Микрофлюидика на основе капель

Микрофлюидика на основе капель манипулирует дискретными объемами жидкостей в несмешивающихся фазах с низким числом Рейнольдса и режимами ламинарного потока . Интерес к системам микрофлюидики на основе капель существенно возрос за последние десятилетия. Микрокапли позволяют удобно обрабатывать миниатюрные объемы (мкл-фл) жидкостей, обеспечивают лучшее смешивание, инкапсуляцию, сортировку, измерение и подходят для экспериментов с высокой производительностью. Две несмешивающиеся фазы, используемые в системах на основе капель, называются непрерывной фазой (средой, в которой текут капли) и дисперсной фазой (капельной фазой).

Методы образования капель

Для того чтобы произошло образование капель, необходимо использовать две несмешивающиеся фазы, называемые непрерывной фазой (среда, в которой образуются капли) и дисперсной фазой (капельная фаза). Размер образующихся капель в основном контролируется соотношением расходов непрерывной фазы и дисперсной фазы, межфазным натяжением между двумя фазами и геометрией каналов, используемых для образования капель. Капли могут образовываться как пассивно, так и активно. При активном формировании капель (электрическом, магнитном, центробежном) часто используются устройства, аналогичные пассивному формированию, но для манипулирования каплями требуется подвод внешней энергии. Пассивное образование капель, как правило, встречается чаще, чем активное, поскольку оно дает аналогичные результаты при использовании более простых конструкций устройств. Как правило, для пассивной генерации капель используются три типа микрофлюидной геометрии: (i) поперечное течение, (ii) фокусировка потока и (iii) совместное течение. Микрофлюидика на основе капель часто работает при низких числах Рейнольдса, чтобы обеспечить ламинарный поток внутри системы. Размер капель часто определяют количественно с помощью коэффициента вариации (CV) как описания стандартного отклонения от среднего размера капель. Каждый из перечисленных методов обеспечивает способ создания микрофлюидных капель контролируемым и настраиваемым образом с правильным манипулированием переменными.

Поперечное образование капель

Формирование капель с помощью Т-образного соединения.

Формирование капель с помощью микрофлюидного устройства с Т-образным соединением. Отрыв капли происходит из-за падения давления при выходе капли.

Перекрестное течение — это метод пассивного формирования, в котором непрерывная и водная фазы движутся под углом друг к другу. Чаще всего каналы перпендикулярны в Т-образном соединении, при этом дисперсная фаза пересекает непрерывную фазу; возможны и другие конфигурации, такие как Y-образное соединение. Дисперсная фаза переходит в непрерывную и растягивается до тех пор, пока сдвиговые силы не оторвут каплю. В Т-образном соединении размер капель и скорость образования определяются соотношением скоростей потока и капиллярным числом . Капиллярное число связано с вязкостью непрерывной фазы, поверхностной скоростью непрерывной фазы и межфазным натяжением. Обычно скорость потока дисперсной фазы медленнее, чем скорость непрерывного потока. Формирование Т-образного соединения можно дополнительно применить путем добавления дополнительных каналов, создавая два Т-образных соединения в одном месте. Добавляя каналы, в одну и ту же точку можно добавлять разные дисперсные фазы для создания чередующихся капель разного состава. Размер капель, обычно более 10 мкм, ограничен размерами канала и часто образует капли с CV менее 2% и частотой до 7 кГц.

Формирование капель, фокусирующих поток

Формирование капель с помощью устройства фокусировки потока.

Схема устройства для формирования капель, фокусирующего поток, обычно используемого в микрофлюидных устройствах. Жидкость, поступающая слева, разбивается на капли маслом, поступающим сверху и снизу.

Добавление реагентов в два потока с использованием подхода фокусировки потока и плоского формата чипа.

Фокусирование потока — это, как правило, пассивный метод формирования, который включает в себя движение дисперсной фазы к сплошной фазе, обычно под углом (непараллельные потоки), а затем воздействие ограничения, создающего каплю. Это ограничение обычно представляет собой сужение канала для создания капли путем симметричного сдвига, за которым следует канал равной или большей ширины. Как и в случае с перекрестным течением, скорость потока непрерывной фазы обычно выше, чем скорость потока дисперсной фазы. Уменьшение расхода непрерывной фазы может увеличить размер капель. Фокусировка потока также может быть активным методом, при этом точка ограничения регулируется с помощью пневматических боковых камер, управляемых сжатым воздухом. Подвижные камеры сжимают поток, деформируя поток и создавая капли с изменяемой частотой возбуждения. Размер капель обычно составляет около нескольких сотен нанометров с коэффициентом вариации менее 3% и скоростью от нескольких сотен Гц до десятков кГц.

Спутниковое образование капель

Совместное течение — это метод пассивного образования капель, при котором канал дисперсной фазы заключен внутри канала непрерывной фазы. В конце канала дисперсной фазы жидкость растягивается до тех пор, пока она не разрушается под действием сдвиговых сил и не образует капли путем капания или струи. Капание происходит, когда в системе доминируют капиллярные силы и капли образуются в конечной точке канала. Выброс происходит за счет расширения или растяжения, когда непрерывная фаза движется медленнее, создавая поток из отверстия канала дисперсной фазы. В режиме расширения дисперсная фаза движется быстрее, чем непрерывная фаза, что приводит к замедлению дисперсной фазы, расширению капли и увеличению ее диаметра. В режиме растяжения преобладает вязкое сопротивление, заставляющее поток сужаться, образуя меньшую каплю. Влияние скорости потока непрерывной фазы на размер капель зависит от того, находится ли система в режиме растяжения или расширения, поэтому для прогнозирования размера капель необходимо использовать разные уравнения. Размер капель обычно составляет около нескольких сотен нанометров с CV менее 5% и частотой до десятков кГц.

Манипулирование каплями

Преимущества микрофлюидики можно масштабировать до более высокой пропускной способности, используя каналы большего размера, чтобы позволить большему количеству капель проходить, или за счет увеличения размера капель. Размер капель можно регулировать путем регулирования скорости потока непрерывной и дисперсной фаз, но размер капель ограничен необходимостью поддерживать концентрацию, расстояние между аналитами и стабильность микрокапель. Таким образом, увеличенный размер канала становится привлекательным благодаря возможности создавать и транспортировать большое количество капель. хотя дисперсия и стабильность капель стать проблемой. Наконец, необходимо тщательное перемешивание капель для воздействия как можно большего количества реагентов, чтобы обеспечить реакцию максимального количества исходных материалов. Этого можно добиться, используя ветреный канал для облегчения нестационарного ламинарного течения внутри капель.

ПАВ

Поверхностно-активное вещество стабилизирует границу раздела между непрерывной масляной фазой и водной каплей. Кроме того, поверхностно-активные вещества могут уменьшить прилипание капель воды к стенке канала за счет уменьшения поверхностного натяжения на границе раздела вода-нефть.

Поверхностно-активные вещества играют важную роль в капельной микрофлюидике. Основной целью использования поверхностно-активного вещества является снижение межфазного натяжения между дисперсной фазой (капельная фаза, обычно водная) и сплошной фазой (жидкость-носитель, обычно масло) путем адсорбции на границах раздела и предотвращения слипания капель друг с другом, тем самым стабилизируя капли в стабильном эмульсионном состоянии, что позволяет увеличить время хранения в линиях задержки, резервуарах или флаконах. Без использования поверхностно-активных веществ нестабильные эмульсии со временем разделятся на отдельные фазы, что приведет к снижению общей энергии системы. Химию поверхности нельзя игнорировать в микрофлюидике, поскольку межфазное натяжение становится основным фактором среди микромасштабных капель. Линас Мазутис и Эндрю Д. Гриффитс представили метод, в котором используются поверхностно-активные вещества для достижения избирательного и легко контролируемого слияния без внешних манипуляций. Они манипулируют временем контакта и покрытием поверхностно-активных веществ пары капель, чтобы контролировать слияние капель. Чем больше разница в процентном покрытии межфазного поверхностно-активного вещества между двумя каплями, тем менее вероятно, что произойдет слияние. Этот метод позволил исследователям по-другому добавлять реагенты в капли и дополнительно изучать эмульгирование.

Гидрофобные хвосты поверхностно-активного вещества сохраняют стабильность эмульсии и предотвращают слипание капель во время инкубации. Чем больше/длиннее гидрофобные хвосты, тем лучше биосовместимость и лучше растворимость в масляной фазе, а также тем лучше нерастворимость в водной фазе. <

Микрофлюидика широко используется для биохимических экспериментов, поэтому важно, чтобы поверхностно-активные вещества были биосовместимы при работе с живыми клетками и высокопроизводительном анализе. Поверхностно-активные вещества, используемые в устройствах для исследования живых клеток, не должны мешать биохимическим реакциям или клеточным функциям. Углеводородное масло обычно не используется в клеточных микрофлюидных исследованиях, поскольку оно несовместимо с клетками и повреждает их жизнеспособность. Углеводородное масло также извлекает органические молекулы из водной фазы. Однако, например, фторированные поверхностно-активные вещества с фторированными хвостами используются в качестве совместимого эмульгатора капель, который стабилизирует капли, содержащие клетки внутри, не повреждая и не изменяя клетки. Фторсодержащие поверхностно-активные вещества растворимы во фторированном масле (непрерывная фаза), но нерастворимы в водной фазе, что приводит к снижению межфазного натяжения вода-фтор. Например, поверхностно-активное вещество из триблок-сополимера, содержащее два хвоста перфторполиэфира (ПФПЭ) и блок-группу полиэтиленгликоля (ПЭГ), является фторсодержащим поверхностно-активным веществом с отличной биосовместимостью и превосходной стабильностью капель против коалесценции. Другим примером являются фторированные линейные полиглицерины, которые могут быть дополнительно функционализированы по их адаптированным боковым цепям и являются более адаптируемыми по сравнению с сополимером на основе ПЭГ. Поверхностно-активные вещества можно приобрести у многих химических компаний, таких как RainDance Technologies (теперь через BioRad). и Миллер-Стефенсон.

Физические соображения

Упрощенная визуализация изотермы адсорбции Гиббса, отображающая модель критической концентрации мицелл (слева). Упрощенная структура мицелл и везикул с диапазонами размеров (справа).

При добавлении поверхностно-активных веществ или неорганических солей В микрофлюидной системе на основе капель межфазное натяжение отдельных капель изменяется внутри микрофлюидной системы. Эти разделительные компоненты позволяют использовать капли в качестве микрореакторов для различных процедурных механизмов. Чтобы описать взаимосвязь между межфазным натяжением (), концентрацией диссоциированных поверхностно-активных веществ/солей в объемной капле ( C ), температурой ( T ), константой Больцмана ( k _B ) и концентрацией диссоциированных поверхностно-активных веществ/солей на границе раздела (Γ) была создана изотерма адсорбции Гиббса , упрощенный раздел с выделением соответствующей информации, отображаемой справа.

Эта изотерма подтверждает представление о том, что по мере увеличения концентрации неорганической соли соли удаляются из границы раздела капель (Γ<0), а межфазное натяжение капли увеличивается. Это контрастирует с поверхностно-активными веществами, которые адсорбируются на границе раздела (Γ>0), и более низким межфазным натяжением. . При низких концентрациях ПАВ поверхностное натяжение уменьшается в соответствии с изотермой адсорбции Гиббса до тех пор, пока не будет достигнута определенная концентрация, известная как критическая концентрация мицеллообразования (ККМ), когда мицеллы начинают образовываться. При достижении ККМ концентрация растворенного ПАВ достигает максимума, при котором мономеры ПАВ агрегируются с образованием мицелл нанометрового размера. Из-за этой возможности образования мицелл при анализе адсорбции поверхностно-активных веществ на границе раздела капель можно использовать три этапа. Сначала молекулы ПАВ адсорбируются между поверхностным слоем и подповерхностным слоем. Во-вторых, молекулы обмениваются между поверхностью и объемом раствора. В-третьих, мицеллы релаксируют, что вызвано нарушением равновесия между свободными молекулами и мицеллами.

Молекулы, составляющие каждую мицеллу, организованы в зависимости от раствора, в котором они суспендированы: более растворимые части контактируют с раствором, а менее растворимые части молекулы контактируют друг с другом. Было обнаружено, что в зависимости от соотношения объемов полярных головок и неполярного хвоста различные поверхностно-активные вещества образуют более крупные агрегаты, полые, двухслойные структуры, известные как везикулы . Известным поверхностно-активным веществом, способным образовывать везикулы, является АОТ (натриевая соль диоктилсульфосукцината). Эти мицеллы и везикулы являются относительно новым открытием; однако они использовались для транспортировки агентов внутри микрофлюидных систем, раскрывая будущие применения микрофлюидного транспорта.

Добавление реагента

Микромасштабные реакции, выполняемые в капельных приложениях, экономят реагенты и сокращают время реакции, и все это на килогерцовой частоте. Добавление реагентов в капельные микрореакторы было в центре внимания исследований из-за сложности достижения воспроизводимых добавлений со скоростью килогерца без загрязнения между каплями.

Совместный поток реагентов до образования капель

Реагенты можно добавлять во время образования капель за счет прямоточной геометрии. Потоки реагентов закачиваются в отдельные каналы и соединяются на границе раздела с каналом, содержащим непрерывную фазу, которая разделяется и создает капли, содержащие оба реагента. Изменяя скорость потока в каналах реагентов, можно контролировать соотношение реагентов в капле.

Слияние капель

Контролируемая электрокоалесценция двух капель. Меньшая капля течет быстрее, чем большая, догоняя большую каплю. При приложении электрического поля по мере прохождения пары капель через электроды капли сливаются.

Слияние капель различного содержания также можно использовать для добавления реагентов. Электрокоалесценция объединяет пары капель путем применения электрического поля для временной дестабилизации границы раздела капель для достижения воспроизводимого слияния капель в эмульсиях, стабилизированных поверхностно-активными веществами. Электрокоалесценция требует, чтобы капли (которые обычно разделены непрерывной фазой) вступили в контакт. Управляя размером капель в отдельных потоках, дифференциальный поток размеров капель может привести к контакту капель перед их слиянием.

Другим методом облегчения слияния капель является акустический пинцет. Пока капли текут в микрофлюидных каналах, их можно иммобилизовать с помощью акустического пинцета на основе поверхностных акустических волн . Как только капля удерживается акустическим пинцетом, последовательные капли сталкиваются с ней и происходит слияние.

В этом устройстве соединяются две капли. Столбы делят поток на три канала: две боковые ветви сверху и снизу и среднюю ветвь, по которой стекает вся слившаяся капля. Непрерывная фаза между соседними каплями эффективно отфильтровывается, позволяя течь через верхнюю и нижнюю ветви. Удаление непрерывной фазы между каплями облегчает их слияние.

Введение реагентов в существующие капли

Метод добавления реагента для пикоинъекции, показывающий добавление водной жидкости (Aq ₂ – темно-синий) к ранее образовавшимся каплям (Aq ₁ – светло-синий), протекающим через канал.

Методы совместного потока реагентов и слияния капель привязаны к процессам образования капель, которым не хватает гибкости в дальнейшем. Чтобы отделить добавление реагента от образования капель, используется установка, в которой поток реагента протекает через канал, перпендикулярный потоку капель. Затем инъецируемая капля сливается с пробкой при прохождении через канал. Объем реагента контролируется скоростью потока перпендикулярного канала реагента.

Первой проблемой для таких систем было то, что слияние капель реагента не было воспроизводимым для стабильных эмульсий. Адаптировав использование активированного электрического поля к этой геометрии, Abate et al. достигнут субпиколитровый контроль введения реагента. Этот подход, называемый пикоинъекцией, контролирует объем впрыска посредством давления потока реагента и скорости капель. Дальнейшая работа над этим методом была направлена ​​на уменьшение колебаний давления, затрудняющих воспроизводимые инъекции.

Впрыск водной жидкости под давлением происходит, когда электроды активируются, создавая электрическое поле, которое дестабилизирует границу раздела водная жидкость/нефть, вызывая впрыск. Ключевые преимущества пикоинъекции включают низкий непреднамеренный перенос материала между каплями и поддержание разделения капель посредством инъекции, однако электроды часто изготавливаются с использованием металлического припоя, что может усложнить конструкцию микрофлюидного устройства из-за увеличения времени изготовления в результате более сложной конструкции. . Альтернативный метод пикоинъекции включает использование реагента для инъекции в качестве проводника электрического поля, где напряжение, приложенное к жидкости, стимулирует инъекцию. Такой метод также позволяет лучше контролировать инжекцию, поскольку приложенное напряжение соответствует объему впрыскиваемой жидкости-реагента.

Загрязнение от капли к капле является проблемой многих методов инъекции. Чтобы бороться с этим, Дунан и др. разработали многофункциональный К-канал, по которому потоки реагентов проходят противоположно пути капельного потока. Используя интерфейс между двумя каналами, инъекция осуществляется аналогично пикоинъекции, но любые двусторонние загрязнения смываются непрерывным потоком реагента. Загрязнения можно избежать за счет потенциальной траты драгоценного реагента.

Капельная инкубация

Чтобы сделать микрофлюидику на основе капель жизнеспособным методом проведения химических реакций или работы с живыми клетками на микромасштабе, необходимо реализовать методы, позволяющие инкубировать капли. Химическим реакциям часто требуется время, чтобы произойти, и живым клеткам аналогичным образом требуется время для роста, размножения и осуществления метаболических процессов. Инкубация капель может осуществляться либо внутри самого устройства (на кристалле), либо снаружи (вне чипа), в зависимости от параметров системы. Инкубация вне чипа полезна при инкубации в течение суток или более или при инкубации миллионов капель одновременно. Инкубация на чипе позволяет объединить этапы манипулирования каплями и обнаружения в одном устройстве.

Внечиповая инкубация

Капли, содержащие клетки, можно хранить вне чипа в трубках из ПТФЭ до нескольких дней, сохраняя при этом жизнеспособность клеток и позволяя повторно вводить их в другое устройство для анализа. испарении жидкостей на водной и масляной основе при хранении капель в трубках из ПТФЭ, поэтому для хранения более нескольких дней также используются стеклянные капилляры. Сообщалось об Наконец, после формирования в микрофлюидном устройстве капли также можно направлять через систему капилляров и трубок, ведущих к шприцу. Капли можно инкубировать в шприце, а затем непосредственно вводить на другой чип для дальнейших манипуляций или обнаружения и анализа.

Инкубация на чипе

Встроенный резервуар предназначен для хранения капель для длительного хранения.

Линии задержки используются для инкубации капель на чипе. После образования капли могут попасть в змеевидный канал длиной до метра и более. Увеличение глубины и ширины канала линии задержки (по сравнению с каналами, используемыми для формирования и транспортировки капель) позволяет увеличить время инкубации при минимизации обратного давления в канале . Из-за большего размера канала капли заполняют канал линии задержки. и инкубируйте за время, необходимое каплям для прохождения этого канала.

Линии задержки изначально были разработаны для инкубации капель, содержащих смеси химических реакций, и могли достигать времени задержки до одного часа. В этих устройствах используются каналы линий задержки длиной в десятки сантиметров. Увеличение общей длины каналов линии задержки до одного или нескольких метров сделало возможным время инкубации 12 и более часов. Было показано, что линии задержки сохраняют стабильность капель до 3 дней. Жизнеспособность клеток была продемонстрирована с использованием встроенных линий задержки на срок до 12 часов. До разработки линий задержки инкубация на кристалле осуществлялась путем направления капель в большие резервуары (несколько миллиметров в длину и ширину), что обеспечивает высокую емкость хранения и меньшую сложность конструкции и эксплуатации устройства, если осуществляется точный временной контроль капель. не требуется.

Перемешивание путем хаотической адвекции в извилистом канале. По мере движения капель по извилистому каналу нестационарное течение жидкости вызывается вихрями, вращающимися как в одном, так и в противоположном направлении (см. вставку).

Если важно обеспечить равномерное распределение времени инкубации капель, канал линии задержки может содержать регулярно расположенные сужения. Капли, проходящие через канал одинакового диаметра, движутся с разной скоростью в зависимости от их радиального положения; капли ближе к центру канала движутся быстрее, чем капли у краев. Сужая ширину канала до доли его первоначального размера, капли с более высокими скоростями вынуждены уравновешиваться с более медленно движущимися каплями, поскольку сужение позволяет меньшему количеству капель проходить через него за раз. Другая манипуляция с геометрией канала линии задержки заключается в введении поворотов в траекторию капель. Это увеличивает степень смешивания любых реагентов, содержащихся в каплях, посредством хаотической адвекции . Для систем, требующих инкубации от 100 до 1000 капель, в канале линии задержки можно изготовить ловушки, в которых капли хранятся отдельно друг от друга. Это обеспечивает более точный контроль и мониторинг отдельных капель.

Магнитные капли

Микромагнитофлюидный метод представляет собой управление магнитными жидкостями с помощью приложенного магнитного поля на микрофлюидной платформе. предлагая беспроводное и программируемое управление магнитными каплями. Следовательно, магнитная сила также может использоваться для выполнения различных логических операций в дополнение к гидродинамической силе и силе поверхностного натяжения. Напряженность магнитного поля, тип магнитного поля (градиентное, однородное или вращающееся), магнитная восприимчивость, межфазное натяжение , скорости потока и соотношения скоростей потока определяют управление каплями на микромагнитофлюидной платформе.

Магнитные капли в контексте микрофлюидики на основе капель представляют собой капли размером в микролитр, которые либо состоят из феррожидкостей, либо содержат некоторый магнитный компонент, позволяющий манипулировать с помощью приложенного магнитного поля. Феррожидкости представляют собой гомогенные смеси коллоидных растворов магнитных наночастиц в жидком носителе. Два применения магнитных капель — это контроль и манипулирование микрожидкостными каплями в микросреде. а также изготовление, транспортировка и использование конструкций из наноматериалов в микрокаплях. Манипулирование магнитными каплями можно использовать для выполнения таких задач, как расположение капель в упорядоченный массив для исследований клеточных культур, а использование магнитных капель для изготовления наноструктур можно использовать в приложениях для доставки лекарств.

Магнитные капли в нетрадиционных системах

В традиционных микрофлюидных системах на основе капель, то есть капля в канале, содержащем несмешивающееся масло, которое разделяет капли, движение капель достигается за счет разницы в давлении или поверхностном натяжении. В нетрадиционных микрожидкостных системах на основе капель, таких как описанные здесь, для манипулирования каплями необходимы другие механизмы контроля. Применение магнитного поля к массиву микрожидкостей, содержащему магнитные капли, позволяет легко сортировать и располагать капли в полезные узоры и конфигурации. Эти типы манипуляций могут быть достигнуты посредством статического или динамического применения магнитного поля. что позволяет обеспечить высокую степень контроля над магнитными каплями. Характеристика степени контроля над магнитными каплями включает измерения магнитной восприимчивости феррожидкости, измерение изменения капли в области интерфейса подложки в присутствии приложенного магнитного поля и измерение «угла спада» или угол, под которым капля будет двигаться в присутствии магнитного поля, когда поверхность наклонена. Взаимодействием между каплей воды и поверхностью можно манипулировать, регулируя структуру самой микрофлюидной системы путем применения магнитного поля к поли[диметилсилоксану] (ПДМС), легированному железом, обычному материалу для микрофлюидных устройств.

В других системах, считающихся нетрадиционными микрофлюидными системами на основе капель, магнитные микрокапли могут быть простым средством производства и контроля микро- и наноматериалов, иногда называемых «роботами». Эти наноструктуры состоят из магнитных наночастиц в микрокаплях, которые с помощью приложенного магнитного поля преобразуются в определенные структуры. Микроспирали представляют собой многофункциональное применение этой технологии. Монодисперсные капли, содержащие магнитные наночастицы, генерируются и подвергаются воздействию магнитного поля, которое организует наночастицы в спиральную матрицу, которая изготавливается на месте посредством фотоиндуцированной полимеризации. Было показано, что эти микроспирали эффективны при очистке каналов, заблокированных полутвердыми соединениями жиров, масел и белков, например, тех, которые обнаружены в артериях. Было продемонстрировано, что микроспирали и кластеры микрочастиц в магнитных каплях являются средством транспорта для небольших (диаметром 500 мкм) микрочастиц, что также показано для применения в доставке лекарств. Несферические микроструктуры также были изготовлены с использованием магнитной микрофлюидики, что демонстрирует доступный минутный контроль. Среди несферических микроструктур, которые нужно было изготовить, были микрокапсулы из оксида графена, которые можно было аспирировать и надувать с помощью микропипетки, а также проявлять фото- и магнитореактивное поведение. Микрокапсулы, реагирующие на магнитные и фотостимулы, например, изготовленные из оксида графена, полезны для биомедицинских применений, требующих in vivo бесконтактных манипуляций с клеточными структурами, такими как стволовые клетки.

Сортировка капель

Сортировка капель в микрофлюидике является важным методом, позволяющим различать клетки на основе различных факторов, от размера капель до химических веществ, помеченных флуоресцентными метками внутри капли, что является результатом работы, проделанной по сортировке клеток в проточной цитометрии . В сфере сортировки капель существует два основных типа: массовая сортировка, в которой используются либо активные, либо пассивные методы, и точная сортировка, которая в основном опирается на активные методы. Массовая сортировка применяется к образцам с большим количеством капель (>2000 с). ⁻¹ ), которые можно сортировать на основе внутренних свойств капель (таких как вязкость, плотность и т. д.) без проверки каждой капли. С другой стороны, точная сортировка направлена ​​на отделение капель, соответствующих определенным критериям, которые проверяются на каждой капле.

Пассивная сортировка осуществляется посредством контроля конструкции микрофлюидного канала, что позволяет различать капли по размеру. Сортировка по размеру основана на раздвоенных соединениях в канале, которые отклоняют поток, что заставляет капли сортироваться в зависимости от того, как они взаимодействуют с поперечным сечением этого потока, скорости сдвига, которая напрямую связана с их размером. Другие пассивные методы включают инерцию и микрофильтрацию, каждый из которых связан с физическими свойствами, такими как инерция и плотность капли. При активной сортировке используются дополнительные устройства, прикрепленные к микрофлюидному устройству, для изменения пути капли во время потока путем управления некоторыми аспектами, включая термический, магнитный, пневматический, акустический, гидродинамический и электрический контроль. Эти элементы управления используются для сортировки капель в ответ на обнаружение некоторого сигнала от капель, например интенсивности флуоресценции.

Методы точной сортировки используют эти активные методы сортировки, сначала принимая решение (например, сигнал флуоресценции) о каплях, а затем изменяя их поток с помощью одного из вышеупомянутых методов. Был разработан метод под названием «Сортировка капель с флуоресцентной активацией» (FADS), в котором используется активная сортировка, индуцированная электрическим полем, с флуоресцентным обнаружением для сортировки до 2000 капель в секунду. Этот метод основан, помимо прочего, на ферментативной активности разделенных клеток-мишеней по активации флуорогенного субстрата внутри капли. При обнаружении флуоресцирующей капли включаются два электрода, прикладывающих к капле поле, которое смещает ее курс в канал отбора, в то время как нефлуоресцирующие капли перетекают через основной канал в отходы. В других методах используются другие критерии выбора, такие как поглощение или пропускание капель, количество инкапсулированных частиц или распознавание изображений формы клеток. Сортировку можно выполнить для повышения чистоты капсулирования, что является важным фактором при сборе проб для дальнейших экспериментов.

Ключевые приложения

Клеточная культура

Одним из ключевых преимуществ микрофлюидики на основе капель является возможность использовать капли в качестве инкубаторов для отдельных клеток.

Устройства, способные генерировать тысячи капель в секунду, открывают новые способы характеристики клеточных популяций не только на основе конкретного маркера, измеренного в определенный момент времени, но также на основе кинетического поведения клеток, такого как секреция белка, активность ферментов или пролиферация. Недавно был найден метод создания стационарного массива микроскопических капель для инкубации отдельных клеток, не требующий использования поверхностно-активного вещества .

Культура клеток с использованием капельной микрофлюидики

Микрофлюидные системы на основе капель предоставляют аналитическую платформу, которая позволяет изолировать отдельные клетки или группы клеток в каплях. Этот инструмент обеспечивает высокую производительность клеточных экспериментов, поскольку микрофлюидные системы на основе капель могут генерировать тысячи образцов (капель) в секунду. По сравнению с культурой клеток в обычных микротитровальных планшетах , микрокапли объемом от мкл до пл сокращают использование реагентов и клеток. Кроме того, автоматизированная обработка и непрерывная обработка позволяют проводить анализы более эффективно. Изолированная среда в инкапсулированной капле помогает анализировать каждую отдельную популяцию клеток. Высокопроизводительные эксперименты на клеточных культурах, например, тестирование поведения бактерий, поиск редких типов клеток, направленная эволюция, и клеточный скрининг подходят для использования капельных микрофлюидных методов.

Материалы, инкубация и жизнеспособность

Полидиметилсилоксан (ПДМС) является наиболее распространенным материалом для изготовления микрофлюидных устройств из-за низкой стоимости, простоты прототипирования и хорошей газопроницаемости. Наряду с перфторуглеродными маслами-носителями , которые также обеспечивают хорошую газопроницаемость и используются в качестве непрерывной фазы в капельной микрофлюидной системе для культуры клеток, некоторые исследования показали, что жизнеспособность клеток сравнима с культурой в колбах, например, клеток млекопитающих. Для достижения необходимого времени культивирования можно использовать резервуар или линию задержки. Использование резервуара позволяет осуществлять долговременное культивирование от нескольких часов до нескольких дней, тогда как линия задержки подходит для кратковременного культивирования в течение нескольких минут. Инкубация возможна как на кристалле (резервуар, соединенный с микрофлюидной системой, так и с линиями задержки). и вне чипа (трубки из ПТФЭ, изолированные микрофлюидной системой) после образования капель. После инкубации капли можно повторно ввести в микрофлюидное устройство для анализа. Существуют также специально разработанные системы хранения капель на кристалле для прямого анализа, такие как устройство «капля», которое хранит капли в нескольких камерах матрицы и использует сканер микрочипов для прямого анализа.

Проблемы

Культура клеток с использованием капельной микрофлюидики создала множество возможностей для исследований, которые недоступны на традиционных платформах, но также имеют множество проблем. Некоторые из проблем, связанных с культурой клеток в капельной микрофлюидике, являются общими для других систем микрофлюидного культивирования. Во-первых, потребление питательных веществ должно быть переоценено для конкретной микрожидкостной системы. Например, в микрофлюидных системах иногда увеличивается потребление глюкозы (в зависимости от типа клеток). Оборот среды иногда происходит быстрее, чем в макроскопической культуре, из-за меньших объемов культуры, поэтому объемы используемой среды необходимо регулировать в каждой клеточной линии и устройстве. Во-вторых, клеточная пролиферация и поведение могут различаться в зависимости от микрофлюидных систем, определяющим фактором является соотношение площади поверхности культуры к объему среды, которые варьируются от одного устройства к другому. В одном отчете было обнаружено, что пролиферация микроканалов нарушена; Увеличение количества глюкозы или добавок сыворотки не решило проблему в его конкретном случае. В-третьих, необходимо контролировать уровень pH. ПДМС более проницаем для CO _{2 ,} чем для O ₂ или N ₂ , поэтому уровень растворенного газа во время инкубации следует регулировать для достижения ожидаемого состояния pH.

Биологическая характеристика макромолекул

Кристаллизация белка

Устройства на основе капель также использовались для исследования условий, необходимых для кристаллизации белка.

Капельная ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) стала жизненно важным инструментом в геномике и биологии с момента ее создания, поскольку она значительно ускорила производство и анализ образцов ДНК для широкого спектра применений. Технологический прогресс в области микрокапельной ПЦР позволил создать устройство для одномолекулярной ПЦР на чипе. одиночной молекулы Ранняя репликация ДНК , включая то, что происходит при микрокапельной или эмульсионной ПЦР, была более сложной, чем крупномасштабная ПЦР, поэтому обычно использовались гораздо более высокие концентрации компонентов. Однако полностью оптимизированные условия свели к минимуму эту перегрузку, гарантируя, что отдельные молекулы имеют соответствующую концентрацию компонентов репликации, распределенных по всей реакционной ячейке. Микрофлюидная ПЦР без капель также сталкивается с проблемами абсорбции реагентов в каналы устройства, но системы на основе капель уменьшают эту проблему за счет уменьшения контакта с каналами.

Используя системы «вода в масле», капельная ПЦР работает путем сборки ингредиентов, формирования капель, объединения капель, термоциклирования и последующей обработки результатов, очень похожей на обычную ПЦР. Этот метод позволяет провести более 2 миллионов ПЦР-реакций в дополнение к 100 000-кратному увеличению обнаружения аллелей дикого типа по сравнению с мутантными аллелями . ПЦР на основе капель значительно увеличивает возможности мультиплексирования обычной ПЦР, позволяя быстро создавать библиотеки мутаций. Без корректуры репликация ДНК по своей сути в некоторой степени подвержена ошибкам, но за счет введения склонных к ошибкам полимераз капельная ПЦР использует более высокий, чем обычно, выход мутаций для более быстрого и эффективного создания библиотеки мутаций, чем обычно. Это делает капельную ПЦР более привлекательной, чем более медленная традиционная ПЦР. В аналогичном приложении была разработана высокомультиплексная микрокапельная ПЦР, которая позволяет проводить скрининг большого количества целевых последовательностей, что позволяет использовать такие приложения, как идентификация бактерий. ПЦР на чипе допускает мультиплексирование 15 x 15, что означает, что на одном устройстве можно одновременно запускать несколько целевых последовательностей ДНК. Такое мультиплексирование стало возможным благодаря иммобилизованным фрагментам ДНК-праймера, помещенным в основания отдельных лунок чипов.

Сочетание капельной ПЦР с устройствами на основе полидиметилсилоксана (ПДМС) позволило добиться новых усовершенствований капельной ПЦР, а также устранить некоторые ранее существовавшие проблемы капельной ПЦР, включая высокую потерю жидкости из-за испарения. ПЦР на основе капель очень чувствительна к пузырькам воздуха, поскольку они создают перепад температур, препятствующий репликации ДНК, а также вытесняют реагенты из камеры репликации. Теперь ПЦР на основе капель проводится в устройствах PDMS для переноса реагентов в капли через слой PDMS более контролируемым образом, который лучше поддерживает ход и стабильность репликации, чем традиционные клапаны. Недавнее устройство PDMS для капельной ПЦР позволило обеспечить более высокую точность и увеличение количества малых копий по сравнению с традиционными количественными экспериментами ПЦР. Такая более высокая точность была достигнута благодаря ПДМС, легированному поверхностно-активными веществами, а также конструкции устройства из сэндвич-стекла, ПДМС и стекла. Эти свойства устройства позволили более упростить затравку ДНК и уменьшить испарение воды во время цикла ПЦР.

секвенирование ДНК

использовались многочисленные микрофлюидные системы, в том числе системы на основе капель Для секвенирования ДНК .

Направленная эволюция

Направленная эволюция фермента фенотипа — это повторяющийся процесс создания случайных генетических мутаций, скрининга целевого и выбора наиболее устойчивого варианта (ов) для дальнейшей модификации. Способность человечества использовать направленную эволюцию для оптимизации ферментов в биотехнологических целях во многом ограничена производительностью инструментов и методов скрининга и простотой их использования. Из-за итеративного характера направленной эволюции и необходимости больших библиотек направленная эволюция на макроуровне может оказаться дорогостоящим мероприятием. Таким образом, проведение экспериментов на микроуровне с помощью микрофлюидики на основе капель обеспечивает значительно более дешевую альтернативу макроскопическим эквивалентам. Различные подходы оценивают направленную эволюцию с помощью капельной микрофлюидики менее чем в 40 долларов за экран из 10 изображений. ⁶ –10 ⁷ размер библиотеки генов, а стоимость соответствующего макромасштабного эксперимента составляет примерно 15 миллионов долларов. Кроме того, поскольку время скрининга варьируется от 300 до 2000 сортируемых капель в секунду, микрофлюидика на основе капель обеспечивает платформу для значительно ускоренного скрининга библиотек, так что генные библиотеки из 10 ⁷ можно хорошо отсортировать в течение дня. Микрофлюидные устройства на основе капель делают направленную эволюцию доступной и экономически эффективной.

Для направленной эволюции было разработано множество различных подходов к созданию микрофлюидных устройств на основе капель, чтобы иметь возможность проверять огромное количество различных белков, путей и геномов. Один из методов подачи библиотек в микрофлюидное устройство использует инкапсуляцию отдельных клеток, при которой капли содержат максимум одну клетку каждая. Это позволяет избежать противоречивых результатов, которые могут быть получены при наличии нескольких клеток и, следовательно, нескольких генотипов в одной капле, одновременно максимизируя эффективность потребления ресурсов. Этот метод позволяет обнаруживать секретируемые белки и белки на клеточной мембране. Добавление к каплям клеточного лизата , который разрушает клеточную мембрану, так что внутриклеточные вещества свободно доступны внутри капли, расширяет возможности метода инкапсуляции одиночных клеток для анализа внутриклеточных белков. Библиотеку также можно создать полностью in vitro (т.е. не в ее биологическом/клеточном контексте), так что содержимое капли представляет собой исключительно мутированную цепь ДНК. Система in vitro требует ПЦР и использования in vitro систем транскрипции и трансляции (IVTT) для генерации желаемого белка в капле для анализа. Сортировка капель для направленной эволюции в основном осуществляется путем обнаружения флуоресценции (например, сортировка капель, активируемая флуоресценцией (FADS)). однако недавние разработки в методах сортировки на основе поглощения, известные как сортировка капель, активируемая поглощением (AADS), расширили разнообразие субстратов, которые могут подвергаться направленной эволюции с помощью микрофлюидного устройства на основе капель. Недавно возможности сортировки даже расширились до обнаружения уровней НАДФН и стали использоваться для создания НАДФ-зависимых оксидоредуктаз с более высокой активностью . В конечном счете, потенциал различных методов создания и анализа капель в микрофлюидных устройствах на основе капель с направленной эволюцией допускает изменчивость, которая облегчает создание большой популяции потенциальных кандидатов для направленной эволюции.

Как метод белковой инженерии, направленная эволюция имеет множество применений в различных областях: от разработки лекарств и вакцин до синтеза продуктов питания и химикатов. Было разработано микрофлюидное устройство для идентификации улучшенных хозяев, производящих ферменты (т.е. клеточных фабрик), которые можно использовать в промышленности в различных областях. Искусственная альдолаза была дополнительно усилена в 30 раз с помощью капельной микрофлюидики, так что ее активность напоминала активность природных белков. Совсем недавно создание функциональных оксидаз стало возможным благодаря новому микрофлюидному устройству, созданному Дебоном и соавт. Микрофлюидный подход на основе капель к направленной эволюции имеет большой потенциал для разработки множества новых белков.

Последние достижения

С начала 2000-х годов достижения в области капельной микрофлюидики сделали ее мощным методом проведения кампаний направленной эволюции. За ранними разработками в массовом производстве одиночных эмульсий (SE; например, капли «вода в масле») и двойных эмульсий (DE; например, капли «вода в масле в воде») последовали инновации в области Формирование чипов и сортировка SE и DE, которые позволяют упростить и повысить производительность экспериментов по направленной эволюции микрофлюидных чипов.

Важным компонентом направленной эволюции является поддержание связи между ферментативными генотипами и фенотипами. Возможность формировать DE на чипе и впоследствии сортировать их с помощью сортировки клеток, активируемой флуоресценцией ( FACS ), продвинула эту область вперед. В 2013 году Ян и др. продемонстрировал использование FACS для сортировки DE. В 2014 г. Зинченко и др. опубликовали систему для составления монодисперсных DE, их сортировки и количественного анализа с использованием коммерчески доступного проточного цитометра. Авторы продемонстрировали мощь своей системы, обогатив активную арилсульфатазу дикого типа из популяций, содержащих 0,1% и 0,01% активных клеток, в 800-2500 раз соответственно. В 2016 году Ларсен и др. разработали систему оптической сортировки на основе флуоресценции для мониторинга активности полимераз внутри микрофлюидного устройства. Используя свою систему, Ларсен и его коллеги продемонстрировали примерно 1200-кратное обогащение сконструированной полимеразы. После одного раунда отбора полимеразы альфа-L-треофуранозил нуклеиновой кислоты (TNA) они продемонстрировали примерно 14-кратное улучшение активности и >99% правильное размещение остатков в растущем полипептиде. В 2017 г. С.С. Терехов с соавт. разработали монодисперсную микрофлюидную двойную эмульсионную сортировку «вода-масло-в-воде» (MDE), которую они объединили с FACS с последующей жидкостной хроматографией-масс-спектрометрией ( LC-MS ) и секвенированием нового поколения ( NGS ). Авторы продемонстрировали высокую чувствительность сортировки ферментативно активных дрожжевых клеток от неактивных с помощью флуоресценции. Кроме того, они продемонстрировали способность своей системы MDE-FACS исследовать взаимодействия между клетками-мишенями и эффекторными клетками внутри капель без вмешательства со стороны других дрожжевых и бактериальных клеток.

Вместо разработки новых платформ некоторые группы сосредоточились на оптимизации существующих методов, инструментов и платформ, чтобы упростить и повысить удобство их использования неспециалистами. В 2017 году Сукович и др. создала систему для производства монодисперсных или примерно одинаковых по размеру ДЭ, исключив процесс нанесения покрытия, необходимый для ДЭ-чипов. Различные группы изменили типы и концентрации поверхностно-активных веществ , чтобы упростить доставку реагентов в SE и DE. В 2018 году Ма и др. представили двухканальную микрожидкостную систему скрининга капель (DMDS). Система использует флуорогенные метки для сортировки SE по двум различным свойствам целевого фермента одновременно. Используя DMDS, Ма и его коллеги направили эволюцию высокоэнантиоселективной эстеразы, используя множество ферментативных свойств. В 2020 году Брауэр и др. продемонстрировали сортировку и изоляцию DE на чипе с последующей FACS, которая обеспечивает высокую производительность сортировки инкапсулированных клеток млекопитающих, из которых позже можно извлечь генетический материал.

Хотя флюорогенная маркировка является мощным инструментом для отслеживания и сортировки, она не всегда совместима с микрофлюидными системами на основе капель и экспериментальным дизайном. Недавно появились сообщения о новых методах обнаружения без меток и без флуоресценции. В 2016 году Гилен и др. опубликовали микрофлюидное устройство для сортировки капель, активируемое поглощением (AADS), и продемонстрировали его функциональность, направляя эволюцию фенилаланиндегидрогеназы. В 2016 году Сан и др. продемонстрировали использование капель SE и высокопроизводительного МС для скрининга активаторов и ингибиторов ферментов путем скрининга библиотеки трансаминаз. В 2019 году Пан и др. показали сортировку капель по межфазному натяжению, на которое влияет содержание капель. В 2020 году Хайдас и др. представили микрофлюидный подход, который использует как масс-спектрометрию с лазерной десорбцией и ионизацией с матрицей ( MALDI -MS), так и флуоресцентную микроскопию, которую авторы использовали для измерения концентрации и активности фитазы, соответственно, в дрожжевых клетках. В 2020 году Холланд-Мориц и др. опубликовали свой метод сортировки капель по массе (MADS), который объединяет MS-анализ с сортировкой капель, активируемой флуоресценцией (FADS). Используя этот метод, капли разделяются и анализируются отдельно как с помощью MS, так и с помощью FADS. Эффективность этого метода была продемонстрирована путем скрининга активности библиотеки трансаминаз, экспрессируемой in vitro .

Эксперты ожидают, что будущие инновации на основе микрофлюидики для кампаний направленной эволюции будут внедряться в коммерческое пространство, что приведет к появлению более простых и менее дорогих методов и инструментов, которые можно будет применять к биотехнологически значимым ферментам.

Химический синтез

на основе капель Микрофлюидика стала важным инструментом в химическом синтезе благодаря нескольким привлекательным особенностям. Микромасштабные реакции позволяют снизить затраты за счет использования небольших объемов реагентов, быстрых реакций порядка миллисекунд и эффективной теплопередачи, что приводит к экологическим преимуществам, когда количество энергии, потребляемой на единицу повышения температуры, может быть чрезвычайно небольшим. Степень контроля над местными условиями внутри устройств часто позволяет с высокой точностью выбирать один продукт перед другим. Высокая селективность по продукту и небольшие размеры реагентов и реакционной среды обеспечивают менее строгую очистку реакции и меньшую занимаемую площадь. Микродисперсные капли, созданные с помощью капельной химии, способны выступать в качестве среды, в которой происходят химические реакции, в качестве носителей реагентов в процессе создания сложных наноструктур . Капли также способны трансформироваться в клеточные структуры, которые можно использовать для имитации биологических компонентов и процессов человека.

В качестве метода химического синтеза капли в устройствах микрофлюидики действуют как отдельные реакционные камеры, защищенные от загрязнения в результате загрязнения устройства непрерывной фазой. Преимущества синтеза с использованием этого режима (по сравнению с периодическими процессами) включают высокую производительность , непрерывные эксперименты, низкий уровень отходов, портативность и высокую степень синтетического контроля. Некоторые примеры возможных синтезов - создание полупроводниковых микросфер. и наночастицы . В устройство встроено химическое обнаружение, обеспечивающее тщательный мониторинг реакций, ЯМР- спектроскопия, микроскопия , электрохимическое обнаружение и хемилюминесцентное используются обнаружение. Часто измерения проводятся в разных точках микрофлюидного устройства, чтобы контролировать ход реакции.

Повышенная скорость реакций с использованием микрокапель наблюдается в альдольной реакции эфиров силиленола и альдегидов . Используя микрофлюидное устройство на основе капель , время реакции было сокращено до двадцати минут по сравнению с двадцатью четырьмя часами, необходимыми для периодического процесса. Другие экспериментаторы смогли продемонстрировать высокую селективность цистильбена - по отношению к термодинамически предпочтительному транс стильбену по сравнению с периодической реакцией, показывая высокую степень контроля, обеспечиваемую каплями микрореактора. Этот стереоконтроль выгоден фармацевтической промышленности. Например, L- метотрексат , препарат, используемый в химиотерапии, усваивается легче, чем D- изомер .

Жидкокристаллические микрокапсулы

Изготовление жидких кристаллов было предметом интриги на протяжении более пяти десятилетий. из-за их анизотропных свойств. Микрофлюидные устройства можно использовать для синтеза ограниченных холестерических жидких кристаллов путем наслаивания множества оболочечных слоев, состоящих из различных эмульсий масло в воде и вода в масле. Создание инкапсулированных жидких кристаллов посредством микрофлюидного потока капель жидких кристаллов в несмешивающемся масле позволяет добиться толщины и состава монодисперсного слоя эмульсии, ранее невиданных до появления микрофлюидных технологий. Появление технологии жидких кристаллов привело к развитию оптических дисплеев, используемых как в исследованиях, так и в потребительских продуктах, но более поздние открытия открыли двери для сочетания фотонной комбинации и ап-конверсии, а также для оптических датчиков для биологических аналитов.

Синтез микрочастиц и наночастиц

Усовершенствованные частицы и материалы на их основе, такие как полимерные частицы, микрокапсулы , нанокристаллы и фотонные кристаллические кластеры или шарики, могут быть синтезированы с помощью капельной микрофлюидики. Наночастицы , такие как коллоидный CdS и наночастицы ядро-оболочка CdS/CdSe, также могут быть синтезированы в несколько этапов в миллисекундном масштабе времени в микрожидкостной системе на основе капель.

Наночастицы, микрочастицы и коллоидные кластеры в микрофлюидных устройствах полезны для таких функций, как доставка лекарств. Первыми частицами, включенными в системы на основе капель, были силикагели размером микрометра, чтобы проверить их применение в производстве дисплеев и оптических покрытий. Смешивание твердых частиц с водными микрокаплями требует изменений в микрофлюидных каналах, таких как дополнительные смеси реагентов и выбор конкретных материалов, таких как кремнезем или полимеры, которые не мешают каналам и любым биологически активным веществам, содержащимся в каплях.

Синтез сополимеров требует измельчения макроскопических молекул до микрочастиц с пористой, неровной поверхностью с использованием органических растворителей и методов эмульгирования. Эти капли, предварительно загруженные микрочастицами, также можно быстро обработать с помощью УФ-облучения. Характеристика этих микрочастиц и наночастиц включает в себя микровизуализацию для анализа структуры и идентификации измельчаемого макроскопического материала. Такие методы, как контролируемая инкапсуляция отдельных пузырьков газа для создания полых наночастиц для синтеза микропузырьков с определенным содержимым, жизненно важны для систем доставки лекарств. Микрочастицы на основе кремнезема и титана используются в качестве прочных оболочек после использования газа для увеличения скорости течения водной фазы. Более высокая скорость потока позволяет лучше контролировать толщину водных оболочек. Растущую универсальность наночастиц можно увидеть в доставке загруженных частицами микрокапель, которые используются в депо-инъекциях для доставки лекарств, а не в типичном подходе, заключающемся в внутривенном введении лекарств . Это возможно благодаря небольшой толщине оболочек, которая обычно находится в диапазоне от 1 до 50 мкм.

Более поздние достижения в области микрофлюидных частиц позволили синтезировать частицы нанометрового размера из полимеров биологического происхождения. Используя специальные многофазные конструкции, фокусирующие поток, которые контролируют скорость потока и температуру, можно контролировать размер образующихся наночастиц, а также концентрацию и конфигурацию капель. Другой метод создания микрокапель, наполненных частицами, — это использование наночастиц липид-гидрогеля, из которых можно создавать капли более узкой формы, что полезно, когда необходимо использовать мягкие или хрупкие материалы. Эти мягкие материалы особенно важны при производстве порошков . Последние достижения в наномасштабе, такие как устройства, которые производят как сферические, так и несферические капли, которые сверхбыстро и гомогенно смешиваются, производятся для крупномасштабного производства порошкообразных частиц в промышленных целях.

Монодисперсные наночастицы также представляют большой интерес для изготовления катализаторов . Эффективность многих гетерогенных каталитических систем зависит от высокой площади поверхности частиц переходных металлов. Микрофлюидные методы использовались для изготовления наночастиц золота посредством межфазного взаимодействия капель, содержащих хлорид золота, гексан и восстановитель, с окружающей водной фазой. Этот процесс также позволяет контролировать размер и форму наночастиц/нанолистов с точностью и высокой производительностью. по сравнению с другими методами, такими как физическое осаждение из паровой фазы .

Было показано, что использование капель, содержащих различные материалы, такие как кремнезем или переходные металлы, такие как золото, протекающих через несмешивающуюся масляную фазу, эффективно контролирует как размер наночастиц, так и размер пор, что позволяет создавать эффективные абсорбирующие устройства для улавливания газа. и гетерогенные катализаторы. Монодисперсные наночастицы золота и серебра были синтезированы с использованием капель хлоридов золота и серебра, в которые добавлен восстановитель для расщепления связей металл-лиганд, что приводит к агломерации монодисперсных наночастиц металлов, которые можно легко отфильтровать из раствора.    

Синтез частиц геля

Синтез гелевых частиц, также известных как гидрогели, микрогели и наногели, в течение последних нескольких десятилетий был областью интереса как для исследователей, так и для промышленности. Микрофлюидный подход к синтезу этих частиц гидрогеля является полезным инструментом благодаря высокой производительности, монодисперсности частиц и снижению затрат за счет использования небольших объемов реагентов. Одной из ключевых проблем на ранних этапах разработки гелей было формирование монодисперсных частиц. Первоначально методы, основанные на полимеризации, использовались для формирования объемных микрочастиц полидисперсного размера. Эти методы обычно были сосредоточены на использовании водного раствора, который энергично перемешивали для создания эмульсий. В конце концов была разработана методика создания монодисперсных биоразлагаемых микрогелей путем создания эмульсий М/В в поточном канале для генерации капель. Такая геометрия соединения в сочетании с непрерывной фазой, насыщенной поверхностно-активными веществами, способствовала созданию микрогелей из полидекс-ГЭМА. Другие геометрии устройств, включая Т-образное соединение, также являются жизнеспособными и используются для изготовления гелей на основе диоксида кремния.

Как только эти методы были созданы, усилия были сосредоточены на применении функциональности к этим частицам. Примеры включают частицы, инкапсулированные бактериями, частицы, инкапсулированные лекарственным средством или белком, и частицы магнитного геля. Вставить эти функциональные компоненты в структуру геля может быть так же просто, как интегрировать компонент в дисперсную фазу. В некоторых случаях предпочтительна определенная геометрия устройства, например, соединение, фокусирующее поток, использовалось для инкапсуляции бактерий в микрочастицы агарозы. Множественные эмульсии представляют интерес для фармацевтических и косметических применений. и формируются с использованием двух последовательных переходов, фокусирующих поток. Также можно синтезировать более сложные частицы, такие как частицы Януса, которые имеют поверхности с двумя или более различными физическими свойствами.

Некоторые примеры растущего применения гелевых частиц включают доставку лекарств, биомедицинские применения и тканевую инженерию, и многие из этих приложений требуют монодисперсных частиц, где предпочтительным является подход, основанный на микрофлюидике. Однако методы объемного эмульгирования по-прежнему актуальны, поскольку не для всех применений требуются однородные микрочастицы. Будущее микрофлюидного синтеза гелей может заключаться в разработке методов создания больших количеств этих однородных частиц, чтобы сделать их более коммерчески/промышленно доступными.

Недавние разработки в области капельной микрофлюидики также позволили синтезировать in situ гидрогелевые волокна, содержащие капли воды с контролируемой морфологией. Гидрогелевые волокна представляют собой интригующий вариант биосовместимого материала для доставки лекарств и биопечати материалов, которые могут имитировать поведение внеклеточного матрикса. Этот микрофлюидный метод отличается от традиционного способа синтеза с мокрым прядением за счет использования водных капель в потоке несмешивающегося масла, а не экструзии объемного раствора того же состава, смешанного за пределами объекта. Возможность контролировать размер, скорость потока и состав капель дает возможность точно настроить морфологию волокон в соответствии с конкретным использованием в биоанализе и имитации анатомических функций.  

Экстракция и фазовый перенос с использованием капельной микрофлюидики

Жидкостно-жидкостная экстракция — это метод отделения аналита от сложной смеси; с помощью этого метода соединения разделяются на основе их относительной растворимости в различных несмешивающихся жидких фазах. Чтобы преодолеть некоторые недостатки, связанные с обычными настольными методами, такими как метод встряхивания колбы, Были использованы методы микрофлюидной жидкостно-жидкостной экстракции. Микрофлюидные капельные системы продемонстрировали способность манипулировать дискретными объемами жидкостей в несмешивающихся фазах с низкими числами Рейнольдса. и ламинарный режимы течения. Микромасштабные методы сокращают необходимое время, уменьшают объем проб и реагентов, а также обеспечивают автоматизацию и интеграцию. В некоторых исследованиях эффективность капельной микрофлюидной экстракции близко сравнивается с методом встряхивания. Исследование, в котором сравнивались методы экстракции встряхиваемой колбы и микрофлюидной жидкости-жидкости для 26 соединений и обнаружено тесная корреляция между полученными значениями (R2 = 0,994).

Также было продемонстрировано, что микрофлюидные устройства жидкостно-жидкостной экстракции можно интегрировать с другими приборами для обнаружения экстрагированных аналитов. Например, микрофлюидную экстракцию можно использовать для экстрагирования аналита первоначально в водной фазе, например кокаина, в слюне, а затем для его обнаружения с помощью встроенной ИК-спектроскопии. Микрофлюидная жидкостно-жидкостная экстракция показала свои преимущества во многих приложениях, таких как исследования фармакокинетики лекарств, где необходимы только небольшие количества клеток. и в дополнительных исследованиях, где требуются меньшие объемы реагентов.

Обнаружение капель

Методы разделения

Микрофлюидные системы на основе капель можно сочетать с методами разделения для решения конкретных задач. Общие методы разделения в сочетании с микрофлюидными системами на основе капель включают высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и электрофорез .

Высокоэффективная жидкостная хроматография

Многие формы хроматографии, включая высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), сверхэффективную жидкостную хроматографию нанопотоков (нано-УЭЖХ или нано-ЖХ) и двумерную капиллярную проточную хроматографию (капиллярная ВЭЖХ), были интегрированы в область капельная микрофлюидика. На микроуровне методы химического разделения, такие как ВЭЖХ, могут использоваться как в биологическом, так и в химическом анализе. В области микрофлюидики эти методы применялись к микрофлюидным системам на трех различных стадиях микрофлюидного процесса. Колонки внечиповой ВЭЖХ используются для разделения аналитов перед подачей их в микрофлюидное устройство для фракционирования и анализа. Колонки ВЭЖХ также могут быть встроены непосредственно в микрофлюидные лабораторные чипы, создавая монолитные гибридные устройства, способные к химическому разделению, а также к образованию капель и манипулированию ими. Кроме того, ВЭЖХ используется на завершающей стадии капельной микрофлюидной химии как способ очистки, анализа и количественной оценки продуктов эксперимента.

Микрофлюидные устройства на основе капель, соединенные с ВЭЖХ, обладают высокой чувствительностью обнаружения, используют малые объемы реагентов, имеют короткое время анализа и минимальное перекрестное загрязнение аналитов, что делает их эффективными во многих аспектах. Однако все еще существуют проблемы, связанные с микрохроматографией, такие как дисперсия разделенных полос, диффузия и «мертвый объем» в каналах после разделения. Одним из способов обойти эти проблемы является использование капель для разделения полос разделения, что предотвращает диффузию и потерю разделенных аналитов. В ранних попытках интегрировать хроматографию с капельной микрофлюидикой более низкие скорости потока и давления, необходимые для двумерной капиллярной ЖХ, создавали меньше препятствий для преодоления при объединении этих технологий и позволяли объединить несколько методов двумерного разделения в одном устройстве ( т.е. ВЭЖХ× ЖХ , ЖХ×ЖХ и ВЭЖХ×ВЭЖХ). ВЭЖХ, Автосамплеры подающие в микрофлюидные устройства, воспользовались преимуществами дисперсии , возникающей между разделением и образованием капель, для подачи градиентных импульсов аналитов в микрофлюидные устройства, где производство тысяч пиколитровых капель фиксирует уникальные концентрации аналита. В аналогичных подходах использовались возможности извлечения шприцевого насоса для согласования относительно высоких скоростей потока, необходимых для ВЭЖХ, с более низкими скоростями потока непрерывной среды, обычными для микрофлюидных устройств. Разработка нано-ЖХ или нано-УЭЖХ предоставила еще одну возможность объединения с микрофлюидными устройствами, благодаря чему можно формировать большие библиотеки капель с несколькими измерениями информации, хранящейся в каждой капле. Вместо идентификации пиков и хранения их как одного образца, как это происходит в стандартной ЖХ, эти библиотеки капель позволяют сохранять определенную концентрацию аналита вместе с его идентичностью. Более того, возможность выполнять высокочастотное фракционирование непосредственно из элюента колонки нано-ЖХ значительно увеличивает разрешение пиков и улучшает общее качество разделения по сравнению с устройствами нано-ЖХ с непрерывным потоком.

Колонка ВЭЖХ была впервые встроена непосредственно в микрофлюидное устройство с использованием ТПЭ вместо ПДМС для изготовления устройства. Дополнительная прочность ТПЭ позволила ему выдерживать более высокие давления, необходимые для ВЭЖХ, так что один микрофлюидный лабораторный чип мог выполнять химическое разделение, фракционирование и дальнейшие манипуляции с каплями. Чтобы повысить качество хроматографических результатов, более прочные устройства из стекла продемонстрировали способность выдерживать гораздо большее давление, чем ТПЭ. Достижение этих более высоких давлений для увеличения степени разделения и устранения всех мертвых объемов за счет немедленного образования капель показало потенциал капельной микрофлюидики для расширения и улучшения возможностей разделения с помощью ВЭЖХ.

Электрофорез

Капиллярный электрофорез (КЭ) и микрокапиллярный гель-электрофорез (μCGE) являются широко признанными методами микрочипового электрофореза (MCE), которые могут обеспечить многочисленные аналитические преимущества, включая высокое разрешение, высокую чувствительность и эффективное сочетание с масс-спектрометрией (МС). Электрофорез микрочипов обычно можно применять как метод высокопроизводительных процессов скрининга, которые помогают обнаруживать и оценивать лекарства. Используя MCE, в частности CE, создаются устройства для микрокапиллярного гель-электрофореза (μCGE) для обработки большого количества образцов ДНК, что делает его хорошим кандидатом для анализа ДНК. Устройства μCGE также практичны для целей разделения, поскольку они используют онлайн-разделение, определение характеристик, инкапсуляцию и выбор различных аналитов, полученных из составного образца. Все эти преимущества методов MCE применимы и к микрофлюидным устройствам. Причина, по которой методы MCE сочетаются с микрофлюидными устройствами на основе капель, заключается в возможности анализировать образцы в нанолитровом масштабе. Использование методов MCE в небольших масштабах снижает затраты и использование реагентов. Подобно ВЭЖХ, для капиллярного электрофореза используются методы обнаружения на основе флуоресценции, что делает эти методы практичными и может применяться в таких областях, как биотехнология, аналитическая химия и разработка лекарств. Эти MCE и другие методы, основанные на электрофорезе, начали развиваться после того, как капиллярный электрофорез приобрел популярность в 1980-х годах и привлек еще больше внимания в начале 1990-х годов, поскольку к 1992 году он был рассмотрен почти 80 раз.

Масс-спектрометрия (МС) — это практически универсальный метод обнаружения, признанный во всем мире золотым стандартом идентификации многих соединений. МС — это аналитический метод, при котором химические соединения ионизируются и сортируются перед обнаружением, а полученный масс-спектр используется для идентификации родительских молекул ионов. Это делает МС, в отличие от других методов обнаружения (таких как флуоресценция), свободным от меток; т.е. нет необходимости связывать дополнительные лиганды или группы с интересующей молекулой, чтобы получить сигнал и идентифицировать соединение.

Масс-спектрометрия

Масс-спектрометрия (МС) — это практически универсальный метод обнаружения, признанный во всем мире золотым стандартом идентификации многих соединений. МС — это аналитический метод, при котором химические соединения ионизируются и сортируются перед обнаружением, а полученный масс-спектр используется для идентификации родительских молекул ионов. Это делает МС, в отличие от других методов обнаружения (таких как флуоресценция ), свободным от меток; т.е. нет необходимости связывать дополнительные лиганды или группы с интересующей молекулой, чтобы получить сигнал и идентифицировать соединение.

Во многих случаях другие спектроскопические методы, такие как ядерный магнитный резонанс ( ЯМР ), флуоресценция , инфракрасное излучение или комбинационное рассеяние света , нежизнеспособны в качестве отдельных методов из-за особого химического состава капель. Часто эти капли чувствительны к флуоресцентным меткам . или содержат виды, которые в остальном неопределенно схожи, где МС может использоваться вместе с другими методами для характеристики конкретного представляющего интерес аналита. Однако МС лишь недавно (за последнее десятилетие) приобрел популярность как метод обнаружения для капельной микрофлюидики (и микрофлюидики в целом) из-за проблем, связанных с соединением масс-спектрометров с этими миниатюрными устройствами. Сложность разделения/очистки делает полностью микрофлюидные системы, соединенные с масс-спектрометрией, идеальными в области протеомики, кинетика ферментов, открытие лекарств, и скрининг заболеваний новорожденных. Двумя основными методами ионизации для массового анализа, используемыми сегодня в капельной микрофлюидике, являются матричная лазерная десорбция/ионизация ( MALDI ). и ионизация электрораспылением ( ESI ). Дополнительные методы связи, такие как (но не ограничиваясь ими) распыление поверхностных акустических волн ( SAWN ), и ионизация распылением бумаги на миниатюрный МС, также разрабатываются.

Ионизация электрораспылением

Одна из сложностей, возникающих при сочетании МС с микрофлюидикой на основе капель, заключается в том, что дисперсные образцы производятся при сравнительно низких скоростях потока по сравнению с традиционными методами МС-инъекции. ESI способен легко справляться с такими низкими скоростями потока и в настоящее время широко используется для оперативного микрофлюидного анализа. ESI и MALDI предлагают высокопроизводительный ответ на проблему обнаружения капель без меток, но ESI требует менее интенсивной подготовки проб и элементов изготовления, которые можно масштабировать до масштабов микрофлюидных устройств. ESI включает в себя приложение высокого напряжения к несущему потоку капель, содержащих анализируемое вещество, которое распыляет поток с последующим обнаружением в потенциально-дифференцированной области анализатора. Жидкость-носитель внутри капельного микрофлюидного устройства, обычно масло, часто является препятствием для ESI. Масло, когда часть потока капель попадает в прибор ESI-MS, может вызвать постоянное фоновое напряжение, мешающее обнаружению капель образца. Эти фоновые помехи можно устранить, заменив масло, используемое в качестве жидкости-носителя, и отрегулировав напряжение, используемое для электрораспыления.

Размер капель, форму конуса Тейлора и скорость потока можно контролировать, изменяя разность потенциалов и температуру высушивающего (для испарения растворителя, окружающего анализируемое вещество) потока газа (обычно азота). Поскольку ESI позволяет обнаруживать капли в режиме онлайн, могут быть решены и другие проблемы, возникающие при использовании сегментированных или внечиповых систем обнаружения, например, минимизация разбавления образца (капель), что особенно важно для микрофлюидного обнаружения капель, когда образцы аналита уже разбавлены до самая низкая экспериментально значимая концентрация.

Лазерная десорбция/ионизация с помощью матрицы

Типичным примером MALDI является использование ультрафиолетового ( УФ ) лазера для запуска абляции аналитов, смешанных с матрицей кристаллизованных молекул с высоким оптическим поглощением. Ионы в полученных аблированных газах затем протонируются или депротонируются перед ускорением в масс-спектрометре. Основные преимущества обнаружения MALDI перед ESI в микрофлюидных устройствах заключаются в том, что MALDI позволяет значительно упростить мультиплексирование . устройства что еще больше увеличивает общую пропускную способность , а также меньшая зависимость от движущихся частей и отсутствие проблем стабильности конуса Тейлора, возникающих из-за скоростей потока в микрофлюидном масштабе. Скорость обнаружения MALDI, а также масштаб микрожидкостных капель позволяют улучшить методы макромасштаба как в пропускной способности, так и в разрешении времени пролета ( TOF ). В то время как типичные установки МС-детектирования часто используют методы разделения, такие как хроматография, установки MALDI требуют, чтобы перед обнаружением достаточно очищенный образец был смешан с заранее определенными органическими матрицами, подходящими для конкретного образца. Состав матрицы MALDI должен быть настроен для обеспечения соответствующей фрагментации и абляции аналитов.

Одним из методов получения очищенного образца с помощью капельной микрофлюидики является завершение микрофлюидного канала на пластине MALDI, при этом водные капли образуются на гидрофильных участках пластины. Затем растворителю и жидкости-носителю дают испариться, оставляя после себя только высушенные капли интересующего образца, после чего на высушенные капли наносят матрицу MALDI. Такая подготовка проб имеет заметные ограничения и сложности, которые в настоящее время преодолены не для всех типов проб. Кроме того, матрицы MALDI предпочтительно имеют гораздо более высокие концентрации, чем образец аналита, что позволяет включить микрофлюидную транспортировку капель в онлайн-производство матриц MALDI. Из-за небольшого количества известных матриц и метода проб и ошибок нахождения подходящих новых матричных композиций, это может быть определяющим фактором при использовании других форм спектроскопии вместо MALDI.

Рамановская спектроскопия

Рамановская спектроскопия — это спектроскопический метод, который обеспечивает неразрушающий анализ, позволяющий идентифицировать компоненты в смесях с химической специфичностью без сложной подготовки проб. Рамановская спектроскопия основана на рассеянии фотонов системы после излучения видимого света, где сдвиг энергии фотонов соответствует информации о колебательных модах и их частотах. После получения модных частот колебаний можно как сделать, так и подкрепить качественную классификацию системы.

Рамановская спектроскопия хорошо работает параллельно с микрофлюидными устройствами для многих качественных биологических приложений. Для некоторых применений рамановская спектроскопия предпочтительнее других методов обнаружения, таких как инфракрасная (ИК) спектроскопия, поскольку вода имеет сильный интерференционный сигнал с ИК-диапазоном, но не с рамановским. Аналогично, такие методы, как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), ядерный магнитный резонанс (ЯМР), масс-спектрометрия (МС) или газовая хроматография (ГХ), также не идеальны, поскольку эти методы требуют больших объемов проб. Поскольку микрофлюидика позволяет проводить эксперименты с небольшими объемами (включая анализ отдельных клеток или нескольких клеток), комбинационное рассеяние света является ведущим методом микрофлюидного обнаружения. В частности, интеграция комбинационного рассеяния света с микрофлюидными устройствами имеет широкое применение в системах, где необходима идентификация липидов, что часто встречается в исследованиях биотоплива . Например, флуоресцентный анализ липидов недостаточно селективен и, следовательно, не может выявить молекулярные различия так, как это может сделать комбинационное рассеяние света с помощью молекулярных вибраций. Комбинационное рассеяние света в сочетании с микрофлюидными устройствами также может контролировать смешивание и улавливание жидкостей, а также обнаруживать твердые и газовые фазы внутри микрофлюидных платформ - способность, которая применима для изучения растворимости газа и жидкости.

Рамановская спектроскопия в микрофлюидных устройствах применяется и обнаруживается с использованием встроенной волоконной оптики. внутри микрофлюидного чипа или поместив устройство на рамановский микроскоп . Кроме того, в некоторых микрофлюидных системах используется металлический коллоид. или наночастицы в рамках решения, позволяющего извлечь выгоду из рамановской спектроскопии с поверхностным усилением (SERS). SERS может улучшить комбинационное рассеяние почти в 10 раз. ¹¹ путем образования комплексов с переносом заряда . на поверхности Отсюда следует, что эти устройства обычно изготавливаются из нанопористых поликарбонатных мембран, позволяющих легко наносить покрытие из наночастиц . Однако, если он изготовлен из полидиметилсилоксана (ПДМС), может возникнуть интерференция сигнала со спектром комбинационного рассеяния света. PDMS генерирует сильный рамановский сигнал, который может легко подавлять желаемый сигнал и создавать помехи. Распространенным решением этой проблемы является изготовление микрофлюидного устройства таким образом, чтобы конфокальное отверстие можно было использовать для рамановского лазера. Типичная конфокальная рамановская микроскопия позволяет получать спектроскопическую информацию из небольших фокальных объемов размером менее 1 микрона в кубе и, следовательно, меньшими, чем размеры микрофлюидного канала. Рамановский сигнал по своей природе слаб; поэтому для короткого времени обнаружения при небольших объемах образцов в микрофлюидных устройствах используется усиление сигнала. Многофотонная рамановская спектроскопия, такая как стимулированная рамановская спектроскопия (SRS) или когерентная антистоксова рамановская спектроскопия (CARS), помогает усилить сигналы от веществ в микрофлюидных устройствах.

Для капельной микрофлюидики рамановское обнаружение обеспечивает онлайн-анализ нескольких аналитов в каплях или непрерывной фазе. Сигнал комбинационного рассеяния света чувствителен к изменениям концентрации, поэтому растворимость и кинетику смешивания микрофлюидной системы на основе капель можно определить с помощью комбинационного рассеяния света. При этом учитывается разница показателей преломления на границе раздела капли и непрерывной фазы, а также между соединениями жидкости и канала.

Флуоресцентное обнаружение

Флуоресцентная спектроскопия является одним из наиболее распространенных методов обнаружения капель. Он обеспечивает быстрый ответ и для применимых аналитов имеет сильный сигнал. Использование флуоресцентной спектроскопии в микрофлюидике аналогично большинству других флуоресцентных аналитических методов. Источник света используется для возбуждения молекул аналита в образце, после чего аналит флуоресцирует, а отклик флуоресценции является измеренным выходным сигналом. Камеры можно использовать для захвата сигнала флуоресценции капель. и фильтры часто используются для фильтрации рассеянного возбуждающего света. При микрофлюидном обнаружении капель экспериментальная установка флуоресцентного прибора может сильно различаться. Обычно при обнаружении флуоресцентных капель используется эпифлуоресцентный микроскоп . Иногда при этом используется конфокальная геометрия, которая может варьироваться в зависимости от экспериментальных потребностей. Например, Джеффрис и др. сообщил об успехе в исследовании ортогональной конфокальной геометрии в отличие от стандартной эпигеометрии. Однако были изучены и другие установки для обнаружения флуоресценции, поскольку эпифлуоресцентные микроскопы могут быть дорогими и трудными в обслуживании. Коул и др. предложили и протестировали экспериментальную установку с волоконной оптикой для проведения флуоресцентного анализа микрожидкостных капель.

Флуоресцентное обнаружение капель имеет ряд преимуществ. Во-первых, он может обеспечить большую и быструю пропускную способность. Анализ тысяч образцов можно провести за короткий период времени, что выгодно при анализе большого количества образцов. Еще одним преимуществом является точность метода. В анализе, проведенном Ли и др., Было обнаружено, что использование методов обнаружения флуоресценции дало 100% точность обнаружения на 13 из 15 собранных изображений. Остальные два имели относительную погрешность около 6%. Еще одним преимуществом флуоресцентного обнаружения является то, что оно позволяет количественно анализировать расстояние между каплями в образце. Это делается с помощью временных измерений и скорости потока аналита. Временной интервал между сигналами позволяет рассчитать расстояние между каплями. Дальнейший флуоресцентный анализ образцов микрожидкостных капель можно использовать для измерения времени жизни флуоресценции образцов, предоставляя дополнительную информацию, которую невозможно получить только для измерения интенсивности флуоресценции.

Приложения обнаружения флуоресценции разнообразны, многие из них сосредоточены в биологических приложениях. Френц и др. использовали флуоресцентное обнаружение капель для изучения кинетики ферментов. В этом эксперименте b-лактамаза взаимодействовала с флуороциллином, флуорогенным субстратом. Флуоресценцию капель измеряли через несколько интервалов времени, чтобы изучить изменения со временем. Однако этот метод обнаружения выходит за рамки биологических приложений и позволяет физически изучать образование и эволюцию капель. Например, Сакаи и др. использовали обнаружение флуоресценции для мониторинга размера капель. Это было сделано путем сбора данных флуоресценции для расчета концентрации флуоресцентного красителя в одной капле, что позволяло отслеживать рост размера. Использование методов обнаружения флуоресценции может быть расширено и за пределы сбора данных; Широко используемым методом сортировки клеток и капель в микрофлюидике является сортировка, активируемая флуоресценцией, при которой капли сортируются по различным каналам или местам сбора в зависимости от интенсивности их флуоресценции.

Флуоресцентные квантовые точки использовались для разработки биосенсорных платформ. и доставка лекарств в микрофлюидных устройствах. Квантовые точки полезны благодаря их небольшому размеру, точной длине волны возбуждения и высокому квантовому выходу . Это преимущества перед традиционными красителями, которые могут влиять на активность изучаемого соединения. Однако массовое создание и сопряжение квантовых точек с интересующими молекулами остается проблемой. Микрофлюидные устройства, конъюгирующие нуклеотиды с квантовыми точками, были разработаны для решения этой проблемы за счет значительного сокращения времени конъюгации с двух дней до минут. Конъюгаты ДНК-квантовые точки важны для обнаружения комплементарной ДНК и микроРНК в биологических системах.

Электрохимическое обнаружение

Электрохимическое обнаружение служит недорогой альтернативой для измерения не только химического состава в определенных случаях, но и длины, частоты, проводимости и скорости капель на высоких скоростях и обычно с очень небольшой компенсацией пространства на чипе. Этот метод впервые обсуждался Luo et al. при этом команде удалось успешно измерить размер и концентрацию ионов в пиколитровых каплях, содержащих растворенные ионы NaCl. Обычно это выполняется с помощью набора или серии микроэлектродов , которые измеряют возмущения тока: капли меньшего размера дают меньшие возмущения, а капли большего размера дают более длинные кривые. Количество возмущений тока также может указывать на частоту прохождения капель через электрод, что также позволяет определить скорость капель. Для использования в электродах было предложено несколько различных соединений, поскольку точные, точные и значимые показания могут быть затруднены в микромасштабе. Эти соединения варьируются от электродов из углеродной пасты , которые наносятся непосредственно на чип, до платиновой черни , электроосажденной на платиновую проволоку в тандеме с хлоридом серебра на серебряном микроэлектроде для увеличения активности и площади поверхности.

Что касается химического состава, показания достигаются посредством хроноамперометрического анализа электроактивных соединений внутри капель, как указано выше. Потенциал варьируется в зависимости от электрически жизнеспособных ионов, растворенных ионов натрия и хлора в этом эксперименте, а также их концентрации в каждой капле. Другая группа с помощью серии контрольных тестов продемонстрировала, что состав смешанных капель, включающий йодид калия, обнаруживался точно в секундах с оптимальными диапазонами напряжения, скорости и pH. В дополнение к этому, развивается более уникальный подход к хроноамперометрическим измерениям, когда создаются магнито-флюидные системы и потенциальные показания измеряются в электронеактивных жидкостях путем растворения магнитных микрочастиц в реагенте. Этот метод расширен до цифровой микрофлюидной (DMF) установки, где золотые и серебряные электроды в соединении с растворенными магнитными микрочастицами в жидкостях заменили типичное флуоресценции обнаружение капель на основе в иммуноанализе биомаркерных аналитов.

Приведенный выше эксперимент Шамси и др. указывает на основное использование электрохимического обнаружения в микрофлюидике; биосенсорство для различных измерений, таких как кинетика ферментов и биологические анализы многих других типов клеток. Для этих процессов необходим усиленный контроль над системой, поскольку с увеличением скорости потока выявление ферментов снижается. Хотя по мере развития ферментативной реакции амперометрические показания также будут меняться, что позволяет быстро отслеживать кинетику. Кроме того, определенные поверхностно-активные вещества могут не иметь биосовместимости с системой, что влияет на обнаружение ферментов и искажений. Возможности этого применения даже оказали влияние на аквакультуру и экономику, поскольку электрохимическое зондирование стало использоваться для быстрой проверки свежести рыбы. Использование этого метода обнаружения в первую очередь встречается при электросмачивании диэлектрических ДМФ, где устройство чувствительного электрода можно реконфигурировать и имеет более длительный срок службы, сохраняя при этом точные результаты.