Тест Клейхауэра – Бетке

Не путать с тестом Кирби-Бауэра , который также часто называют «тестом КБ».

Тест Клейхауэра – Бетке
Тест Клейхауэра, показывающий эритроциты плода розового цвета, в то время как эритроциты взрослого человека видны только как «призраки».
Цель	измеряет перенос фетального гемоглобина

Проба Клейхауэра -Бетке («КБ») , окраска Клейхауэра-Бетке («КБ») , проба Клейхауэра или тест кислотного элюирования — это анализ крови, используемый для измерения количества фетального гемоглобина, перешедшего от плода матери в кровоток . Обычно его проводят резус-отрицательным матерям для определения необходимой дозы иммуноглобулина Rho(D) (RhIg) для ингибирования образования резус- антител у матери и предотвращения резус-заболевания у будущих резус-положительных детей. Он назван в честь Энно Кляйхауэра и Клауса Бетке, которые описали его в 1957 году.

Детали теста

Тест KB является стандартным методом количественной оценки плодно-материнского кровотечения (ФМГ). Он использует дифференциальную устойчивость фетального гемоглобина к кислоте. Стандартный мазок крови матери готовят из крови и подвергают воздействию кислотной ванны. удаляется взрослый гемоглобин При этом из эритроцитов , но не фетальный гемоглобин. Последующее окрашивание по методу Шепарда. заставляет фетальные клетки (содержащие фетальный гемоглобин) выглядеть розово-розовыми, в то время как взрослые эритроциты воспринимаются только как «призраки». Под микроскопом подсчитывают 2000 клеток и рассчитывают процентное соотношение эмбриональных и материнских клеток.

Тем, у кого тест положительный, следует провести последующее тестирование во время послеродового обследования, чтобы исключить возможность ложноположительного результата . Это может быть вызвано гемоглобинопатией у матери, которая вызывает стойкое повышение уровня фетального гемоглобина, например, серповидноклеточный признак .

Сравнение с другими более дорогими или технологически продвинутыми методами, такими как проточная цитометрия, показало, что окрашивание KB, как и более продвинутые методы, чувствительно при обнаружении FMH. Однако публикации показали, что по сравнению с методами проточной цитометрии тест KB переоценивает FMH из-за ложноположительных результатов при наличии F-клеток в образце материнской крови. плодом в размере до 5 мл, Ошибки фонового подсчета могут привести к оценке потери крови тогда как на самом деле такой кровопотери нет, но стандартные методы, доступные в большинстве лабораторий, допускают чрезвычайно низкую вероятность возврата ложноположительного результата при более тяжелой ФМГ. место.

Оригинальная техника

Метод

Тонкие мазки готовят из капиллярной или венозной крови, собранной в антикоагулянты, такие как гепарин , оксалат , цитрат или ЭДТА . Мазки высушивают на воздухе в течение 10–60 минут, фиксируют в 80 об.% этаноле в течение 5 минут при температуре 20–22 °C, промывают водопроводной водой и высушивают на воздухе. Затем пленки погружают в цитратно-фосфатный буфер на 5 минут при 37°С и осторожно перемешивают в течение примерно 3 минут. Предметные стекла промывают водопроводной водой, высушивают и окрашивают кислым гематоксилином Эрлиха в течение 3 мин, промывают водой и снова высушивают. Их докрашивают эритрозином в течение 3 мин. После окончательного ополаскивания пленки высушивают и исследуют под световой микроскопией.

Результаты оригинального метода

F-клетки гемоглобина густо окрашены эритрозином, клетки гемоглобина A выглядят как клетки-призраки, а промежуточные клетки окрашены в более или менее розовый цвет. Ретикулоциты, содержащие гемоглобин А, могут проявляться как промежуточные клетки и/или иметь внутриклеточную грануляцию. Тельца включения (тельца Гейнца, осажденные α-цепи или β-цепи) видны в элюированных клетках как компактные включения разного размера. Гемоглобин А элюируется независимо от того, является ли это оксигемоглобином, метгемоглобином, цианметгемоглобином, восстановленным гемоглобином или карбоксигемоглобином.

Количественное определение гемоглобина F-клеток

Окраска KB с зелеными метками на клетках, считающихся клетками плода (HbF), и красными метками на неполностью окрашенных клетках вверху и слишком маленькой клетке справа.

Методы, разработанные Шнайдером и Людвигом. и Bartsch' рекомендуются. Для определения внутриклеточного распределения гемоглобина F можно использовать полуколичественный метод Шепарда, Уэзерола и Конли.

Нормальные значения

Нормальные значения гемоглобина F-клеток у взрослых, первоначально опубликованные Клейхауэром, были ниже 0,01%; у доношенных новорожденных они превышают 90%.

Использование

Оценка тяжести фетально-материнских кровотечений

Чтобы определить, указывает ли положительный тест на FMH на вероятную причину смерти плода, следует рассчитать процент общего объема потерянной крови плода, сделав соответствующие поправки на основе следующих известных взаимосвязей:

• • размер эритроцита плода в 1,22 раза больше эритроцита взрослого;
  • Известно, что окрашивание KB имеет средний показатель успеха в обнаружении эритроцитов плода 92%;
  • у женщины на сроке беременности или в ближайшем сроке средний объем материнских эритроцитов составляет примерно 1800 мл;
  • средний гематокрит плода составляет 50%; и
  • При мертворождении средний объем крови плода составляет $150{\frac {ml}{kg}}$

Затем эти ограничения можно применить для получения формулы

$PFB={\frac {(3200)(FC)}{(FW)(MC)}}$

где

• • $PFB$ — процент потерянной крови плода;
  • $FC$ – наблюдаемое количество эритроцитов плода;
  • $MC$ — наблюдаемое количество материнских эритроцитов (обратите внимание, у нас есть это $MC=TC-FC$, где $TC$ – общее наблюдаемое количество эритроцитов как у матери, так и у плода);
  • $FW$ – масса мертворожденного плода в килограммах.

Количество флаконов RhD

Для оценки необходимого количества флаконов иммуноглобулина Rho(D) можно использовать следующие уравнения:

• Объем (мл) крови плода = % клеток плода x 50
• Необходимое количество флаконов с 300 мкг RhIG = объем крови плода/30 мл.

Объединение этих двух уравнений приводит к:

• Количество флаконов = % фетальных клеток x 50/30.

Это примерно равно:

• Количество флаконов = % фетальных клеток x 1,7.

На практике, если число справа от десятичной точки ≥5, оно округляется в большую сторону, чтобы добавить один флакон.

Разрешение мертворождения

Предположим, что выполнено окрашивание KB и $TC=5000$ наблюдаются общие эритроциты, $FC=200$ из которых оказались эритроцитами плода. Предположим далее, что масса мертворожденного рассматриваемого плода равна $FW=2.0kg$. Тогда мы могли бы сделать вывод, что общий процент кровопотери плода составляет примерно:

$PFB={\frac {(3200)(FC)}{(FW)(MC)}}={\frac {(3200)(200)}{(2.0)(4800)}}={\frac {200}{3}}=66.667$

до пяти значащих цифр . Таким образом, мы могли бы заключить, что рассматриваемый плод потерял 66,667% (две трети) своей крови через ФМГ. Как правило, мертворождение весьма вероятно при любом значении $PFB\geq 20$, особенно если плод внезапно теряет такое большое количество крови; в этом примере мы, следовательно, могли бы заподозрить ФМГ как причину мертворождения. Однако важно отметить, что такой диагноз еще не является полностью окончательным; плоды, теряющие большое количество крови в течение длительного периода времени, способны компенсировать эту более медленную кровопотерю; поскольку окраска KB ничего не говорит нам об уровне остроты FMH. Это означает, что невозможно полностью связать положительное окрашивание KB и высокий уровень $PFB$ с мертворождением, хотя во многих случаях при наличии другой информации, например об известных наследственных осложнениях беременности, чрезвычайно высокие коэффициенты положительной корреляции $r\approx +1.000$ между ФМГ и мертворождением не наблюдалось.

Проблемы с обнаружением эритроцитов плода

Поскольку клетки крови плода и матери имеют одинаковую продолжительность жизни в кровотоке матери, можно получить информативные результаты окрашивания KB в течение достаточного периода времени после мертворождения. Однако, если мать и плод несовместимы по системе АВО , более важно быстро провести окрашивание KB после мертворождения, поскольку эритроциты плода будут быстро выведены из кровотока матери, в результате чего окрашивание KB недооценит степень FMH. , если таковые имеются. В литературе высказывается большая обеспокоенность по поводу ложноположительных результатов при отборе проб после родов. В целом это не проблема. Роды действительно приводят к более высокой частоте выявления микрокровоизлияний, но это не должно мешать интерпретации ФМГ как возможной причины мертворождения. Нет необходимости брать образец перед индукцией, началом родов, родами, рождением плаценты и т. д., несмотря на то, что утверждается в некоторых опубликованных публикациях. Однако, если будет использоваться кесарево сечение, отказ от взятия образца до этого приведет к 2% ложноположительных результатов.

Наконец, все, что вызывает сохранение фетального гемоглобина в клетках материнской крови, значительно усложняет интерпретацию. Этому способствуют определенные гемоглобинопатии , наиболее распространенной из которых является серповидноклеточный признак. В целом, где-то в 1–3% случаев это может привести к неверной интерпретации.

Все случаи материнской травмы

В статье, опубликованной в 2004 году, сделан вывод о том, что тест Клейхауэра-Бетке (КБ) необходим во всех случаях материнской травмы, поскольку клиническая оценка недостаточно чувствительна для определения риска преждевременных родов. Он точно предсказывает риск преждевременных родов после материнской травмы, тогда как в статье сделан вывод, что клиническая оценка этого не дает. При отрицательном результате теста KB продолжительность посттравматического электронного мониторинга плода может быть безопасно ограничена. При положительном тесте KB значительный риск преждевременных родов требует тщательного наблюдения. KB-тестирование имеет важные преимущества для всех жертв материнской травмы, независимо от резус-статуса.

См. также

• Подходящий тест

Внешние ссылки

• [1] Тест Клейхауэра