД 20871596 .
- ^ Ранси, AC; Ценгерле, М.; Чан, К.-Х.; Теста, А.; ван Берден, Л.; Бод, MGJ; Эпемолу, О.; Эллис, LCJ; Прочтите, К.Д.; Култхард, В.; Брайен, А. (2018). «Оптимизация комплексного подхода к аллель-селективному ингибированию бромодомена BET» . Химическая наука . 9 (9): 2452–2468. дои : 10.1039/C7SC02536J . ISSN 2041-6520 . ПМК 5909127 . ПМИД 29732121 .
- ^ Jump up to: а б Хоу, Цзинли; Чжу, Дашуай; Фэн, Гуовэй; Ван, Кан; Чжао, Ян; Чжу, Ян (февраль 2019 г.) . Доставка оксида азота через пару фермент-пролекарство на основе «выступа и отверстия» . Nature Chemical Biology . 15 (2): 151–160. doi : 10.1038/s41589-018-0190-5 . ISSN 1552-4450 . PMID 30598545
- ^ Jump up to: а б Шуман, Бенджамин; Малакер, Стейси Элис; Вишновский, Саймон Петр; Дебетс, Марджоке Фрукье; Агбай, Энтони Джон; Фернандес, Даниэль; Вагнер, Лорен Ян Сарбо; Линь, Лян; Ли, Чжэнь; Чхве, Джунвон; Фокс, Дуглас Майкл (апрель 2020 г.). «Методическая инженерия идентифицирует специфические субстраты гликозилтрансфераз в живых клетках» . Молекулярная клетка . 78 (5): 824–834.e15. doi : 10.1016/j.molcel.2020.03.030 . ПМК 7276986 . ПМИД 32325029 .