Выделение (микробиология)
 | В этой статье есть несколько проблем. Пожалуйста, помогите улучшить его или обсудите эти проблемы на странице обсуждения . ( Узнайте, как и когда удалять эти шаблонные сообщения )
|
В микробиологии термин «выделение» относится к отделению штамма от естественной смешанной популяции живых микробов , присутствующих в окружающей среде, например, в воде или почве , или от живых существ с кожной флорой , флорой полости рта или кишечной флорой . для идентификации интересующего микроба(ов). [1] Исторически сложилось так, что лабораторные методы выделения впервые были разработаны в области бактериологии и паразитологии (в 19 веке), а затем в вирусологии в 20 веке.
История
[ редактировать ]Лабораторные методы выделения микробов впервые были разработаны в 19 в. в области бактериологии и паразитологии с использованием световой микроскопии . 1860 год ознаменовался успешным внедрением Луи Пастером жидкой среды . Разработанная Пастером жидкая культура позволила визуализировать стимулирование или ингибирование роста конкретных бактерий. Этот же метод используется сегодня с использованием различных сред, таких как маннитоловый солевой агар , твердая среда. Твердые культуры были разработаны в 1881 году, когда Роберт Кох затвердел жидкие среды путем добавления агара. [2]
Надлежащих методов изоляции в вирусологии не существовало до 20 века. Методы выделения микробов радикально изменились за последние 50 лет с точки зрения труда с ростом механизации, а также с точки зрения используемых технологий, а вместе с ними и скорости и точности.
Общие методы
[ редактировать ]
Чтобы изолировать микроб из естественной смешанной популяции живых микробов , присутствующих в окружающей среде, например, в водной или почвенной флоре , или от живых существ с флорой кожи , флорой полости рта или кишечной флорой , необходимо отделить его от смесь.
Традиционно микробы культивировали для идентификации интересующих микробов на основе характеристик их роста. физические методы увеличения градиента, такие как, например, серийное разведение или центрифугирование В зависимости от ожидаемой плотности и жизнеспособности микробов, присутствующих в жидком образце, могут быть выбраны .Чтобы изолировать организмы в материалах с высоким содержанием микробов, таких как сточные воды, почва или фекалии, серийные разведения увеличивают вероятность разделения смеси.
В жидкой среде с небольшим количеством ожидаемых организмов или вообще без них, из области, которая обычно стерильна (например, спинномозговая жидкость , кровь внутри системы кровообращения), центрифугирование, декантация надосадочной жидкости и использование только осадка увеличивают вероятность роста и выделения бактерий или обычно клеточно-ассоциированные вирусы.
Если кто-то ожидает или ищет особенно привередливый организм, микробиологическая культура и методы изоляции должны быть ориентированы на этот микроб. Например, бактерию, которая погибает на воздухе, можно выделить только в том случае, если образец переносится и обрабатывается в безвоздушных или анаэробных условиях. Бактерии, которая погибает при воздействии комнатной температуры (термофильные), требуется предварительно нагретый транспортный контейнер, а микробу, который высыхает и умирает при переноске на ватном тампоне, для успешного культивирования потребуется вирусная транспортная среда.
Бактериальная и грибковая культура
[ редактировать ]Прививка
[ редактировать ]Лаборанты инокулируют образец на определенные твердым агаром чашки с методом штриховых пластинок или в жидкую культуральную среду , в зависимости от цели выделения:
- Если кто-то хочет изолировать только определенную группу бактерий, например стрептококк группы А, из мазка из зева, можно использовать селективную среду , которая будет подавлять рост сопутствующих бактерий, ожидаемых в смеси (за счет антибиотиков, присутствующих в агаре), поэтому что только стрептококки «выделены», т.е. заметно выделяются. [3] Для выделения грибов агар Сабуро можно использовать . Альтернативно, летальные условия для стрептококков и грамотрицательных бактерий, такие как высокие соли концентрации в солевом агаре с маннитом, способствуют выживанию любых стафилококков, присутствующих в образце кишечных бактерий, а феноловый красный в агаре действует как индикатор pH, показывающий, способны ли бактерии ферментировать. маннита путем выделения кислоты в среду. В другие агаровые вещества добавляются, чтобы использовать способность организма вырабатывать видимый пигмент (например, среда Гранада для стрептококков группы B ), который изменяет цвет бактериальных колоний , или растворять кровяной агар путем гемолиза , чтобы их было легче обнаружить. Некоторым бактериям, таким как виды Legionella, для роста необходимы определенные питательные вещества или связывание токсинов, например, древесному углю такие среды, как агар с забуференным угольным дрожжевым экстрактом . , поэтому необходимо использовать
- Если кто-то хочет изолировать как можно больше или все различные питательные среды, а также обогащенные среды, такие как кровяной агар и шоколадный агар , и анаэробные питательные среды, такие как тиогликолятный бульон штаммы, необходимо инокулировать . Для подсчета роста бактерий можно суспендировать в расплавленном агаре до того, как он затвердеет, а затем разлить в чашки Петри . Это так называемый «метод разливной чашки», который используется в микробиологии окружающей среды и пищевой микробиологии (например, при тестировании молочных продуктов) для установления так называемый «аэробный подсчет тарелок».
Инкубация
[ редактировать ]После того, как образец инокулируется в выбранную среду или на нее, его инкубируют при соответствующих атмосферных условиях, таких как аэробные, анаэробные или микроаэрофильные условия, или с добавлением диоксида углерода (5%), при различных настройках температуры, например 37 °C в инкубатор скотохромогенных или холодильник для холодного обогащения, при соответствующем освещении, например, строго без света, завернутый в бумагу или в темную бутылку для микобактерий , и на разное время, поскольку разные бактерии растут с разной скоростью, варьирующейся от нескольких часов ( Escherichia coli ) до недель (например, микобактерии ).
через регулярные промежутки времени Лаборанты и микробиологи проверяют среду на наличие признаков видимого роста и записывают это. Проверка снова должна проводиться в условиях, благоприятствующих выживанию изолята, т.е. в «анаэробной камере» для анаэробных бактерий, например, и в условиях, которые не угрожают человеку, смотрящему на чашки, заразиться особо инфекционным микробом, т.е. шкаф биологической безопасности для Yersinia pestis (чума) или Bacillus anthracis например, (сибирская язва).
Идентификация
[ редактировать ]Когда бактерии заметно выросли, они часто все еще смешаны. Идентификация микроба зависит от выделения отдельной колонии , так же как биохимическое тестирование микроба для определения его различных физиологических особенностей зависит от чистой культуры .Чтобы сделать субкультуру , снова используют асептический метод микробиологии , поднимая одну колонию с поверхности агара с помощью петли и распределяя материал по 4 квадрантам агаровой чашки или по всему периметру, если колония была одиночной и не выглядела смешанной. .
Окрашивание по Граму позволяет визуализировать состав клеточной стенки бактерий на основе цвета, который окрашивают бактерии после серии этапов окрашивания и обесцвечивания. [4] Этот процесс окрашивания позволяет идентифицировать грамотрицательные и грамположительные бактерии. Грамотрицательные бактерии окрашиваются в розовый цвет из-за тонкого слоя пептидогликана. Если бактерия окрашивается в фиолетовый цвет из-за толстого слоя пептидогликана, это грамположительная бактерия. [4]
В клинической микробиологии используются многочисленные другие методы окрашивания конкретных организмов (кислотностойкое бактериальное окрашивание на микобактерии). Методы иммунологического окрашивания, такие как прямая иммунофлуоресценция , были разработаны для важных с медицинской точки зрения патогенов , которые медленно растут ( окрашивание аурамин-родамином для микобактерий ) или трудно растут (например, виды Legionella pneumophila ), и когда результат теста может изменить стандартное лечение и эмпирическую терапию. .
Биохимическое тестирование бактерий включает набор агаров во флаконах для отделения подвижных бактерий от неподвижных .В 1970 году была разработана миниатюрная версия, названная индексом аналитического профиля .
Успешная идентификация посредством, например, секвенирования генома и геномики, зависит от чистых культур.
Бактерии, независимые от культуры
[ редактировать ]Хотя наиболее быстрый метод идентификации бактерий — секвенирование их гена 16S рРНК , который предварительно был амплифицирован с помощью ПЦР , этот метод не требует выделения. Поскольку большинство бактерий невозможно вырастить обычными методами (особенно бактерии из окружающей среды или почвы), метагеномика или метатранскриптомика используются , дробовое секвенирование или секвенирование генома с помощью ПЦР . Секвенирование с помощью масс-спектрометрии , например, лазерная десорбция/ионизация с помощью матрицы (MALDI-TOF MS), используется при анализе клинических образцов для поиска патогенов. Полногеномное секвенирование — это вариант для отдельного организма, который невозможно охарактеризовать в достаточной степени для идентификации. небольшие микрочипы ДНК Для идентификации также можно использовать .
Ссылки
[ редактировать ]- ^ «Выделение и культивирование микроорганизмов» . Беседа по биологии . 2016-06-02 . Проверено 21 апреля 2023 г.
- ^ Бонне, М.; Лажье, Дж. К.; Рауль, Д.; Хелафия, С. (2020). «Культура бактерий в селективных и неселективных условиях: эволюция питательных сред в клинической микробиологии» . Новые микробы и новые инфекции . 34 : 100622. doi : 10.1016/j.nmni.2019.100622 . ISSN 2052-2975 . ПМК 6961714 . ПМИД 31956419 .
- ^ Альфред Браун, Хайди Смит (2012). Микробиологические применения Бенсона: Лабораторное руководство по общей микробиологии (тринадцатое изд.). Макгроу-Хилл Образование. ISBN 9780073402413 .
- ^ Jump up to: а б «Протоколы окраски по Граму» . АСМ.орг . Проверено 21 апреля 2023 г.