Разделение in vitro
in vitro Компартментализация ( IVC ) — это технология на основе эмульсии клеточноподобные компартменты , которая создает in vitro . Эти отсеки устроены так, что каждый содержит не более одного гена . Когда ген транскрибируется и/или транслируется , его продукты ( РНК и/или белки ) оказываются «захваченными» кодирующим геном внутри компартмента. Путем объединения генотипа ( ДНК ) и фенотипа (РНК, белка) компартментализация позволяет осуществлять отбор и эволюцию фенотипа.
История
[ редактировать ]Метод компартментализации in vitro был впервые разработан Дэном Тауфиком и Эндрю Гриффитсом. [1] Основываясь на идее о том, что дарвиновская эволюция основана на связи генотипа с фенотипом, Тауфик и Гриффитс разработали водные отсеки эмульсий «вода в масле» (без масла), чтобы имитировать клеточные отсеки, которые могут связывать генотип и фенотип . Эмульсии клеточных компартментов образовывали путем добавления in vitro транскрипции / трансляции реакционной смеси к перемешанному минеральному маслу, содержащему поверхностно-активные вещества . По данным лазерной дифракции средний диаметр капель составил 2,6 мкм. В качестве доказательства концепции Тауфик и Гриффитс разработали селекционный эксперимент с использованием пула последовательностей ДНК, включая ген, кодирующий ДНК-метилтрансферазу HaeIII (M.HaeIII), в присутствии 10 7 -кратный избыток генов, кодирующих другой фермент folA. 3'-конец каждой последовательности ДНК был специально разработан так, чтобы содержать сайт узнавания HaeIII , который в присутствии экспрессируемой метилтрансферазы будет метилирован и, таким образом, устойчив к расщеплению рестриктазами. Отбирая последовательности ДНК, которые выдерживают расщепление эндонуклеазой, Тауфик и Гриффитс обнаружили, что гены M.HaeIII были обогащены по крайней мере в 1000 раз по сравнению с генами folA в течение первого раунда отбора.
Метод
[ редактировать ]
1) В in vivo системе библиотека генов трансформируется . в бактерии для производства вариантов белка и диспергируется в эмульсии «вода в масле» (w/o), стремясь к тому, чтобы каждая капля содержала максимум одну клетку
2) В системе in vitro клетки не используются, а вместо этого производятся варианты белков посредством in vitro транскрипции/трансляции с целью иметь один ген на каплю.
3,4) В обоих случаях капли затем ресуспендируют в воде для получения эмульсии вода-масло-в-воде (в/м/в), добавляют флюорогенный субстрат и пропускают перед лазером и детектором. в сортировщике клеток, активируемом флуоресценцией. Это приводит к тому, что гены, кодирующие активные варианты белка, изолируются, амплифицируются, секвенируются и используются для дальнейших раундов селекции или направленной эволюции. [2]
Эмульсионная технология
[ редактировать ]Эмульсии «вода в масле» (w/o) создаются путем смешивания водной и масляной фаз с помощью поверхностно-активных веществ. Типичная эмульсия IVC образуется путем сначала получения смеси масла и поверхностно-активного вещества путем перемешивания, а затем постепенного добавления водной фазы к смеси масла и поверхностно-активного вещества. смесь HLB (гидрофильно-липофильного баланса) и ПАВ с низким содержанием HLB. Для образования стабильной эмульсии необходима [3] Некоторыми комбинациями поверхностно-активных веществ, используемых для создания смеси масло-ПАВ, являются минеральное масло / 0,5% Твин 80 / 4,5% Спан 80 / дезоксихолат натрия. [1] и более термостабильный вариант, легкое минеральное масло/0,4% Твин 80 /4,5% Спан 80/0,05% Тритон Х-100 . [4] Водную фазу, содержащую компоненты транскрипции и/или трансляции, медленно добавляют к масляным поверхностно-активным веществам, а образование W/O облегчается путем гомогенизации, перемешивания или использования ручного экструдера.
Качество эмульсии можно определить с помощью световой микроскопии и/или методов динамического светорассеяния . Эмульсия весьма разнообразна, а более высокие скорости гомогенизации помогают получать капли меньшего размера с более узким распределением по размерам. Однако скорость гомогенизации необходимо контролировать, поскольку скорость более 13500 об/мин имеет тенденцию приводить к значительной потере активности фермента на уровне транскрипции. Наиболее широко используемое образование эмульсии дает капли средним диаметром 2-3 мкм и средним объемом ~5 фемтолитров, или 10 10 водная капля на мл эмульсии. [5] Соотношение генов и капель подобрано таким образом, чтобы большинство капель статистически содержало не более одного гена.
in vitro Транскрипция/трансляция
[ редактировать ]IVC позволяет миниатюризировать крупномасштабные методы, которые теперь можно реализовать в микромасштабе, включая in vitro по совместной транскрипции и трансляции эксперименты (IVTT). Оптимизация и интеграция транскрипции и трансляции позволяет быстро и легко контролировать экспериментальные планы. [6] [7] [8] IVTT можно проводить как в объемных эмульсиях, так и в микрокаплях, используя микрофлюидику на основе капель . Микрокапли, капли в масштабе от пико до фемтолитра, успешно используются в качестве сосудов из одной молекулы ДНК. [9] [10] Эта капельная технология обеспечивает высокопроизводительный анализ с множеством различных давлений отбора в одной экспериментальной установке. [6] [10] IVTT в микрокапельках предпочтительнее, когда сверхэкспрессия желаемого белка может быть токсичной для клетки-хозяина, сводя к минимуму полезность механизмов транскрипции и трансляции. [11]
IVC использовала экстракты бактериальных клеток, зародышей пшеницы и ретикулоцитов кролика (RRL) для транскрипции и трансляции. Также возможно использовать восстановленную бактериальную систему трансляции, такую как PURE, в которой компоненты трансляции очищаются индивидуально, а затем объединяются. При экспрессии эукариотических или сложных белков желательно использовать эукариотические системы трансляции, такие как экстракт зародышей пшеницы или более совершенную альтернативу - экстракт RRL. Чтобы использовать RRL для транскрипции и трансляции, нельзя использовать традиционную рецептуру эмульсии, поскольку она устраняет трансляцию. Вместо этого была разработана новая рецептура эмульсии: 4% Abil EM90/легкое минеральное масло, которая продемонстрировала свою функциональную способность экспрессировать люциферазу человека и теломеразу . [12]
Разрушение эмульсии и соединение генотипа и фенотипа
[ редактировать ]После завершения транскрипции и/или трансляции в каплях эмульсия будет разрушена последовательными этапами удаления минерального масла и поверхностно-активных веществ, чтобы обеспечить последующий отбор. На этом этапе крайне важно иметь метод «отслеживания» продуктов каждого гена до кодирующего гена, поскольку они свободно плавают в гетерогенной популяции молекул. Существует три основных подхода к отслеживанию каждого фенотипа до его генотипа. [13] Первый метод заключается в присоединении к каждой молекуле ДНК биотиновой группы и дополнительной кодирующей последовательности стрептавидина (СТАБИЛЬНЫЙ дисплей). [14] Все вновь образованные белки/пептиды будут слиты с молекулами стрептавидина и связываться с их биотинилированной кодирующей последовательностью. Улучшенная версия присоединяла две молекулы биотина к концам молекулы ДНК для увеличения авидности между молекулой ДНК и пептидами, слитыми со стрептавидином, и использовала синтетический ген стрептавидина с низким содержанием GC для повышения эффективности и специфичности во время ПЦР-амплификации. [15] Второй метод заключается в ковалентном соединении ДНК и белка. Были продемонстрированы две стратегии. Первый заключается в формировании слитых белков M.HaeIII. [16] Каждый экспрессируемый белок/полипептид будет слит с доменом ДНК-метилтрансферазы Hae III, который способен ковалентно связываться с фрагментами ДНК, содержащими последовательность 5'-GGC*-3', где C* представляет собой 5-фтор-2 дезоксицитидин. Вторая стратегия заключается в использовании мономерного мутанта фермента VirD2. [17] Когда белок/пептид экспрессируется в слиянии с белком VirD2 Agrobacterium, он связывается с его кодирующей последовательностью ДНК, которая имеет одноцепочечный выступ, содержащий последовательности узнавания Т-границы VirD2. Третий метод — связать фенотип и генотип с помощью бусинок. [18] Используемые гранулы будут покрыты стрептавидином, чтобы обеспечить связывание биотинилированной ДНК, кроме того, гранулы также будут отображать родственный партнер по связыванию с аффинной меткой , которая будет выражаться в слиянии с белком/пептидом.
Выбор
[ редактировать ]В зависимости от выбранного фенотипа будут использоваться стратегии отбора различий. Стратегию отбора можно разделить на три основные категории: отбор на связывание, отбор на катализ и отбор на регуляцию. [19] Выбираемый фенотип может варьироваться от РНК до пептида и белка. Путем отбора для связывания наиболее часто развивающимися фенотипами являются пептиды/белки, обладающие избирательным сродством к определенному антителу или молекуле ДНК. Примером может служить отбор белков, обладающих сродством к ДНК цинковых пальцев , проведенный Sepp et al. [20] Путем отбора каталитических белков/РНК обычно выделяют новые варианты с новыми или улучшенными ферментативными свойствами. Например, были отобраны новые варианты рибозимов с транслигазной активностью, которые продемонстрировали множественные обороты. [21] Путем отбора для регуляции можно выбрать ингибиторы ДНК-нуклеаз, такие как белковые ингибиторы колицин-ДНКазы Е7. [22]
Преимущества
[ редактировать ]По сравнению с другими технологиями отображения in vitro IVC имеет два основных преимущества. Первым преимуществом является его способность контролировать реакции внутри капель. Гидрофобные и гидрофильные компоненты можно доставлять в каждую каплю поэтапно, не нарушая химическую целостность капли, и, таким образом, контролируя, что и когда добавлять, можно контролировать реакцию в каждой капле. Кроме того, в зависимости от характера проводимой реакции можно также изменить pH каждой капли. Совсем недавно стали использовать фотоклеточные субстраты, и их участие в реакции регулировали фотоактивацией. [19] Второе преимущество заключается в том, что IVC позволяет выбирать каталитические молекулы. Например, Гриффитс и др. смог отобрать варианты фосфотриэстеразы с более высоким K cat путем определения образования и количества продукта с использованием антитела против продукта и проточной цитометрии соответственно. [23]
Связанные технологии
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Тауфик Д.С., Гриффитс А.Д. (июль 1998 г.). «Искусственные клеточные отсеки для молекулярной эволюции». Природная биотехнология . 16 (7): 652–6. дои : 10.1038/nbt0798-652 . ПМИД 9661199 . S2CID 25527137 .
- ^ Феррер М., Белоки А., Вьетес Х.М., Гуаззарони М.Е., Бергер И., Ахарони А. (январь 2009 г.). «Взаимодействие метагеномики и компартментализации in vitro» . Микробная биотехнология . 2 (1): 31–9. дои : 10.1111/j.1751-7915.2008.00057.x . ПМЦ 3815420 . ПМИД 21261880 .
- ^ Роте А., Сурджади Р.Н., Power BE (декабрь 2006 г.). «Новые белки в эмульсиях с использованием компартментализации in vitro». Тенденции в биотехнологии . 24 (12): 587–92. дои : 10.1016/j.tibtech.2006.10.007 . ПМИД 17055094 .
- ^ Гадесси Ф.Дж., Онг Дж.Л., Холлигер П. (апрель 2001 г.). «Направленная эволюция функции полимеразы путем разделенной саморепликации» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 98 (8): 4552–7. Бибкод : 2001PNAS...98.4552G . дои : 10.1073/pnas.071052198 . ПМК 31872 . ПМИД 11274352 .
- ^ Миллер О.Дж., Бернат К., Агрести Дж.Дж., Амитай Дж., Келли Б.Т., Мастробаттиста Э., Тали В., Магдасси С., Тауфик Д.С., Гриффитс А.Д. (июль 2006 г.). «Направленная эволюция путем компартментализации in vitro». Природные методы . 3 (7): 561–70. дои : 10.1038/nmeth897 . ПМИД 16791215 . S2CID 14125396 .
- ^ Jump up to: а б Кастро-Роа Д., Зенкин Н. (сентябрь 2015 г.). «Методология анализа транскрипции и трансляции в системах, связанных с транскрипцией-трансляцией in vitro» . Методы . 86 : 51–9. дои : 10.1016/j.ymeth.2015.05.029 . ПМИД 26080048 .
- ^ Люк Си Джей (февраль 2004 г.). «Производство серпинов с использованием быстрых систем транскрипции / трансляции in vitro». Методы . 32 (2): 191–8. дои : 10.1016/s1046-2023(03)00211-1 . ПМИД 14698632 .
- ^ Теберг А.Б., Куртуа Ф., Шаерли Ю., Фишлехнер М., Абелл С., Холлфельдер Ф., Хак В.Т. (август 2010 г.). «Микрокапли в микрофлюидике: развивающаяся платформа для открытий в химии и биологии» (PDF) . Ангеванде Хеми . 49 (34): 5846–68. дои : 10.1002/anie.200906653 . ПМИД 20572214 .
- ^ Кинцес Б., ван Влит Л.Д., Девениш С.Р., Холлфельдер Ф. (октябрь 2010 г.). «Микрофлюидные капли: новые интегрированные рабочие процессы для биологических экспериментов». Современное мнение в области химической биологии . 14 (5): 548–55. дои : 10.1016/j.cbpa.2010.08.013 . ПМИД 20869904 .
- ^ Jump up to: а б Куртуа Ф., Ольгин Л.Ф., Уайт Дж., Брэттон Д., Хак В.Т., Абелл С., Холлфельдер Ф. (февраль 2008 г.). «Интегрированное устройство для мониторинга зависящей от времени экспрессии in vitro отдельных генов в каплях пиколитра». ХимБиоХим . 9 (3): 439–46. дои : 10.1002/cbic.200700536 . ПМИД 18232037 . S2CID 8684268 .
- ^ Колин П.Ю., Зинченко А., Холлфельдер Ф. (август 2015 г.). «Ферментная инженерия в биомиметических отделениях» . Современное мнение в области структурной биологии . 33 : 42–51. дои : 10.1016/j.sbi.2015.06.001 . ПМИД 26311177 .
- ^ Гадесси Ф.Дж., Холлигер П. (март 2004 г.). «Новая эмульсионная смесь для компартментализации транскрипции и трансляции in vitro в системе ретикулоцитов кролика» . Белковая инженерия, проектирование и отбор . 17 (3): 201–4. дои : 10.1093/протеин/gzh025 . ПМИД 14990785 .
- ^ Лимхейс Х., Стейн В., Гриффитс А.Д., Холлфельдер Ф. (август 2005 г.). «Новые связи генотип-фенотип для направленной эволюции функциональных белков». Современное мнение в области структурной биологии . 15 (4): 472–8. дои : 10.1016/j.sbi.2005.07.006 . ПМИД 16043338 .
- ^ Ёнезава М., Дои Н., Хигасинакагава Т., Янагава Х. (март 2004 г.). «ДНК-дисплей биологически активных белков для селекции белков in vitro». Журнал биохимии . 135 (3): 285–8. дои : 10.1093/jb/mvh034 . ПМИД 15113826 .
- ^ Ёнезава М., Дои Н., Кавахаши Ю., Хигасинакагава Т., Янагава Х. (октябрь 2003 г.). «ДНК-дисплей для отбора разнообразных пептидных библиотек in vitro» . Исследования нуклеиновых кислот . 31 (19): 118д–118. дои : 10.1093/нар/gng119 . ПМК 206484 . ПМИД 14500846 .
- ^ Берчингер Дж., Нери Д. (сентябрь 2004 г.). «Ковалентный дисплей ДНК как новый инструмент направленной эволюции белков in vitro» . Белковая инженерия, проектирование и отбор . 17 (9): 699–707. дои : 10.1093/протеин/gzh082 . hdl : 20.500.11850/34052 . ПМИД 15522920 .
- ^ де Фигейредо П., Робертс Р.Л., Нестер Э.В. (октябрь 2004 г.). «DART: технология отображения полипептидов in vitro на основе ДНК». Протеомика . 4 (10): 3128–40. дои : 10.1002/pmic.200300842 . ПМИД 15378701 . S2CID 24348103 .
- ^ Норд О., Улен М., Нигрен П.А. (декабрь 2003 г.). «Отображение белков на микрогранулах путем бесклеточной экспрессии закрепленной ДНК». Журнал биотехнологии . 106 (1): 1–13. doi : 10.1016/j.jbiotec.2003.09.002 . ПМИД 14636705 .
- ^ Jump up to: а б Гриффитс А.Д., Тауфик Д.С. (сентябрь 2006 г.). «Миниатюризация лаборатории в каплях эмульсии». Тенденции в биотехнологии . 24 (9): 395–402. дои : 10.1016/j.tibtech.2006.06.009 . ПМИД 16843558 .
- ^ Сепп А., Чу Ю. (ноябрь 2005 г.). «Бесклеточный отбор ДНК-связывающих белков с цинковыми пальцами с использованием компартментализации in vitro». Журнал молекулярной биологии . 354 (2): 212–9. дои : 10.1016/j.jmb.2005.09.051 . ПМИД 16242713 .
- ^ Леви М., Грисволд К.Е., Эллингтон А.Д. (октябрь 2005 г.). «Прямой отбор транс-действующих лигазных рибозимов путем компартментализации in vitro» . РНК . 11 (10): 1555–62. дои : 10.1261/rna.2121705 . ПМЦ 1370839 . ПМИД 16131588 .
- ^ Бернат К., Магдасси С., Тауфик Д.С. (февраль 2005 г.). «Направленная эволюция белковых ингибиторов ДНК-нуклеаз путем компартментализации in vitro (IVC) и доставки нанокапель». Журнал молекулярной биологии . 345 (5): 1015–26. дои : 10.1016/j.jmb.2004.11.017 . ПМИД 15644201 .
- ^ Гриффитс А.Д., Тауфик Д.С. (январь 2003 г.). «Направленная эволюция чрезвычайно быстрой фосфотриэстеразы путем компартментализации in vitro» . Журнал ЭМБО . 22 (1): 24–35. дои : 10.1093/emboj/cdg014 . ПМК 140064 . ПМИД 12505981 .