Макромолекулярная сборка

Термин макромолекулярная сборка (МА) относится к массивным химическим структурам, таким как вирусы и небиологические наночастицы , клеточные органеллы , мембраны , рибосомы и т. д., которые представляют собой сложные смеси полипептидов , полинуклеотидов , полисахаридов или других полимерных макромолекул . Обычно они относятся к более чем одному из этих типов, и смеси определяются пространственно (т. е. в отношении их химической формы), а также в отношении их основного химического состава и структуры . Макромолекулы встречаются в живых и неживых существах и состоят из многих сотен или тысяч атомов, удерживаемых вместе ковалентными связями ; они часто характеризуются повторяющимися звеньями (т. е. являются полимерами ). Их совокупности также могут быть биологическими или небиологическими, хотя термин МА чаще применяется в биологии, а термин супрамолекулярная сборка чаще применяется в небиологических контекстах (например, в супрамолекулярной химии и нанотехнологиях ). МА макромолекул удерживаются в определенных формах нековалентные межмолекулярные взаимодействия (а не ковалентные связи) и могут иметь либо неповторяющиеся структуры (например, как в архитектуре рибосомы (изображения) и клеточной мембраны ), либо повторяющиеся линейные, круговые, спиральные или другие структуры ( например, как в актиновых нитях и жгутиковом моторе , изображение). Процесс образования МА получил название молекулярной самосборки , этот термин особенно применяется в небиологическом контексте. Для изучения МА существует широкий спектр физических/биофизических, химических/биохимических и вычислительных методов; Учитывая масштаб (молекулярные размеры) МА, попытки разработать их состав и структуру, а также выявить механизмы, лежащие в основе их функций, находятся на переднем крае современной структурной науки.

Эукариотическая рибосома , которая каталитически переводит информацию, содержащуюся в молекулах мРНК , в белки. Анимация представляет этапы элонгации и мембранной трансляции эукариотической трансляции , показывая мРНК в виде черной дуги, субъединицы рибосомы - зеленым и желтым, тРНК - темно-синим, белки, такие как элонгация , и другие факторы, участвующие в светло-синем, - растущую полипептидную цепь. в виде черной нити, растущей вертикально от изгиба мРНК. В конце анимации полученный полипептид выдавливается через голубую пору SecY. ^[3] в серый интерьер отделения скорой помощи .

Биомолекулярный комплекс

Биомолекулярный комплекс , также называемый биомакромолекулярным комплексом , представляет собой любой биологический комплекс, состоящий из более чем одного биополимера ( белка , РНК , ДНК , ^[5]углеводы ) или крупные неполимерные биомолекулы ( липиды ). Взаимодействия между этими биомолекулами нековалентны. ^[6]Примеры:

Белковые комплексы , некоторые из которых являются мультиферментными : протеасома , голофермент ДНК-полимеразы III , голофермент РНК-полимеразы II , симметричные вирусные капсиды , комплекс шаперонинов GroEL - GroES , фотосистема I , АТФ-синтаза , ферритин .
РНК-белковые комплексы: рибосома , сплайсосома , свод , SnRNP . Такие комплексы в ядре клетки называются рибонуклеопротеинами (РНП).
ДНК-белковые комплексы: нуклеосома .
Белково-липидные комплексы: липопротеин . ^[7]^[8]

Биомакромолекулярные комплексы структурно изучены методами рентгеновской кристаллографии , ЯМР-спектроскопии белков , криоэлектронной микроскопии и последовательного одночастичного анализа , электронной томографии . ^[9]Модели атомной структуры, полученные с помощью рентгеновской кристаллографии и биомолекулярной ЯМР-спектроскопии, можно состыковать с гораздо более крупными структурами биомолекулярных комплексов, полученными с помощью методов более низкого разрешения, таких как электронная микроскопия, электронная томография и малоугловое рассеяние рентгеновских лучей . ^[10]

Комплексы макромолекул повсеместно встречаются в природе, где участвуют в построении вирусов и всех живых клеток. Кроме того, они играют фундаментальную роль во всех основных жизненных процессах ( трансляция белков , деление клеток , транспорт везикул , внутри- и межклеточный обмен материала между компартментами и т. д.). В каждой из этих ролей сложные смеси организованы особым структурным и пространственным образом. В то время как отдельные макромолекулы удерживаются вместе за счет комбинации ковалентных связей и внутримолекулярных нековалентных сил (т.е. связей между частями внутри каждой молекулы посредством взаимодействий заряд-заряд , сил Ван-дер-Ваальса и диполь-дипольных взаимодействий, таких как водородные связи). ), по определению сами МА удерживаются вместе исключительно за счет нековалентных сил, за исключением теперь возникающих между молекулами (т.е. межмолекулярных взаимодействий ). ^{[ нужна ссылка ]}

Шкалы MA и примеры

Изображения выше дают представление о композиции и масштабе (размерах), связанных с МА, хотя они только начинают касаться сложности структур; в принципе, каждая живая клетка состоит из МА, но сама также является МА. В примерах и других подобных комплексах и сборках каждый из МА часто имеет молекулярную массу в миллионы дальтонов (мегадальтоны, т.е. в миллионы раз больше веса одного простого атома), хотя все еще имеет измеримые соотношения компонентов ( стехиометрии на некотором уровне ). точности. Как указано в подписях к изображениям, при правильном приготовлении МА или составляющие их подкомплексы часто можно кристаллизовать для изучения с помощью кристаллографии белков и родственных методов или изучить другими физическими методами (например, спектроскопией , микроскопией ). ^{[ нужна ссылка ]}

Графическое изображение структуры вирусного МА, вируса мозаики вигны , с 30 копиями каждого из его белков оболочки, мелкого белка оболочки (S, желтый) и большого белка оболочки (L, зеленый), которые вместе с 2 молекулы с положительным смыслом РНК (РНК-1 и РНК-2, не видны) составляют вирион. Сборка очень симметрична и имеет диаметр ~ 280 Å (28 нм) в самом широком месте. ^{[ нужна проверка ]}^{[ нужна ссылка ]}

Вирусные структуры были одними из первых изученных МА; другие биологические примеры включают рибосомы (частичное изображение выше), протеасомы и комплексы трансляции (с компонентами белков и нуклеиновых кислот ), прокариотические и эукариотические транскрипционные комплексы, а также ядерные и другие биологические поры , которые обеспечивают проход материала между клетками и клеточными компартментами. Биомембраны также обычно считаются МА, хотя требования к структурному и пространственному определению изменены, чтобы учесть присущую молекулярную динамику мембранных липидов и белков внутри липидных бислоев . ^[15]

Сборка вируса

При сборке бактериофага (фага) Т4 вириона морфогенетические белки, кодируемые фаговыми генами, взаимодействуют друг с другом в характерной последовательности. Поддержание соответствующего баланса в количествах каждого из этих белков, вырабатываемых во время вирусной инфекции, по-видимому, имеет решающее значение для нормального морфогенеза фага Т4 . ^[16] Белки, кодируемые фагом Т4, которые определяют структуру вириона, включают основные структурные компоненты, второстепенные структурные компоненты и неструктурные белки, которые катализируют определенные этапы последовательности морфогенеза. ^[17]

Исследования в области магистратуры

Изучение структуры и функций МА является сложной задачей, в частности, из-за их размера в мегадальтонах, а также из-за их сложного состава и различной динамической природы. В большинстве случаев применялись стандартные химические и биохимические методы (методы очистки и центрифугирования белков , химическая и электрохимическая характеристика и т. д.). Кроме того, их методы исследования включают современные протеомные подходы, вычислительные и структурные методы с атомным разрешением (например, рентгеновскую кристаллографию ), малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) и малоугловое рассеяние нейтронов (SANS), силовую спектроскопию. трансмиссионная электронная микроскопия и криоэлектронная микроскопия . Аарон Клуг был удостоен Нобелевской премии по химии 1982 года за работу по выяснению структуры с помощью электронной микроскопии, в частности, для белково-нуклеиновых кислотных МА, включая вирус табачной мозаики (структура, содержащая молекулу оцРНК из 6400 оснований и> 2000 молекул белка оболочки). . Кристаллизация и структурное решение рибосомы с молекулярной массой ~ 2,5 МДа, примера части белково-синтетического «механизма» живых клеток, было предметом исследования 2009 г. Нобелевская премия по химии присуждена Венкатраману Рамакришнану , Томасу А. Стейцу и Аде Э. Йонат . ^[18]

Небиологические аналоги

Наконец, биология не является единственной областью магистратуры. В каждой области супрамолекулярной химии и нанотехнологий есть области, которые были разработаны для разработки и расширения принципов, впервые продемонстрированных в биологических МА. Особый интерес в этих областях представляет разработка фундаментальных процессов молекулярных машин и расширение известных конструкций машин до новых типов и процессов. ^{[ нужна ссылка ]}

См. также

Многосостояние моделирования биомолекул
Четвертичная структура
Мультипротеиновый комплекс
Органелла : самое широкое определение «органеллы» включает не только мембраносвязанные клеточные структуры, но и очень большие биомолекулярные комплексы.
Многосостояние моделирования биомолекул

Ссылки

^ Бан Н., Ниссен П., Хансен Дж., Мур П.Б., Стейц Т.А. (август 2000 г.). «Полная атомная структура большой субъединицы рибосомы с разрешением 2,4 А». Наука . 289 (5481): 905–920. Бибкод : 2000Sci...289..905B . CiteSeerX 10.1.1.58.2271 . дои : 10.1126/science.289.5481.905 . ПМИД 10937989 .
^ МакКлюр В. «Субъединица рибосомы 50S» . Архивировано из оригинала 24 ноября 2005 г. Проверено 9 октября 2019 г.
^ Осборн А.Р., Рапопорт Т.А., ван ден Берг Б. (2005). «Транслокация белков по каналу Sec61/SecY». Ежегодный обзор клеточной биологии и биологии развития . 21 : 529–550. doi : 10.1146/annurev.cellbio.21.012704.133214 . ПМИД 16212506 .
^ Легенда, обложка, J. Bacteriol., октябрь 2006 г. ^{[ нужна полная цитата ]}
^ Кляйнджунг Дж., Братья Ф. (июль 2005 г.). «POPSCOMP: автоматизированный анализ взаимодействия биомолекулярных комплексов» . Исследования нуклеиновых кислот . 33 (проблема с веб-сервером): W342–W346. дои : 10.1093/nar/gki369 . ПМК 1160130 . ПМИД 15980485 .
^ Мур П.Б. (2012). «Как нам следует относиться к рибосоме?». Ежегодный обзор биофизики . 41 (1): 1–19. doi : 10.1146/annurev-biophys-050511-102314 . ПМИД 22577819 .
^ Нойман Н. (январь 2016 г.). «Сложный макромолекулярный комплекс» . Тенденции биохимических наук . 41 (1): 1–3. дои : 10.1016/j.tibs.2015.11.006 . ПМИД 26699226 .
^ Дутта С., Берман HM (март 2005 г.). «Большие макромолекулярные комплексы в Банке данных белков: отчет о состоянии» . Структура . 13 (3): 381–388. дои : 10.1016/j.str.2005.01.008 . ПМИД 15766539 .
^ Рассел Р.Б., Альбер Ф., Элой П., Дэвис Ф.П., Коркин Д., Пишо М. и др. (июнь 2004 г.). «Структурный взгляд на белок-белковые взаимодействия». Современное мнение в области структурной биологии . 14 (3): 313–324. дои : 10.1016/j.sbi.2004.04.006 . ПМИД 15193311 .
^ ван Дейк А.Д., Боеленс Р., Бонвин А.М. (январь 2005 г.). «Докинг на основе данных для изучения биомолекулярных комплексов». Журнал ФЭБС . 272 (2): 293–312. дои : 10.1111/j.1742-4658.2004.04473.x . hdl : 1874/336958 . ПМИД 15654870 . S2CID 20148856 .
^ «Структура жидких липидных бислоев» . Blanco.biomol.uci.edu. 10 ноября 2009 г. Проверено 9 октября 2019 г.
^ Экспериментальная система, бислои диолеоилфосфатидилхолина . Гидрофобная углеводородная область липида составляет ~ 30 Å (3,0 нм), что определено комбинацией методов рассеяния нейтронов и рентгеновских лучей; аналогично, полярная/межфазная область (глицерил, фосфат и фрагменты головной группы с их совместной гидратацией) составляет ~ 15 Å (1,5 нм) с каждой стороны , а общая толщина примерно равна углеводородной области. См. ссылки на SH White, предшествующие и последующие.
^ Винер MC, White SH (февраль 1992 г.). «Структура жидкого бислоя диолеоилфосфатидилхолина, определенная совместным уточнением данных рентгеновской и нейтронной дифракции. III. Полная структура» . Биофизический журнал . 61 (2): 434–447. Бибкод : 1992BpJ....61..434W . дои : 10.1016/S0006-3495(92)81849-0 . ПМЦ 1260259 . ПМИД 1547331 .
^ Размеры углеводородов варьируются в зависимости от температуры, механического напряжения, структуры PL и сокомпонентов и т. д. в пределах от однозначных до небольших двузначных процентов от этих значений. ^{[ нужна ссылка ]}
^ Герле С (июнь 2019 г.). «Очерк структуры биомембраны» . Журнал мембранной биологии . 252 (2–3): 115–130. дои : 10.1007/s00232-019-00061-w . ПМК 6556169 . ПМИД 30877332 .
^ Этаж Е (февраль 1970 г.). «Взаимодействие морфогенетических генов бактериофага Т4». Журнал молекулярной биологии . 47 (3): 293–306. дои : 10.1016/0022-2836(70)90303-7 . ПМИД 4907266 .
^ Снустад Д.П. (август 1968 г.). «Взаимодействия доминирования в клетках Escherichia coli, смешанно инфицированных бактериофагом T4D дикого типа и янтарными мутантами, и их возможные последствия в отношении типа функции гена-продукта: каталитическая или стехиометрическая». Вирусология . 35 (4): 550–63. дои : 10.1016/0042-6822(68)90285-7 . ПМИД 4878023 .
^ «Нобелевская премия по химии 2009» . Нобелевская премия . Нобелевская премия AB 2021 . Проверено 10 мая 2021 г.

Дальнейшее чтение

Общие отзывы

Уильямсон-младший (август 2008 г.). «Кооперативность в сборке макромолекул». Химическая биология природы . 4 (8): 458–465. дои : 10.1038/nchembio.102 . ПМИД 18641626 .
Перракис А., Мусаккио А., Кьюсак С., Петоза С. (август 2011 г.). «Исследование макромолекулярного комплекса: инструментарий методов». Журнал структурной биологии . 175 (2): 106–12. дои : 10.1016/j.jsb.2011.05.014 . ПМИД 21620973 .
Даффорн Т.Р. (январь 2007 г.). «Так как же узнать, что у вас есть макромолекулярный комплекс?» . Акта Кристаллографика. Раздел D. Биологическая кристаллография . 63 (Часть 1): 17–25. дои : 10.1107/S0907444906047044 . ПМЦ 2483502 . ПМИД 17164522 .
Вольгемут I, Ленц С, Урлауб Х (март 2015 г.). «Изучение стехиометрии макромолекулярных комплексов методом масс-спектрометрии на основе пептидов» . Протеомика . 15 (5–6): 862–79. дои : 10.1002/pmic.201400466 . ПМК 5024058 . ПМИД 25546807 .
Синха С., Арора К., Мун С.С., Ярлагадда С., Вудруфф К., Нарен А.П. (октябрь 2014 г.). «Резонансная передача энергии Фёрстера - подход к визуализации пространственно-временной регуляции образования макромолекулярных комплексов и передачи сигналов в разделенных клетках» . Biochimica et Biophysical Acta (BBA) – Общие предметы . 1840 (10): 3067–72. дои : 10.1016/j.bbagen.2014.07.015 . ПМЦ 4151567 . ПМИД 25086255 .
Берг Дж. М., Тимочко Дж., Страйер Л. (2002). Биохимия (5-е изд.). Нью-Йорк: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-4955-4 .
Ленинджер А.Л., Кокс М., Нельсон Д.Л. (2005). Ленингерские принципы биохимии (Четвертое изд.). Нью-Йорк: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-4339-2 .

Обзоры отдельных МА

Валле М (май 2011 г.). «Почти потеряно в переводе. Крио-ЭМ динамического макромолекулярного комплекса: рибосомы». Европейский биофизический журнал . 40 (5): 589–97. дои : 10.1007/s00249-011-0683-6 . ПМИД 21336521 . S2CID 26027815 .
Мони ТП (2017). «Каноническая инфламмасома: макромолекулярный комплекс, вызывающий воспаление». Макромолекулярные белковые комплексы . Субклеточная биохимия. Том. 83. стр. 43–73. дои : 10.1007/978-3-319-46503-6_2 . ISBN 978-3-319-46501-2 . ПМИД 28271472 .
Перино А., Гиго А., Дамилано Ф., Хирш Э. (август 2006 г.). «Идентификация макромолекулярного комплекса, ответственного за PI3Kgamma-зависимую регуляцию уровней цАМФ». Труды Биохимического общества . 34 (Часть 4): 502–3. дои : 10.1042/BST0340502 . ПМИД 16856844 .

Первоисточники

Ласкер К., Фёрстер Ф., Бон С., Вальцтхени Т., Вилла Е., Унвердорбен П. и др. (январь 2012 г.). «Молекулярная архитектура голокомплекса 26S протеасом, определенная интегративным подходом» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 109 (5): 1380–1387. Бибкод : 2012PNAS..109.1380L . дои : 10.1073/pnas.1120559109 . ПМК 3277140 . ПМИД 22307589 .
Рассел Д., Ласкер К., Уэбб Б., Веласкес-Мюриэль Дж., Чиое Э., Шнайдман-Духовны Д. и др. (январь 2012 г.). «Соединяем детали: программное обеспечение платформы интегративного моделирования для определения структуры макромолекулярных ансамблей» . ПЛОС Биология . 10 (1): e1001244. дои : 10.1371/journal.pbio.1001244 . ПМК 3260315 . ПМИД 22272186 .
Бархум С., Палит С., Йетирадж А. (май 2016 г.). «Диффузионные ЯМР-исследования образования макромолекулярных комплексов, скученности и удержания в мягких материалах». Прогресс в спектроскопии ядерного магнитного резонанса . 94–95: 1–10. дои : 10.1016/j.pnmrs.2016.01.004 . ПМИД 27247282 .

Другие источники

Нобелевские премии по химии (2012 г.), Нобелевская премия по химии 2009 г., Венкатраман Рамакришнан, Томас А. Стейц, Ада Э. Йонат, Нобелевская премия по химии 2009 г. , по состоянию на 13 июня 2011 г.
Нобелевские премии по химии (2012 г.), Нобелевская премия по химии 1982 г., Аарон Клуг, Нобелевская премия по химии 1982 г. , по состоянию на 13 июня 2011 г.

Внешние ссылки

Beck Group (2019), Структура и функции больших макромолекулярных ансамблей (домашняя страница группы Beck), Beck Group - Структура и функции больших молекулярных ансамблей - EMBL , по состоянию на 13 июня 2011 г.
Группа ДМА (2019), Динамика сборки макромолекул (домашняя страница Группы ДМА), Раздел «Динамика сборки макромолекул» | Национальный институт биомедицинской визуализации и биоинженерии , по состоянию на 13 июня 2011 г.

[Ban-1] Бан Н., Ниссен П., Хансен Дж., Мур П.Б., Стейц Т.А. (август 2000 г.). «Полная атомная структура большой субъединицы рибосомы с разрешением 2,4 А». Наука . 289 (5481): 905–920. Бибкод : 2000Sci...289..905B . CiteSeerX 10.1.1.58.2271 . дои : 10.1126/science.289.5481.905 . ПМИД 10937989 .

[2] МакКлюр В. «Субъединица рибосомы 50S» . Архивировано из оригинала 24 ноября 2005 г. Проверено 9 октября 2019 г.

[pmid16212506-3] Осборн А.Р., Рапопорт Т.А., ван ден Берг Б. (2005). «Транслокация белков по каналу Sec61/SecY». Ежегодный обзор клеточной биологии и биологии развития . 21 : 529–550. doi : 10.1146/annurev.cellbio.21.012704.133214 . ПМИД 16212506 .

[4] Легенда, обложка, J. Bacteriol., октябрь 2006 г. ^{[ нужна полная цитата ]}

[biomolecular_complex_protein_DNA_RNA_2005-5] Кляйнджунг Дж., Братья Ф. (июль 2005 г.). «POPSCOMP: автоматизированный анализ взаимодействия биомолекулярных комплексов» . Исследования нуклеиновых кислот . 33 (проблема с веб-сервером): W342–W346. дои : 10.1093/nar/gki369 . ПМК 1160130 . ПМИД 15980485 .

[Ribosome_macromolecular_device_2012_REVIEW-6] Мур П.Б. (2012). «Как нам следует относиться к рибосоме?». Ежегодный обзор биофизики . 41 (1): 1–19. doi : 10.1146/annurev-biophys-050511-102314 . ПМИД 22577819 .

[Trends_in_biochemical_sciences_2015-7] Нойман Н. (январь 2016 г.). «Сложный макромолекулярный комплекс» . Тенденции биохимических наук . 41 (1): 1–3. дои : 10.1016/j.tibs.2015.11.006 . ПМИД 26699226 .

[Structure_2005-8] Дутта С., Берман HM (март 2005 г.). «Большие макромолекулярные комплексы в Банке данных белков: отчет о состоянии» . Структура . 13 (3): 381–388. дои : 10.1016/j.str.2005.01.008 . ПМИД 15766539 .

[9] Рассел Р.Б., Альбер Ф., Элой П., Дэвис Ф.П., Коркин Д., Пишо М. и др. (июнь 2004 г.). «Структурный взгляд на белок-белковые взаимодействия». Современное мнение в области структурной биологии . 14 (3): 313–324. дои : 10.1016/j.sbi.2004.04.006 . ПМИД 15193311 .

[10] ван Дейк А.Д., Боеленс Р., Бонвин А.М. (январь 2005 г.). «Докинг на основе данных для изучения биомолекулярных комплексов». Журнал ФЭБС . 272 (2): 293–312. дои : 10.1111/j.1742-4658.2004.04473.x . hdl : 1874/336958 . ПМИД 15654870 . S2CID 20148856 .

[11] «Структура жидких липидных бислоев» . Blanco.biomol.uci.edu. 10 ноября 2009 г. Проверено 9 октября 2019 г.

[12] Экспериментальная система, бислои диолеоилфосфатидилхолина . Гидрофобная углеводородная область липида составляет ~ 30 Å (3,0 нм), что определено комбинацией методов рассеяния нейтронов и рентгеновских лучей; аналогично, полярная/межфазная область (глицерил, фосфат и фрагменты головной группы с их совместной гидратацией) составляет ~ 15 Å (1,5 нм) с каждой стороны , а общая толщина примерно равна углеводородной области. См. ссылки на SH White, предшествующие и последующие.

[13] Винер MC, White SH (февраль 1992 г.). «Структура жидкого бислоя диолеоилфосфатидилхолина, определенная совместным уточнением данных рентгеновской и нейтронной дифракции. III. Полная структура» . Биофизический журнал . 61 (2): 434–447. Бибкод : 1992BpJ....61..434W . дои : 10.1016/S0006-3495(92)81849-0 . ПМЦ 1260259 . ПМИД 1547331 .

[14] Размеры углеводородов варьируются в зависимости от температуры, механического напряжения, структуры PL и сокомпонентов и т. д. в пределах от однозначных до небольших двузначных процентов от этих значений. ^{[ нужна ссылка ]}

[15] Герле С (июнь 2019 г.). «Очерк структуры биомембраны» . Журнал мембранной биологии . 252 (2–3): 115–130. дои : 10.1007/s00232-019-00061-w . ПМК 6556169 . ПМИД 30877332 .

[pmid4907266-16] Этаж Е (февраль 1970 г.). «Взаимодействие морфогенетических генов бактериофага Т4». Журнал молекулярной биологии . 47 (3): 293–306. дои : 10.1016/0022-2836(70)90303-7 . ПМИД 4907266 .

[pmid4878023-17] Снустад Д.П. (август 1968 г.). «Взаимодействия доминирования в клетках Escherichia coli, смешанно инфицированных бактериофагом T4D дикого типа и янтарными мутантами, и их возможные последствия в отношении типа функции гена-продукта: каталитическая или стехиометрическая». Вирусология . 35 (4): 550–63. дои : 10.1016/0042-6822(68)90285-7 . ПМИД 4878023 .

[18] «Нобелевская премия по химии 2009» . Нобелевская премия . Нобелевская премия AB 2021 . Проверено 10 мая 2021 г.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

[18]