Цианидиошизон
| Цианидиошизон | |
|---|---|
 | |
Научная классификация  | |
| (без рейтинга): | Археопластида |
| Разделение: | Родофита |
| Сорт: | Цианидиофицеи |
| Заказ: | Цианидиалы |
| Семья: | Цианидиевые |
| Род: | Цианидиошизон |
| Разновидность: | С. меролаэ |
| Биномиальное имя | |
| Цианидиошизон меролае П.Де Лука, Р.Таддей и Л.Варано, 1978 г. [1] | |
Cyanidioschyzon merolae — небольшая (2 мкм) булавовидная одноклеточная гаплоидная красная водоросль , адаптированная к среде горячих источников с высоким содержанием серы и кислот (pH 1,5, 45 °C). [2] [3] Клеточная архитектура C. merolae чрезвычайно проста: она содержит только один хлоропласт и одну митохондрию и лишена вакуоли и клеточной стенки . [4] Кроме того, деление клеток и органелл может быть синхронизировано. По этим причинам C. merolae считается превосходной модельной системой для изучения процессов деления клеток и органелл, а также биохимии и структурной биологии . [5] [6] [7] организма Геном был первым полным геномом водорослей, секвенированным в 2004 году; [8] его пластида была секвенирована в 2000 и 2003 годах, а митохондрии - в 1998 году. [9] Этот организм считался простейшей из эукариотических клеток из-за его минималистской клеточной организации. [10]
Изоляция и рост культуры
[ редактировать ]Первоначально выделен Де Лукой в 1978 году из сольфатановых фумарол Кампи Флегрей ( Неаполь, Италия ). [2] C. merolae можно выращивать в лабораторных условиях на модифицированной среде Аллена (МА). [7] или модифицированная форма с удвоенной концентрацией некоторых элементов, называемая MA2. [10] [12] При использовании среды MA темпы роста не особенно высоки: время удвоения (время, необходимое культуре микробов для удвоения количества клеток на единицу объема) составляет примерно 32 часа. [7] Используя более оптимальную среду МА2, это время можно сократить до 24 часов. [7] Культивирование проводится при 42 °C (108 °F) под белым флуоресцентным светом с приблизительной интенсивностью фотонов 50 мкмоль м. −2 с −1 (мкЕ). [10] Однако при более высокой интенсивности света, равной 90 мкЕ, с применением 5% CO 2 посредством барботирования скорость роста C. merolae может быть дополнительно увеличена со временем удвоения, составляющим примерно 9,2 часа. [7] Более сильный свет не обязательно полезен, так как выше 90 мкЕ скорость роста начинает снижаться. [7] Это может быть связано с фотоповреждением фотосинтетического аппарата. C. merolae также можно выращивать на чашках из геллановой камеди в целях отбора колоний или поддержания штамма в лаборатории. [7] C. merolae является облигатным оксигенным фототрофом , то есть он не способен поглощать фиксированный углерод из окружающей среды и должен полагаться на оксигенный фотосинтез для фиксации углерода из CO 2 . [10]
Геном
[ редактировать ]размером 16,5 мегабаз Геном C. merolae был секвенирован в 2004 году. [3] Уменьшенный, чрезвычайно простой и компактный геном состоит из 20 хромосом и содержит 5331 ген, из которых 86,3% экспрессируются и только 26 содержат интроны , содержащие строгие консенсусные последовательности. [3] Поразительно, но геном C. merolae содержит всего 30 генов тРНК и крайне минимальное количество копий генов рибосомальной РНК . [3] как показано в таблице сравнения геномов . Уменьшенная природа генома привела к ряду других необычных особенностей. В то время как большинство эукариот содержат около 10 копий динаминов , необходимых для сжимания мембран и разделения разделительных компартментов, C. merolae содержит только две, [3] факт, которым исследователи воспользовались при изучении деления органелл.
Несмотря на небольшой геном, [8] Геном хлоропластов C. merolae содержит множество генов, отсутствующих в геномах хлоропластов других водорослей и растений. [13] Большинство его генов не имеют интронов. [8]
Молекулярная биология
[ редактировать ]были разработаны генетические инструменты Как и в случае с большинством модельных организмов, для C. merolae . К ним относятся методы выделения ДНК и РНК из C. merolae , введение ДНК в C. merolae для временной или стабильной трансформации, а также методы селекции, включающие урациловый ауксотроф, который можно использовать в качестве маркера селекции.
выделение ДНК
[ редактировать ]используется несколько методов, основанных на протоколах цианобактерий Для выделения ДНК из C. merolae . [10] [14] Первый — это экстракция горячим фенолом , которая представляет собой быструю экстракцию, которую можно использовать для выделения ДНК, подходящей для амплификации ДНК . полимеразной цепной реакции (ПЦР) [10] [15] при этом фенол добавляют к целым клеткам и инкубируют при 65 °C для извлечения ДНК. [10] Если требуется более чистая ДНК, цетилтриметиламмонийбромида можно использовать метод (ЦТАБ). В этом методе сначала применяется экстракционный буфер с высоким содержанием соли и клетки разрушаются, после чего для экстракции ДНК при комнатной температуре используется смесь хлороформа и фенола. [10]
Выделение РНК
[ редактировать ]Тотальную РНК можно экстрагировать из клеток C. merolae, используя вариант метода горячего фенола, описанный выше для ДНК. [10]
Экстракция белка
[ редактировать ]Как и в случае с ДНК и РНК, протокол экстракции белков также является адаптацией протокола, используемого у цианобактерий. [10] [16] Клетки разрушают с помощью стеклянных шариков и встряхивания в 10% глицериновом буфере, содержащем восстановитель ДТТ, для разрыва дисульфидных связей внутри белков. [10] В результате такой экстракции будут получены денатурированные белки , которые можно будет использовать в гелях SDS-PAGE для вестерн-блоттинга и окрашивания Кумасси .
Селекция трансформантов и ауксотрофная линия урацила
[ редактировать ]C. merolae чувствителен ко многим антибиотикам, обычно используемым для отбора успешно трансформированных особей в лаборатории, но устойчив к некоторым антибиотикам, особенно к ампициллину и канамицину . [7] [17]
Обычно используемый маркер селекции для трансформации C. merolae включает урациловый ауксотроф (требующий экзогенного урацила). Мутант был получен путем выращивания C. merolae в присутствии соединения 5-FOA, которое само по себе нетоксично, но превращается в токсичное соединение 5-фторурацил с помощью фермента пути биосинтеза урацила, оротидина 5. '-монофосфат (OMP) декарбоксилаза , кодируемая геном Ura5.3 . [7] Случайная мутация привела к нескольким мутантам с потерей функции в Ura5.3 , что позволило клеткам выживать в присутствии 5-FOA до тех пор, пока был предоставлен урацил. [7] Трансформируя этого мутанта ПЦР-фрагментом, несущим как интересующий ген, так и функциональную копию Ura5.3 , исследователи могут подтвердить, что интересующий ген был включен в геном C. merolae, если он может расти без экзогенного урацила.
Временная экспрессия, опосредованная полиэтиленгликолем (ПЭГ)
[ редактировать ]В то время как хромосомная интеграция генов создает стабильный трансформант, временная экспрессия позволяет проводить краткосрочные эксперименты с использованием меченых или модифицированных генов C. merolae . Временная экспрессия может быть достигнута с использованием метода на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ) в протопластах (растительных клетках с жесткой клеточной стенкой , удаленной ферментативно), а поскольку у C. merolae клеточная стенка отсутствует, она ведет себя так же, как протопласт, в целях трансформации. [12] Для трансформации клетки кратковременно подвергаются воздействию 30% ПЭГ с интересующей ДНК, что приводит к временной трансформации. [12] В этом методе ДНК рассматривается как кольцевой элемент и не интегрируется в геном организма, поскольку не существует гомологичных областей для интеграции.
Нацеливание на гены
[ редактировать ]Чтобы создать стабильную мутантную линию, можно использовать нацеливание на гены для вставки интересующего гена в определенное место генома C. merolae посредством гомологичной рекомбинации . Включив участки ДНК длиной в несколько сотен пар оснований на концах интересующего гена, которые комплементарны последовательности в геноме C. merolae организма , можно использовать собственный механизм репарации ДНК для вставки гена в эти участки. [18] Здесь можно использовать ту же процедуру трансформации, которая используется для временной экспрессии, за исключением гомологичных сегментов ДНК, позволяющих интегрировать геном. [18]
Изучение деления клеток и органелл.
[ редактировать ]Чрезвычайно простое деление, простая клеточная архитектура и способность синхронизировать деления делают C. merolae идеальным организмом для изучения механизмов деления эукариотических клеток и органелл. [3] [6] Синхронизация деления органелл в культивируемых клетках может быть очень простой и обычно предполагает использование светового и темнового циклов. химический агент афидиколин . Для простой и эффективной синхронизации деления хлоропластов можно добавить [19] Механизм деления пероксисом впервые был установлен с использованием C. merolae как системы. [20] где деление пероксисом можно синхронизировать с помощью микротрубочки, разрушающего препарата оризалина, в дополнение к циклам света и темноты. [20]
Исследования фотосинтеза
[ редактировать ]C. merolae также используется при исследовании фотосинтеза . Примечательно, что субъединичный состав фотосистем C. merolae имеет некоторые существенные отличия от такового у других родственных организмов. [21] [22] Фотосистема II (PSII) C. merolae , как и следовало ожидать, имеет особенно необычный диапазон pH, в котором она может функционировать. [21] [23] Несмотря на то, что механизм PSII требует быстрого высвобождения протонов, а растворы с более низким pH должны изменить эту способность, PSII C. merolae способен обменивать и расщеплять воду с той же скоростью, что и другие родственные виды. [21]
См. также
[ редактировать ]Внешние ссылки
[ редактировать ]Гири, доктор медицины; Гири, ГМ « Цианидиошизон меролае » . База водорослей . Всемирное электронное издание, Национальный университет Ирландии, Голуэй.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ «Cyanidioschyzon merolae»: новая водоросль термокислой среды. П. Де Лука, Р. Таддеи и Л. Варано, Веббиа, 1978 г.
- ^ Перейти обратно: а б Де Лука П; Таддей Р; Варано Л. (1978). « Цианидиошизон меролае »: новая водоросль термокислой среды». Журнал таксономии и географии растений . 33 (1): 37–44. дои : 10.1080/00837792.1978.10670110 . ISSN 0083-7792 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и ж Мацузаки М; Мисуми О; Шин-и Т; Маруяма С; Такахара М; Миягисима С; Мори Т; Нисида К; Ягиса Ф; Нисида К; Ёсида Ю; Нисимура Ю; Накао С; Кобаяши Т; Момояма Ю; Хигасияма Т; Минода А; Сано М; Номото Х; Оиси К; Хаяши Х; Охта Ф; Нисидзака С; Хага С; Миура С; Моришита Т; Кабея Ю; Терасава К; Сузуки Ю; Исии Ю; Асакава С; Такано Х; Охта Н; Куроива Х; Танака К; Симидзу Н; Сугано С; Сато Н; Нодзаки Х; Огасавара Н; Кохара Ю; Куроива Т. (2004). «Последовательность генома ультрамаленькой одноклеточной красной водоросли Cyanidioschyzon merolae 10D» . природа 428 (6983): 653–657. дои : 10.1038/nature02398 . ПМИД 15071595 .
- ^ Роберт Эдвард Ли (1999). Психология . Издательство Кембриджского университета.
- ^ Куроива Т; Куроива Х; Сакаи А; Такахаши Х; Тода К; Ито Р. (1998). «Аппарат деления пластид и митохондрий». Межд. Преподобный Цитол . Международный обзор цитологии. 181 : 1–41. дои : 10.1016/s0074-7696(08)60415-5 . ISBN 9780123645852 . ПМИД 9522454 .
- ^ Перейти обратно: а б Куроива (1998). «Примитивные красные водоросли Cyanidium Caldarium и Cyanidioschyzon merolae как модельная система для исследования разделительного аппарата митохондрий и пластид». Биоэссе . 20 (4): 344–354. doi : 10.1002/(sici)1521-1878(199804)20:4<344::aid-bies11>3.0.co;2-2 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и ж г час я дж Минода А; Сакагами Р; Ягисава Ф; Куроива Т; Танака К. (2004). «Улучшение условий культивирования и доказательства ядерной трансформации путем гомологичной рекомбинации у красной водоросли Cyanidioschyzon merolae 10D» . Физиол растительной клетки . 45 (6): 667–671. дои : 10.1093/pcp/pch087 . ПМИД 15215501 .
- ^ Перейти обратно: а б с Мацузаки, М.; и др. (2004). «Последовательность генома ультрамаленькой одноклеточной красной водоросли Cyanidioschyzon merolae 10D» . Природа . 428 (6983): 653–657. дои : 10.1038/nature02398 . ПМИД 15071595 .
- ^ Барбье, Гийом; и др. (2005). «Сравнительная геномика двух близкородственных одноклеточных термоацидофильных красных водорослей, Galdieria ulfuraria и Cyanidioschyzon merolae , раскрывает молекулярную основу метаболической гибкости Galdieria сульфурарии и значительные различия в метаболизме углеводов обеих водорослей» . Физиология растений . 137 (2): 460–474. дои : 10.1104/стр.104.051169 . ПМК 1065348 . ПМИД 15710685 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и ж г час я дж к Кобаяши Ю; Онума М; Куроива Т; Танака К; Ханаока М (2010). «Основы культивирования и молекулярно-генетического анализа одноклеточной красной водоросли Cyanidioschyzon merolae ». Журнал эндоцитобиоза и клеточных исследований . 20 : 53–61.
- ^ Перейти обратно: а б Кастенхольц Р.В.; Макдермотт Т.Р. (2010). «Цианидии: экология, биоразнообразие и биогеография». В Зекбахе Дж; Чепмен DJ (ред.). Красные водоросли в эпоху генома . стр. 357–371.
- ^ Перейти обратно: а б с Онума М; Ёкояма Т; Иноуэ Т; Секин Ю; Танака К. (2008). «Опосредованная полиэтиленгликолем (ПЭГ) временная экспрессия генов в красной водоросли Cyanidioschyzon merolae 10D» . Физиол растительной клетки . 49 (1): 117–120. дои : 10.1093/pcp/pcm157 . ПМИД 18003671 .
- ^ Охта, Н; Мацузаки, М; Мисуми, О; Миягишима, Ю.Ю.; Нодзаки, Х; Танака, К; Шин-и, Т; Кохара, Ю; Куроива, Т. (2003). «Полный секвенированный анализ пластидного генома одноклеточной красной водоросли Cyanidioschyzon merolae» . Исследование ДНК . 10 (2): 67–77. дои : 10.1093/dnares/10.2.67 . ПМИД 12755171 .
- ^ Имамура С; Ёшихара С; Накано С; Сиодзаки Н; Ямада А; Танака К; Такахаши Х; Асаяма М; Шираи М (2003). «Очистка, характеристика и экспрессия генов всех сигма-факторов РНК-полимеразы в цианобактериях». Дж. Мол. Биол . 325 (5): 857–872. дои : 10.1016/s0022-2836(02)01242-1 . ПМИД 12527296 .
- ^ Кобаяшиа Ю; Канесакиа Ю; Танакаб А; Куройвац Х; Куройвац Т; Танака К. (2009). «Тетрапирроловый сигнал как координатор клеточного цикла от органеллы до репликации ядерной ДНК в растительных клетках» . Учеб. Натл. акад. Наука . 106 (3): 803–807. дои : 10.1073/pnas.0804270105 . ПМЦ 2625283 . ПМИД 19141634 .
- ^ Имамура С; Ханаока М; Танака К. (2008). «Растительный белок, родственный TFIIB, PBRP, является общим фактором транскрипции для РНК-полимеразы I» . ЭМБО Дж . 27 (17): 2317–2327. дои : 10.1038/emboj.2008.151 . ПМК 2529366 . ПМИД 18668124 .
- ^ Ягисава Ф; Нисида К; Окано Ю; Минода А; Танака К; Куроива Т. (2004). «Выделение устойчивых к циклогексимиду мутантов Cyanidioschyzon merolae » . Цитология . 69 : 97–100. doi : 10.1508/cytology.69.97 .
- ^ Перейти обратно: а б Фудзивара Т; Онума М; Ёсида М; Куроива Т; Хирано Т (2013). «Нацеливание на гены в красной водоросли Cyanidioschyzon merolae : вставка одной и нескольких копий с использованием аутентичных и химерных маркеров селекции» . ПЛОС ОДИН . 8 (9): е73608. дои : 10.1371/journal.pone.0073608 . ПМК 3764038 . ПМИД 24039997 .
- ^ Теруи С; Сузуки К; Такахиаши Х; Ито Р; Куроива Т. (1995). «Высокая синхронизация деления хлоропластов у ультрамикроводоросли Cyanidioschyzon merolae при обработке светом и афидиколином». Дж. Фикол . 31 : 958–961. дои : 10.1111/j.0022-3646.1995.00958.x . S2CID 84124611 .
- ^ Перейти обратно: а б Имото Ю; Куроива Х; Ёсида Ю; Онума М; Фудзивара Т; Ёсида М; Нисида К; Ягисава Ф; Хироока С; Миягисима С; Мисуми О; Кавано С; Куроива Т. (2013). «Деление пероксисом, ограниченное одной мембраной, выявленное путем выделения механизмов на основе динамина» . Учеб. Натл. акад. Наука . 110 (23): 9583–9588. дои : 10.1073/pnas.1303483110 . ПМЦ 3677435 . ПМИД 23696667 .
- ^ Перейти обратно: а б с Нильссон Х; Крупник Т; Каргул Дж; Мессингер Дж (2014). «Субстратный водообмен в ядерных комплексах фотосистемы II экстремофильной красной водоросли Cyanidioschyzon merolae » . Biochimica et Biophysica Acta (BBA) — Биоэнергетика . 1837 (8): 1257–1262. дои : 10.1016/j.bbabio.2014.04.001 . ПМИД 24726350 .
- ^ Брикер ТМ; Русе Дж.Л.; Фагерлунд РД; Франкель Л.К.; Итон-Рай Джей Джей (2012). «Внешние белки фотосистемы II» . Биохим. Биофиз. Акта . 1817 (1): 121–142. дои : 10.1016/j.bbabio.2011.07.006 . ПМИД 21801710 .
- ^ Крупник Т; Котабова Е; ван Безувен Л.С.; Мазур Р; Гарстка М; Никсон Пи Джей; Барбер Дж; Кана Р; Букема Э.Дж.; Каргул Дж (2013). «Механизм фотозащиты, зависящий от реакционного центра, в высокоустойчивой фотосистеме II экстремофильной красной водоросли Cyanidioschyzon merolae » . Ж. Биол. Хим . 288 (32): 23529–23542. дои : 10.1074/jbc.m113.484659 . ПМК 5395030 . ПМИД 23775073 .