Его тег
Полигистидиновая метка , наиболее известная под торговым названием His-tag , представляет собой аминокислотный мотив в белках , который обычно состоит как минимум из шести остатков гистидина ( His ), часто на N- или C-конце белка. Он также известен как гекса-гистидин-тег , 6xHis-тег или тег His6 . Бирку изобрела компания Roche . [1] хотя использование гистидинов и их векторов распространяется Qiagen . Различные наборы для очистки белков, меченных гистидином, коммерчески доступны от многих компаний. [2]
Общее количество остатков гистидина в метке может варьироваться от двух до 10 и более остатков His. За N- или C-концевыми His-метками также может следовать или предшествовать им соответственно подходящая аминокислотная последовательность , которая облегчает удаление полигистидиновой метки с помощью эндопептидаз . Эта дополнительная последовательность не является необходимой, если экзопептидазы для удаления N-концевых His-меток используются (например, Qiagen TAGZyme). Кроме того, расщепление экзопептидазой может решить проблему неспецифического расщепления, наблюдаемую при использовании удаления метки на основе эндопротеазы. Полигистидиновые метки часто используются для аффинной очистки генетически модифицированных белков.
Принцип
[ редактировать ]
Белки могут координировать ионы металлов на своей поверхности, и разделить белки можно с помощью хроматографии, используя разницу в их сродстве к ионам металлов. Это называется аффинной хроматографией с иммобилизованными ионами металлов (IMAC), которая первоначально была введена в 1975 году под названием аффинная хроматография с хелатами металлов. [3] Последующие исследования показали, что среди аминокислот, входящих в состав белков, гистидин активно участвует в координационном комплексе с ионами металлов. [4] Следовательно, если к концу белка добавить некоторое количество гистидинов, сродство белка к иону металла увеличится, и это можно использовать для селективного выделения интересующего белка. Когда белок с His-меткой приводится в контакт с носителем, на котором иммобилизован ион металла, такого как никель, остаток гистидина хелатирует ион металла и связывается с носителем. Поскольку другие белки не связываются с носителем или связываются очень слабо, их можно удалить, промыв носитель соответствующим буфером. Белок, меченный полигистидином, затем можно выделить путем элюирования его со смолы. [5]
Практичный выбор
[ редактировать ]Длина тега
[ редактировать ]
Полигистидиновые метки чаще всего состоят из шести остатков гистидина. Метки, содержащие до двенадцати остатков гистидина, или двойные метки, прикрепленные через короткий линкер, не являются редкостью и могут улучшить результаты очистки за счет усиления связывания с аффинной смолой, что позволяет повысить строгость промывки и отделения от эндогенных белков. [6] [7] [8] Метку можно добавить к интересующему гену, используя методы, общие для большинства меток очистки . Самый простой метод — субклонировать интересующий ген в вектор, содержащий последовательность полигистидиновой метки. Многие векторы для использования с различными системами экспрессии доступны с полигистидиновыми метками в различных положениях и с разными сайтами протеазного расщепления, другими метками т.д. и [9] Однако если подходящий вектор недоступен или метку необходимо вставить в место, отличное от N- или C-конца белков, интересующий ген может быть либо напрямую синтезирован, содержащий последовательность полигистидиновой метки, либо различные методы, основанные на ПЦР. могут быть использованы использоваться для добавления метки к гену. Распространенный подход заключается в добавлении кодирующей последовательности полигистидиновой метки к праймерам ПЦР в качестве выступающего выступа. [10] [11]
Позиция тега
[ редактировать ]Чаще всего полигистидиновая метка сливается с N-концом или С-концом белка и прикрепляется через короткий гибкий линкер, который может содержать сайт расщепления протеазой. [10] [9] Реже метки могут быть добавлены как к N-, так и к C-концам или вставлены в промежуточную часть белка, например, в открытую петлю. [12] [8] Выбор положения метки зависит от свойств каждого белка и выбранной стратегии очистки; может потребоваться протестировать несколько конструкций с тегом в разных позициях. [6] [10] Хотя считается, что полигистидиновые метки обычно не изменяют свойства белка, было продемонстрировано, что добавление метки может вызвать нежелательные эффекты, такие как влияние на олигомерное состояние белка. [13]
Несущие матрицы
[ редактировать ]На рынке имеются различные матрицы-носители, связанные с твердым полимерным носителем, которые впоследствии можно заряжать катионом металла. производные иминодиуксусной кислоты (ИДК) и нитрилотриуксусной кислоты (НТК) , причем разные матрицы имеют определенные преимущества и недостатки для различных применений. Для этой цели чаще всего используются [14]
Ионы металлов
[ редактировать ]Катионы некоторых металлов обладают высоким сродством к имидазолу, функциональной группе His-метки. Двухвалентный катион М 2+ (M = Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zi и т. д. ) имидазольные комплексы переходных металлов для этой цели чаще всего используют . Выбор катиона обычно представляет собой компромисс между связывающей способностью и чистотой. Никель часто используется, поскольку он обеспечивает хороший баланс между этими факторами, тогда как кобальт можно использовать, когда желательно повысить чистоту очистки, поскольку он имеет меньшее сродство к эндогенным белкам; однако связывающая способность ниже по сравнению с никелем. [14] [10]
Метод элюирования
[ редактировать ]Для элюирования белка, меченного His, с носителя существует несколько потенциальных методов, которые при необходимости можно использовать в комбинации. Чтобы избежать денатурации белков, обычно желательно использовать как можно более мягкий метод.
- Конкуренция с аналогами
Для высвобождения His-меченного белка из носителя используют соединение, имеющее структуру, аналогичную His-метке и также образующую координационный комплекс с иммобилизованными ионами металлов. Такое соединение, добавленное к белку, меченному His, на носителе конкурирует с белком за иммобилизованные ионы металлов. Соединение, добавленное в высокой концентрации, заменяет практически весь связанный с носителем белок, который таким образом элюируется с носителя. Имидазол представляет собой боковую цепь гистидина и обычно используется для элюирования в концентрации 150–500 мМ. Также можно использовать гистидин или гистамин.
- Снижение pH
Когда pH снижается, остаток гистидина протонируется и больше не может координировать металлическую метку, что позволяет белку элюироваться. Когда в качестве иона металла используется никель, он элюируется при pH около 4, а кобальт - при pH около 6.
- Удаление ионов металлов
При добавлении сильного хелатирующего агента, такого как ЭДТА, белок отделяется от носителя, поскольку ион металла, иммобилизованный на носителе, теряется.
Приложения
[ редактировать ]Очистка белка
[ редактировать ]Полигистидиновые метки часто используются для аффинной очистки рекомбинантных белков, меченных полигистидином, экспрессируемых в Escherichia coli или других системах экспрессии. Обычно клетки собирают центрифугированием и полученный клеточный осадок лизируют либо физическими средствами, либо с помощью детергентов и ферментов, таких как лизоцим , или любой их комбинации. На этом этапе лизат содержит рекомбинантный белок среди многих эндогенных белков, происходящих из клеток-хозяев. Лизат подвергается воздействию аффинной смолы, связанной с матрицей-носителем, связанной с двухвалентным катионом, либо путем прямого добавления смолы (периодическое связывание), либо путем пропускания через слой смолы в формате колонки. Затем смолу промывают буфером для удаления белков, которые специфически не взаимодействуют со связанным катионом, и интересующий белок элюируют со смолы с использованием буфера, содержащего высокую концентрацию имидазола или пониженный pH. Чистоту и количество белка можно оценить такими методами, как SDS-PAGE и вестерн-блоттинг. . [14] [10] [15]
Аффинная очистка с использованием полигистидиновой метки обычно приводит к получению относительно чистого белка. Чистоту белка можно повысить добавлением низкой (20-40 мМ) концентрации имидазола к связывающему и/или промывочному буферу. Однако, в зависимости от требований последующего применения, дальнейшие этапы очистки с использованием таких методов, как ионообменная или эксклюзионная могут потребоваться хроматография. Смолы IMAC обычно сохраняют в качестве примесей несколько видных эндогенных белков. Например, в E. coli ярким примером является пептидилпролиизомераза FKBP-типа, которая появляется при массе около 25 кДа на SDS-PAGE . Эти примеси можно удалить с помощью дополнительных стадий очистки или путем экспрессии рекомбинантного белка в дефицитном штамме клеток. Альтернативно можно использовать смолы IMAC с кобальтом, которые имеют меньшее сродство к эндогенным белкам. [16] [10] [14] [17]
Анализы связывания
[ редактировать ]Метка полигистидином может использоваться для обнаружения белок-белковых взаимодействий таким же образом, как и анализ с понижением уровня . Метка полигистидином имеет несколько преимуществ перед другими метками, обычно используемыми для анализов с понижением уровня, включая небольшой размер, небольшое количество встречающихся в природе белков, связывающихся с матрицами-носителями, и повышенную стабильность матрицы-носителя по сравнению с матрицами моноклональных антител. [18]
Флуоресцентные метки
[ редактировать ]Были разработаны гексахистадиновые метки CyDye, в которых используется ковалентная ковалентная координация никеля с группами ЭДТА, прикрепленными к флуорофорам, для создания красителей, которые прикрепляются к полигистидиновой метке. Было показано, что этот метод полезен для отслеживания миграции и перемещения белков и может быть эффективен для измерения расстояния посредством резонансной передачи энергии Фёрстера . [19]
Фторгистидиновые метки
[ редактировать ]Сообщалось, что полифторгистидиновая метка может использоваться в системах трансляции in vitro . [20] В этой системе используется расширенный генетический код , в котором гистидин заменен на 4-фторгистидин. Фторированный аналог включается в пептиды за счет ослабленной субстратной специфичности лигазы гистидин-тРНК и снижает общую рК а метки. Это позволяет избирательно обогащать пептиды, меченные полифторгистидином, в присутствии сложных смесей традиционных полигистидиновых меток путем изменения pH промывочных буферов. [ нужна ссылка ]
Обнаружение
[ редактировать ]Полигистидиновую метку также можно использовать для обнаружения белка с помощью антител против полигистидиновой метки , что может быть полезно для субклеточной локализации , ELISA , вестерн-блоттинга и других иммуноаналитических методов. Альтернативно, для обнаружения белка, меченного полигистидином, можно использовать внутригельное окрашивание гелей SDS-PAGE или нативного PAGE флуоресцентными зондами, несущими ионы металлов. [21]
Похожие теги
[ редактировать ]тег штаб-квартиры
[ редактировать ]Метка HQ содержит чередующиеся гистидин и глутамин (HQHQHQ).
день привета
[ редактировать ]Метка HN содержит чередующиеся гистидин и аспарагин (HNHNHNHNHNHN) и с большей вероятностью будет представлена на поверхности белка, чем метки, содержащие только гистидин. Метка HN связывается с иммобилизованным ионом металла более эффективно, чем метка His. [22]
ЕСТЬ день
[ редактировать ]Метка HAT представляет собой пептидную метку (KDHLIHNVHKEEHAHAHNK), полученную из лактатдегидрогеназы курицы , и, скорее всего, представляет собой растворимый белок без смещения в распределении заряда по сравнению с меткой His. [23] Расположение гистидинов в метке HAT обеспечивает большую доступность по сравнению с меткой His и эффективно связывается с иммобилизованным ионом металла.
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Хочули Э., Баннварт В., Дёбели Х., Генц Р., Штюбер Д. (1988). «Генетический подход к облегчению очистки рекомбинантных белков с помощью нового металлхелатного адсорбента». Био/Технологии . 6 (11): 1321–5. дои : 10.1038/nbt1188-1321 . S2CID 9518666 . ИНИСТ 7229670 .
- ^ Использование тега академическими пользователями не было ограничено; однако коммерческие пользователи были вынуждены платить гонорары компании «Рош» . Срок действия оригинального патента истек 11 февраля 2003 г., и теперь он является государственной собственностью; нынешние претензии на роялти основаны на гораздо более узком наборе более поздних патентов. Подходящие последовательности тегов доступны бесплатно для коммерческого использования.
- ^ Порат Дж., Карлссон Дж., Олссон И., Белфраж Дж. (декабрь 1975 г.). «Металлохелатная аффинная хроматография, новый подход к фракционированию белков». Природа . 258 (5536): 598–599. Бибкод : 1975Natur.258..598P . дои : 10.1038/258598a0 . ПМИД 1678 . S2CID 4271836 .
- ^ Порат Дж. (август 1992 г.). «Аффинная хроматография с иммобилизованными ионами металлов». Экспрессия и очистка белков . 3 (4): 263–281. дои : 10.1016/1046-5928(92)90001-D . ПМИД 1422221 .
- ^ «His-tag: вечный стандарт очистки белков» . Сайт биотехнологических знаний Cube . Архивировано из оригинала 15 декабря 2021 года . Проверено 2 декабря 2021 г.
- ^ Jump up to: а б Моханти А.К., Винер MC (февраль 2004 г.). «Экспрессия и производство мембранных белков: влияние длины и положения полигистидиновой метки». Экспрессия и очистка белков . 33 (2): 311–325. дои : 10.1016/j.pep.2003.10.010 . ПМИД 14711520 .
- ^ Грисшаммер Р., Такер Дж. (октябрь 1997 г.). «Количественная оценка очистки рецепторов нейротензина с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованными металлами». Экспрессия и очистка белков . 11 (1): 53–60. дои : 10.1006/prep.1997.0766 . ПМИД 9325139 .
- ^ Jump up to: а б Хан Ф., Хе М., Тауссиг М.Дж. (май 2006 г.). «Двойная гексагистидиновая метка с высоким сродством связывания для иммобилизации, очистки и обнаружения белков на поверхностях нитрилотриуксусной кислоты». Аналитическая химия . 78 (9): 3072–3079. дои : 10.1021/ac060184l . ПМИД 16642995 .
- ^ Jump up to: а б Сингх М.И., Джайн В. (15 мая 2013 г.). «Мечение экспрессированного белка 6 гистидинами: быстрое клонирование ампликона с тремя вариантами» . ПЛОС ОДИН . 8 (5): e63922. Бибкод : 2013PLoSO...863922S . дои : 10.1371/journal.pone.0063922 . ПМЦ 3655076 . ПМИД 23691118 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж Борнхорст Дж.А., Фальке Дж.Дж. (1 января 2000 г.). «Очистка белков с использованием полигистидиновых аффинных меток». Применение химерных генов и гибридных белков. Часть A: Экспрессия генов и очистка белков . Методы энзимологии. Том. 326. Академик Пресс. стр. 245–254. дои : 10.1016/s0076-6879(00)26058-8 . ISBN 978-0-12-182227-9 . ПМК 2909483 . ПМИД 11036646 .
- ^ Хьюз Р.А., Эллингтон AD (январь 2017 г.). «Синтез и сборка синтетической ДНК: использование синтетического в синтетической биологии» . Перспективы Колд-Спринг-Харбор в биологии . 9 (1): а023812. doi : 10.1101/cshperspect.a023812 . ПМК 5204324 . ПМИД 28049645 .
- ^ Пол Д.М., Бейрон Ф., Сешнс Р.Б., Бранкаччо А., Биготти М.Г. (февраль 2016 г.). «Внутреннее (His)₆-мечение обеспечивает полнофункциональный гетероолигомерный шаперонин класса II с высоким выходом» . Научные отчеты . 6 (1): 20696. Бибкод : 2016NatSR...620696P . дои : 10.1038/srep20696 . ПМЦ 4746591 . ПМИД 26856373 .
- ^ Майорек К.А., Кун М.Л., Хрущ М., Андерсон В.Ф., Минор В. (октябрь 2014 г.). «Двойная проблема: выбор буфера и присутствие His-метки могут быть причиной невоспроизводимости биомедицинских экспериментов» . Белковая наука . 23 (10): 1359–1368. дои : 10.1002/pro.2520 . ПМК 4286991 . ПМИД 25044180 .
- ^ Jump up to: а б с д Ригеро В., Клиффорд Р., Доули М., Диксон М., Гастфренд Б., Томпсон С. и др. (октябрь 2020 г.). «Оптимизация аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом для белков, меченных полигистидином» . Журнал хроматографии А. 1629 : 461505. doi : 10.1016/j.chroma.2020.461505 . ПМИД 32861092 . S2CID 221373404 .
- ^ Хенген П. (июль 1995 г.). «Очистка слитых белков His-Tag из Escherichia coli». Тенденции биохимических наук . 20 (7): 285–286. дои : 10.1016/S0968-0004(00)89045-3 . ПМИД 7667882 .
- ^ Чен X, Номани А, Патель Н, Хатефи А (июнь 2017 г.). «Производство низкоэкспрессирующих рекомбинантных катионных биополимеров высокой чистоты» . Экспрессия и очистка белков . 134 : 11–17. дои : 10.1016/j.pep.2017.03.012 . ПМЦ 5479735 . ПМИД 28315745 .
- ^ Андерсен КР, Лекса НК, Шварц ТУ (ноябрь 2013 г.). «Оптимизированный экспрессирующий штамм E. coli LOBSTR устраняет распространенные примеси при очистке His-меткой» . Белки . 81 (11): 1857–1861. дои : 10.1002/prot.24364 . ПМК 4086167 . ПМИД 23852738 .
- ^ Луш А., Сальседо С.П., Биго С. (2017), Журне Л., Каскалес Э (ред.), «Белко-белковые взаимодействия: анализы с понижением» , «Системы секреции бактериального белка: методы и протоколы» , «Методы молекулярной биологии», том. 1615, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Springer, стр. 247–255, doi : 10.1007/978-1-4939-7033-9_20 , ISBN. 978-1-4939-7033-9 , PMID 28667618 , получено 8 июня 2023 г.
- ^ Чжао С., Хеллман Л.М., Чжан Икс, Боуман В.С., Уайтхарт С.В., Фрид М.Г. (апрель 2010 г.). «Оптические зонды, специфичные для гексагистидиновых меток, для анализа белков и их взаимодействий» . Аналитическая биохимия . 399 (2): 237–245. дои : 10.1016/j.ab.2009.12.028 . ПМЦ 2832190 . ПМИД 20036207 .
- ^ Ринг СМ, Икбал Э.С., Хакер Д.Э., Хартман М.К., Кропп Т.А. (май 2017 г.). «Генетическое включение 4-фторгистидина в пептиды обеспечивает селективную аффинную очистку» . Органическая и биомолекулярная химия . 15 (21): 4536–4539. дои : 10.1039/C7OB00844A . ПМК 6010304 . ПМИД 28517015 .
- ^ Радукану В.С., Исайоглу И., Радукану Д.В., Мерзабан Ж.С., Хамдан С.М. (август 2020 г.). «Упрощенное обнаружение меченных полигистидином белков в гелях и мембранах с использованием УФ-возбудимого красителя и пары головок с несколькими хелаторами» . Журнал биологической химии . 295 (34): 12214–12223. дои : 10.1074/jbc.ra120.014132 . ПМЦ 7443479 . ПМИД 32647010 .
- ^ US 7176298 , Чага Г.С., Джохадзе Г.Г., «Полинуклеотиды, кодирующие пептиды, обладающие сродством к ионам металлов, и родственные продукты», выданный 13 февраля 2007 г., передан Takara Bio USA Inc.
- ^ Чага Г., Бочкарев Д.Е., Джохадзе Г.Г., Хопп Дж., Нельсон П. (декабрь 1999 г.). «Природная полигистидиновая аффинная метка для очистки рекомбинантных белков на агарозе, сшитой кобальтом (II)-карбоксиметиласпартатом». Журнал хроматографии А. 864 (2): 247–256. дои : 10.1016/S0021-9673(99)01008-0 . ПМИД 10669292 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Колонка сродства Ni - NTA (Архив Общества белковых наук № 019/статья на японском языке)