Тест на диффузию диска
Дисковый диффузионный тест (также известный как тест на диффузию в агаре , тест Кирби-Бауэра , диско-диффузионный тест на чувствительность к антибиотикам , диско-диффузионный тест на чувствительность к антибиотикам и тест KB ) представляет собой культуры анализ на основе микробиологический , используемый в диагностических лабораториях и лабораториях по разработке лекарств . В диагностических лабораториях этот анализ используется для определения чувствительности бактерий, выделенных от инфекции пациента, к клинически одобренным антибиотикам. Это позволяет врачам назначать наиболее подходящее лечение антибиотиками. [1] [2] [4] [5] В лабораториях по поиску лекарств, особенно в лабораториях биоразведки , этот анализ используется для скрининга биологического материала (например, растительных экстрактов, бактериальных ферментационных бульонов) и потенциальных лекарств на предмет антибактериальной активности. При биоразведке анализ можно проводить с парными штаммами бактерий, чтобы добиться дерепликации и предварительно определить механизм антибактериального действия . [6] [7]
В диагностических лабораториях тест проводится путем инокуляции поверхности агаровой пластинки бактериями, выделенными из инфекции пациента. Затем на агар наносят бумажные диски, содержащие антибиотики, и чашку инкубируют. Если антибиотик останавливает рост бактерий или убивает их , вокруг диска останется область, где бактерии еще не разрослись настолько, чтобы их можно было увидеть. Это называется зоной торможения. Чувствительность бактериального изолята к каждому антибиотику затем можно полуколичественно оценить путем сравнения размера этих зон ингибирования с базами данных информации об известных антибиотикочувствительных, умеренно чувствительных и устойчивых бактериях. Таким образом, можно определить наиболее подходящий антибиотик для лечения инфекции пациента. [1] [2] Хотя диско-диффузионный тест нельзя использовать для дифференциации бактериостатической и бактерицидной активности, он менее громоздок, чем другие методы определения чувствительности, такие как разведение бульона . [4]
В лабораториях по поиску лекарств тест на диффузию диска проводится немного иначе, чем в диагностических лабораториях. В этом случае необходимо охарактеризовать не бактериальный штамм, а тестируемый экстракт (например, растительный или микробный экстракт). Поэтому чашку с агаром инокулируют бактериальным штаммом известного фенотипа (часто штаммом ATCC или NCTC ), а на поверхность наносят диски, содержащие тестируемый экстракт. [6] Размеры зоны ингибирования не могут использоваться в качестве полуколичественной меры антибактериальной активности, поскольку разные экстракты содержат молекулы с разными диффузионными характеристиками (разные размеры молекул , гидрофильность и т. д.). Однако размеры зоны ингибирования можно использовать и с целью дерепликации. Это достигается путем тестирования каждого экстракта против парных штаммов бактерий (например, чувствительных к стрептомицину и устойчивых к стрептомицину штаммов для выявления экстрактов, содержащих стрептомицин). Парные штаммы (например, дикого типа и штаммы со сверхэкспрессией- мишенью ) также можно использовать для определения механизма антибактериального действия. [6] [7]
История
[ редактировать ]Диффузию в агаре впервые использовал Мартинус Бейеринк в 1889 году для изучения влияния ауксинов на рост бактерий. Однако на протяжении многих лет этот метод разрабатывался, уточнялся и стандартизировался многими учеными и научными организациями, включая Джорджа Ф. Реддиша, Нормана Хитли , Джеймса Г. Винсента, [8] Альфред В. Бауэр, Уильям М.М. Кирби, Джон С. Шеррис , [4] [5] Ханс Мартин Эрикссон, Всемирная организация здравоохранения , Институт клинических и лабораторных стандартов , Шведская справочная группа по антибиотикам, Немецкий институт нормунгов , Британское общество антимикробной химиотерапии и другие. [8]
Принцип
[ редактировать ]Чистую бактериальную культуру суспендируют в физиологическом растворе, стандартизируют ее мутность и равномерно наносят тампоном на чашку с агаром. Затем на поверхность агара помещают диск фильтровальной бумаги, пропитанный антибиотиком или экстрактом. Компонент(ы) диска диффундируют из фильтровальной бумаги в агар. Концентрация этих компонентов будет самой высокой вблизи диска и будет уменьшаться по мере удаления от диска. Если антибиотик или экстракт эффективен против бактерий в определенной концентрации, колонии не будут расти там, где концентрация в агаре превышает или равна эффективной концентрации. Это зона торможения. В целом, более крупные зоны ингибирования коррелируют с более низкими минимальными ингибирующими концентрациями (МИК) антибиотика или экстракта для этого бактериального штамма. [1] Исключением являются случаи, когда молекулы антибиотика или экстракта большие или гидрофобные, поскольку они медленно диффундируют через агар. [6]
Стандартный метод
[ редактировать ]
Агаровая чашка и подготовка инокулята
[ редактировать ]Все аспекты процедуры Кирби-Бауэра стандартизированы для обеспечения последовательных и точных результатов. По этой причине лаборатория должна придерживаться этих стандартов. Средой, используемой в тесте Кирби-Бауэра, должен быть агар Мюллера-Хинтона глубиной всего 4 мм, разлитый в чашки Петри диаметром 100 или 150 мм. Уровень pH агара должен находиться в пределах 7,2–7,4. Бактериальный инокулят готовят путем разведения бульонной культуры до стандарта мутности 0,5 МакФарланда , что эквивалентно примерно 150 миллионам клеток на мл. [1]
Инокуляция и инкубация
[ редактировать ]С использованием асептических методов бульонную культуру конкретного организма собирают стерильным тампоном . В случае грамотрицательных бактерий излишняя жидкость удаляется из тампона путем осторожного нажатия или вращения его против внутренней части пробирки. Затем мазок наносят штрихами на чашку с агаром Мюллера-Хинтона, образуя бактериальный газон. Для получения равномерного роста пластинку с агаром протирают тампоном в одном направлении, поворачивают на 120° и снова прокрашивают, поворачивают еще на 120° и снова прокрашивают. Затем с помощью дозатора дисков с антибиотиками на пластину наносятся диски, содержащие определенные антибиотики. Это необходимо сделать в течение 15 минут после прививки. Стерилизованные пламенем щипцы аккуратно прижимают каждый диск к агару и обеспечивают его фиксацию. Затем планшеты инкубируют в течение ночи, обычно при температуре 35°C. Чашки необходимо инкубировать в течение 15 минут после нанесения дисков с антибиотиком. [1]
Альтернативные методы
[ редактировать ]Было разработано несколько вариантов метода дисковой диффузии, в том числе метод оксфордской пенициллиновой чашки и методы Etest , используемые в больничных диагностических лабораториях. [9] [10] а также методы луночной диффузии, цилиндрической диффузии и биоавтографии, используемые в лабораториях по открытию и разработке лекарств. [6] [11]
Оксфордский метод пенициллиновой чашки
[ редактировать ]Диски, содержащие возрастающие концентрации антибиотиков, помещают на засеянную бактериальную лужайку на поверхности агара и чашки инкубируют. Размеры зон измеряются от края диска до конца свободной зоны. Интерпретация более сложна в популяциях со смешанной восприимчивостью. Они представлены в виде линейных размеров или квадратов расстояний как функции натурального логарифма концентрации антибиотика в дисках. МИК определяется по нулевой точке аппроксимации данных линейной регрессией. [12] Сам перехват представляет собой логарифм MIC. Наклон линии регрессии связан с коэффициентом диффузии конкретного антибиотика в агаре. [9]
Другие изображения
[ редактировать ]![Диффузия в агаре была впервые использована в 1889 году Мартинусом Бейеринком.[8]](//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/5/51/Martinus_Willem_Beijerinck.png/148px-Martinus_Willem_Beijerinck.png)
Диффузия в агаре была впервые использована в 1889 году Мартинусом Бейеринком . [8]
Подробный обзор результатов теста на диффузию в агаре.
Антибиограмма Serratia marcescens . На каждом диске указан антибиотик, который он содержит (например, AMC30, 30 мкг амоксициллина/клавулановой кислоты ).
![Диффузия в агаре была впервые использована в 1889 году Мартинусом Бейеринком.[8]](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/5/51/Martinus_Willem_Beijerinck.png/148px-Martinus_Willem_Beijerinck.png)
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б с д и ж EUCAST (январь 2021 г.). «Тестирование чувствительности к противомикробным препаратам: диско-диффузионный метод EUCAST» (PDF) . www.eucast.org . ЕСКАСТ . Проверено 16 марта 2021 г.
- ^ Перейти обратно: а б с Браун Д.Ф., Котари Д. (октябрь 1975 г.). «Сравнение дисков с антибиотиками из разных источников» . Журнал клинической патологии . 28 (10): 779–83. дои : 10.1136/jcp.28.10.779 . ПМЦ 475859 . ПМИД 1214010 .
- ^ Саху, БК (2013). Антимикробные свойства надземной части Sesbania grandiflora (Linn.) (Семестровый проект). Фармацевтический колледж Барпали, Индия.
- ^ Перейти обратно: а б с Бауэр А.В., Перри Д.М., Кирби В.М. (август 1959 г.). «Однодисковое тестирование стафилококков на чувствительность к антибиотикам: анализ техники и результатов». Архив внутренней медицины . 104 (2): 208–216. дои : 10.1001/archinte.1959.00270080034004 . ПМИД 13669774 .
- ^ Перейти обратно: а б Бауэр А.В., Кирби В.М., Шеррис Дж.К., Терк М. (апрель 1966 г.). «Тестирование чувствительности к антибиотикам стандартизированным методом одного диска». Американский журнал клинической патологии . 45 (4): 493–496. дои : 10.1093/ajcp/45.4_ts.493 . ПМИД 5325707 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и Кушни Т.П., Кушни Б., Эчеверрия Дж., Фаусантир В., Таммават С., Доджсон Дж.Л., Лоу С., Клоу С.М. (июнь 2020 г.). «Биопоиск антибактериальных препаратов: междисциплинарный взгляд на исходный материал натуральных продуктов, выбор биоанализа и ошибки, которых можно избежать» . Фармацевтические исследования . 37 (7): Статья 125. doi : 10.1007/s11095-020-02849-1 . ПМИД 32529587 . S2CID 254932190 .
- ^ Перейти обратно: а б Сингх С.Б., Янг К., Мизель Л. (август 2011 г.). «Стратегии скрининга для открытия антибактериальных натуральных продуктов». Экспертный обзор противоинфекционной терапии . 9 (8): 589–613. дои : 10.1586/eri.11.81 . ПМИД 21819327 . S2CID 986144 .
- ^ Перейти обратно: а б с Пшеница ПФ (июль 2001 г.). «История и развитие методологии тестирования чувствительности к противомикробным препаратам». Журнал антимикробной химиотерапии . 48 (Приложение 1): 1–4. дои : 10.1093/jac/48.suppl_1.1 . ПМИД 11420332 .
- ^ Перейти обратно: а б Бонев, Б; Хупер, Дж; Паризо, Дж. (июнь 2008 г.). «Принципы оценки чувствительности бактерий к антибиотикам методом диффузии в агар» . Журнал антимикробной химиотерапии . 61 (6): 1295–301. дои : 10.1093/jac/dkn090 . ПМИД 18339637 .
- ^ Лонсвей Д.Р., Элрод М.Г., Кендрик Н., Тиллер Р., Салливан М.М., Эдвардс Дж.Р., Блейни Д.Д., Карлссон М. (апрель 2020 г.). «Корреляция между Etest и микроразведениями эталонного бульона для определения антимикробной чувствительности Burkholderia pseudomallei ». Микробная лекарственная устойчивость . 26 (4): 311–318. дои : 10.1089/mdr.2019.0260 . ПМИД 31596673 . S2CID 204029543 .
- ^ Кширсагар М.М., Додамани А.С., Вишвакарма П., Мали Г., Хобрагадец В.Р., Деокар Р.Н. (ноябрь 2020 г.). «Сравнительная оценка антибактериальной эффективности имеющихся в продаже различных стоматологических гелей: исследование in vitro». Обзоры недавних клинических испытаний . 16 (2): 206–211. дои : 10.2174/1574887115666201104155458 . ПМИД 33148158 . S2CID 226257747 .
- ^ «Анализ чувствительности бактерий к антибиотикам методом диффузии в агар» . www.agardiffusion.com . Проверено 16 марта 2021 г.