Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
В молекулярной биологии полиморфизм длины рестрикционных фрагментов ( ПДРФ ) — это метод, который использует вариации гомологичных последовательностей ДНК , известные как полиморфизмы , популяции или виды, или для точного определения местоположения генов внутри последовательности. Этот термин может относиться к самому полиморфизму, обнаруженному по разным местоположениям сайтов рестрикции , или к соответствующему лабораторному методу, с помощью которого можно проиллюстрировать такие различия. При анализе RFLP образец ДНК расщепляется на фрагменты одним или несколькими ферментами рестрикции , а полученные фрагменты рестрикции затем разделяются с помощью гель-электрофореза в соответствии с их размером.
RFLP-анализ в настоящее время в значительной степени устарел из-за появления недорогих технологий секвенирования ДНК , но это был первый метод профилирования ДНК, достаточно недорогой, чтобы найти широкое применение. RFLP-анализ был важным ранним инструментом картирования генома , локализации генов генетических нарушений , определения риска заболеваний и тестирования отцовства .
ПДРФ-анализ
[ редактировать ]Базовый метод обнаружения RFLP включает фрагментацию образца ДНК с применением фермента рестрикции , который может избирательно расщеплять молекулу ДНК везде, где распознается короткая специфическая последовательность , в процессе, известном как рестрикционный расщепление . Фрагменты ДНК, полученные в результате расщепления, затем разделяются по длине с помощью процесса, известного как электрофорез в агарозном геле , и переносятся на мембрану с помощью процедуры Саузерн-блоттинга . Гибридизация мембраны с меченым ДНК-зондом затем определяет длину фрагментов, комплементарных зонду. Говорят, что полиморфизм длины рестрикционного фрагмента возникает, когда длина обнаруженного фрагмента варьируется у разных людей, что указывает на неидентичную гомологию последовательностей. Каждая длина фрагмента считается аллелем , независимо от того, содержит ли он кодирующую область или нет, и может использоваться в последующем генетическом анализе.
Примеры
[ редактировать ]Существует два общих механизма, с помощью которых размер конкретного рестрикционного фрагмента может изменяться. На первой схеме небольшой сегмент генома обнаруживается с помощью зонда ДНК (более толстая линия). В аллеле А геном расщепляется ферментом рестрикции по трем близлежащим сайтам (треугольникам), но зондом будет обнаружен только самый правый фрагмент. В аллеле a сайт рестрикции 2 был потерян в результате мутации , поэтому зонд теперь обнаруживает более крупный слитый фрагмент, идущий от сайтов 1 к 3. Вторая диаграмма показывает, как это изменение размера фрагмента будет выглядеть на Саузерн-блоттинге и как каждый аллель (два на человека) могут передаваться по наследству членам семьи.
На третьей схеме зонд и рестрикционный фермент выбраны для обнаружения области генома, которая включает сегмент тандемного повтора с переменным числом (VNTR) (прямоугольники на схематической диаграмме). В аллеле c имеется пять повторов в VNTR, и зонд обнаруживает более длинный фрагмент между двумя сайтами рестрикции. В аллели d имеется только два повтора в VNTR, поэтому зонд обнаруживает более короткий фрагмент между теми же двумя сайтами рестрикции. Другие генетические процессы, такие как инсерции , делеции , транслокации и инверсии , также могут приводить к полиморфизму. Для тестов RFLP требуются гораздо большие образцы ДНК, чем для тестов с короткими тандемными повторами (STR).
Приложения
[ редактировать ]Анализ вариаций RFLP в геномах раньше был жизненно важным инструментом картирования генома и анализа генетических заболеваний. Если бы исследователи пытались изначально определить хромосомное расположение гена конкретного заболевания, они бы анализировали ДНК членов семьи, страдающей этим заболеванием, и искали аллели RFLP, которые демонстрируют тот же тип наследования, что и болезнь (см. генетическая связь ). Как только ген заболевания был локализован, RFLP-анализ других семей мог выявить, кто подвергался риску заболевания или кто мог быть носителем мутантных генов. RFLP-тест используется для идентификации и дифференциации организмов путем анализа уникальных закономерностей в геноме. Его также используют для определения скорости рекомбинации в локусах между сайтами рестрикции.
RFLP-анализ также стал основой для первых методов генетического снятия отпечатков пальцев , полезных для идентификации образцов, взятых с мест преступлений , для определения отцовства и для характеристики генетического разнообразия или моделей размножения в популяциях животных.
Альтернативы
[ редактировать ]Однако методика ПДРФ-анализа медленная и громоздкая. Для этого требуется большое количество образца ДНК, а объединенный процесс мечения зондов, фрагментации ДНК, электрофореза, блоттинга, гибридизации, промывки и авторадиографии может занять до месяца. Об ограниченной версии метода RFLP, в котором использовались олигонуклеотидные зонды, сообщалось в 1985 году. [ 1 ] Результаты проекта «Геном человека» в значительной степени заменили необходимость картирования RFLP, а идентификация многих однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в этом проекте (а также прямая идентификация многих генов болезней и мутаций) заменила необходимость в Анализ связи заболеваний RFLP (см. генотипирование SNP ). Анализ аллелей VNTR продолжается, но теперь обычно проводится методами полимеразной цепной реакции (ПЦР). Например, стандартные протоколы снятия отпечатков ДНК включают ПЦР-анализ панелей более чем дюжины VNTR.
RFLP до сих пор используется в отборе с помощью маркеров. Полиморфизм длины терминального рестрикционного фрагмента (TRFLP или иногда T-RFLP) — это метод, первоначально разработанный для характеристики бактериальных сообществ в образцах смешанных видов. Этот метод также применялся к другим группам, включая почвенные грибы. TRFLP работает путем ПЦР-амплификации ДНК с использованием пар праймеров, помеченных флуоресцентными метками. Затем продукты ПЦР расщепляются с использованием ферментов RFLP, а полученные образцы визуализируются с помощью секвенатора ДНК. Результаты анализируются либо путем простого подсчета и сравнения полос или пиков в профиле TRFLP, либо путем сопоставления полос из одного или нескольких прогонов TRFLP с базой данных известных видов. Был разработан ряд различных программных инструментов для автоматизации процесса сопоставления диапазонов, сравнения и базирования данных профилей TRFLP. [ 2 ]
Этот метод в некоторых аспектах аналогичен электрофорезу в температурном градиенте или денатурирующем градиентном геле (TGGE и DGGE).
Изменения последовательности, непосредственно связанные с ПДРФ, также можно быстрее проанализировать с помощью ПЦР. Амплификация может быть направлена через измененный сайт рестрикции, и продукты расщепляются ферментом рестрикции. Этот метод получил название расщепленной амплифицированной полиморфной последовательности (CAPS). Альтернативно, амплифицированный сегмент можно проанализировать с помощью зондов аллель-специфических олигонуклеотидов (ASO), и этот процесс часто можно выполнить с помощью простого дот-блоттинга .
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Сайки, Р.; Шарф, С; Фалуна, Ф; Муллис, К.; Хорн, Г.; Эрлих, Х.; Арнгейм, Н. (1985). «Ферментативная амплификация геномных последовательностей бета-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии». Наука . 230 (4732): 1350–1354. Бибкод : 1985Sci...230.1350S . дои : 10.1126/science.2999980 . ISSN 0036-8075 . ПМИД 2999980 .
- ^ Херас, Дж.; Домингес, К.; Глаза, Э.; Паскаль, В.; Лозано, К.; Торрес, К.; Заразага, М. (29 марта 2015 г.). «Обзор инструментов для анализа отпечатков ДНК» . Брифинги по биоинформатике : bbv016. дои : 10.1093/нагрудник/bbv016 . ISSN 1467-5463 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]Молекулярная генетика : основные методы исследования | |
|---|---|
| Экспериментальный | |
| Биоинформатика | |
