Вмешательство CRISPR

Интерференция CRISPR ( CRISPRI )-это метод генетического возмущения, который позволяет последовательно специфическая репрессия экспрессии генов в прокариотических и эукариотических клетках. ^{[ 1 ]} Впервые он был разработан Стэнли Ци и коллегами в лабораториях Венделла Лим , Адама Аркина, Джонатана Вайсмана и Дженнифер Дудны . ^{[ 2 ]} Специфичная активация экспрессии генов относится к активации CRISPR (CRISPRA) .

Основано на бактериальной генетической иммунной системе - CRISPR (кластеризированный регулярно межсеплеевые палиндромные повторения), ^{[ 3 ]} Техника обеспечивает дополнительный подход к интерференции РНК . Разница между Crispri и RNAi, тем не менее, заключается в том, что Crispri регулирует экспрессию генов главным образом на уровне транскрипции, в то время как RNAi контролирует гены на уровне мРНК.

Фон

Многие бактерии и большинство архей имеют адаптивную иммунную систему, которая включает в себя гены CRISPR РНК (CRRNA) и гены, связанные с CRISPR (CAS).

Техника вмешательства CRISPR (CRISPRI) впервые сообщила Лей С. Ци и исследователи в Калифорнийском университете в Сан -Франциско в начале 2013 года. ^{[ 2 ]} Технология использует каталитически мертвый белок CAS9 (обычно обозначаемый как DCAS9), которому не хватает эндонуклеазной активности для регуляции генов, управляемым РНК. Специфичность нацеливания определяется дополнительным основанием-папением одной направляющей РНК (SGRNA) в геномный локус. SGRNA представляет собой химерную некодирующую РНК, которая может быть разделена на три области: последовательность основной пары с базой 20 нт, шпилька DCAS9 NT DCAS9 и терминатор 40 нт (бактерии, ^{[ 4 ]} ^{[ 5 ]} ^{[ 6 ]} дрожжи, ^{[ 7 ]} фруктовые мухи, ^{[ 8 ]} данио, ^{[ 9 ]} мыши ^{[ 10 ]}).

При проектировании синтетической SgrNA модифицируется только последовательность базовой пары 20 NT. Также необходимо рассмотреть вторичные переменные: эффекты нецелевого уровня (для которого требуется простой взрыв последовательности базовой пары), поддержание DCAS9-связывающей структуры шпильки и обеспечение того, чтобы в модифицированной SGRNA не присутствовало никаких мест ограничения. Поскольку это может представлять проблему на этапах клонирования вниз по течению. Из-за простоты дизайна SGRNA эта технология поддается масштабированию всего генома. ^{[ 11 ]} Crispri полагается на поколение каталитического неактивного CAS9. Это достигается путем введения точечных мутаций в двух каталитических остатков (D10A и H840A) гена, кодирующего CAS9. ^{[ 12 ]} При этом DCAS9 не может расщеплять дцДНК, но сохраняет способность нацелиться на ДНК. Вместе SGRNA и DCAS9 представляют собой минимальную систему для специфичной для генов регуляции. ^{[ 2 ]}

Транскрипционная регуляция

Репрессия

Crispri может стерически репрессировать транскрипцию , блокируя либо транскрипционную инициацию, либо удлинение. Это достигается путем разработки SGRNA, дополненной промотору или экзоническим последовательностям. Уровень транскрипционной репрессии с мишенью в кодирующей последовательности зависит от цепи. В зависимости от природы эффектора CRISPR, либо шаблон, либо неэлементная прядь приводит к более сильным репрессиям. ^{[ 13 ]} Для DCAS9 (на основе системы CRISPR типа) репрессия сильнее, когда руководящая РНК дополняет неэлементную прядь. Было высказано предположение, что это связано с активностью геликазы, которая разматывает РНК: гетеродуплекс ДНК перед РНК Pol II , когда Sgrna дополняет шаблон. В отличие от блока удлинения транскрипции, молчание не зависит от целевой цепи ДНК при нацеливании на сайт начала транскрипции. У прокариот это стерическое ингибирование может подавлять транскрипцию гена -мишени почти на 99,9%; В археи было достигнуто более 90% репрессий; ^{[ 14 ]} В клетках человека наблюдалось до 90% репрессии. ^{[ 2 ]} У бактерий можно насытить мишень достаточно высоким уровнем комплекса DCAS9. В этом случае сила репрессии зависит только от вероятности того, что DCAS9 выброшен при столкновении с РНК -полимеразой, которая определяется направляющей последовательности. ^{[ 15 ]} Более высокие температуры также связаны с более высокой вероятностью выброса, таким образом, более слабые репрессии. ^{[ 15 ]} У эукариот Crispri также может подавлять транскрипцию через эффекторный домен. Слияние домена репрессора с DCAS9 позволяет дополнительно подавлять транскрипцию путем индукции гетерохроматинизации. Например, хорошо изученный домен , связанный с Krüppel Box (KRAB), может быть слит с DCAS9 для подавления транскрипции целевого гена до 99% в клетках человека. ^{[ 16 ]}

Улучшения эффективности

В то время как редактирование генома каталитически активной нуклеазой CAS9 может сопровождаться необратимыми геномическими изменениями вне цели, CRISPRI очень специфична с минимальными обратимыми эффектами, не связанными с целью для двух различных последовательностей SgRNA. ^{[ 16 ]} Тем не менее, было разработано несколько методов для повышения эффективности транскрипционной модуляции. Идентификация начального сайта транскрипции гена -мишени и рассмотрение предпочтений SGRNA повышает эффективность, как и наличие доступного хроматина на месте -целевом участке. ^{[ 17 ]}

Другие методы

Наряду с другими упомянутыми улучшениями , такие факторы, как расстояние от начала транскрипции и состояние локального хроматина, могут быть критическими параметрами при определении эффективности активации/репрессии. Оптимизация экспрессии DCAS9 и SgRNA, стабильности, ядерной локализации и взаимодействия, вероятно, позволит повысить повышение эффективности CRISPRI в клетках млекопитающих. ^{[ 2 ]}

Приложения

Нокдаун гена

Было показано, что значительная часть генома (как репортерных, так и эндогенных генов) у эукариот является нацеливаемой с использованием лентивирусных конструкций для экспрессии DCAS9 и SGRNAS, с сопоставимой эффективностью с существующими методами, такими как RNAi и сказочные белки. ^{[ 16 ]} В тандеме или в качестве собственной системы Crispri может использоваться для достижения тех же приложений , что и в RNAi.

Для бактерий, нокдаун генов Crispri был полностью реализован и охарактеризован (анализ вне цели, протекающая репрессия) для обоих грамотрицательных E. coli ^{[ 4 ]}^{[ 6 ]} и граммаположительный B. subtilis . ^{[ 5 ]}

Не только у бактерий, но и в археи (например, M. acetivorans ) Crispri-Cas9 был успешно использован для нокдауна нескольких генов/оперонов, связанных с фиксацией азота. ^{[ 14 ]}

Аллельский сериал

Дифференциальная экспрессия генов может быть достигнута путем изменения эффективности основания SgrNA в локусы-мишени. ^{[ 11 ]} Теоретически, модулирование этой эффективности можно использовать для создания аллельной серии для любого данного гена, по сути, создавая набор гипо- и гиперморфов. Эти мощные коллекции могут быть использованы для исследования любого генетического исследования. Для гипоморфов это позволяет постепенно снижать функцию генов в отличие от бинарной природы нокаутов генов и непредсказуемости нокдаун. Для гиперморфов это в отличие от обычного метода клонирования интересующего гена у промоторов с переменной силой.

Геном локусы визуализации

Слияние флуоресцентного белка с DCAS9 позволяет представлять визуализацию геномных локусов в живых клетках человека. ^{[ 18 ]} По сравнению с флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH) метод уникально позволяет динамическое отслеживание локусов хромосом. Это использовалось для изучения динамики архитектуры хроматина и ядерной организации в лабораторных клеточных линиях, включая клетки HeLa.

Стволовые клетки

Активация факторов Yamanaka с помощью Crispra была использована для индукции плюрипотентности в клетках человека и мыши, обеспечивающих альтернативный метод технологии IPS. ^{[ 19 ]}^{[ 20 ]} Кроме того, крупномасштабные экраны активации могут быть использованы для идентификации белков, которые способствуют индуцированной плюрипотентности или, наоборот, способствуют дифференциации к конкретной клеточной линии. ^{[ 21 ]}

Генетический скрининг

Способность повысить регулировать экспрессию генов с использованием DCAS9-Suntag с помощью одной SGRNA также открывает дверь для крупномасштабных генетических экранов, таких как возмущение , чтобы раскрыть фенотипы, которые являются результатом повышенной или снижения экспрессии генов, которые будут особенно важны для понимания Влияние регуляции генов при раке. ^{[ 22 ]} Кроме того, было показано, что системы CRISPRI переносятся с помощью горизонтальных механизмов переноса генов, таких как конъюгация бактерий и специфическая репрессия репортерных генов в клетках реципиентов. Crispri может служить инструментом для генетического скрининга и потенциально контроля бактериальной популяции. ^{[ 23 ]}

Преимущества и ограничения

Преимущества

Crispri может заставить замолчать целевой ген, представляющий интерес, до 99,9% репрессий. ^{[ 11 ]} Сила репрессии также может быть настроена путем изменения количества взаимодополняемости между направляющей РНК и целью. В отличие от индуцибельных промоторов, частичная репрессия Crispri не добавляет транскрипционного шума к выражению цели. ^{[ 15 ]} Поскольку уровень репрессии кодируется в последовательности ДНК, различные уровни экспрессии могут быть выращены в конкуренции и идентифицированы путем секвенирования. ^{[ 24 ]}
Поскольку Crispri основана на основе SGRNA-DNA Watson-Cric, и мотива NGG PAM, выбор целевых сайтов в геноме прост и гибкий. Тщательно определенные протоколы были разработаны. ^{[ 11 ]}
Несколько SgrNAs могут быть использованы не только для одновременного управления несколькими различными генами (мультиплексные crispri), но и для повышения эффективности регуляции одной и той же генной мишени. Популярная стратегия, направленная на то, чтобы одновременно выразить многие SGRNAS состоит в том, чтобы привести SGRNAS в одной конструкции с несколькими промоутерами или элементами обработки. Например, очень длинные массивы SgrNA (ELSAS) используют неконтерооборотные части, чтобы обеспечить прямой синтез 12-SgRNA массивов от поставщика синтеза генов, может быть непосредственно интегрирован в геном E. coli без гомологичной рекомбинации и может одновременно нацелиться на многие гены для достижения сложных фенотипов. ^{[ 25 ]}
В то время как две системы могут быть дополнительными, Crispri обеспечивает преимущества по сравнению с RNAI. Как экзогенная система, Crispri не конкурирует с эндогенным механизмом, таким как экспрессия или функция микроРНК. Кроме того, поскольку Crispri действует на уровне ДНК, можно нацелить транскрипты, такие как некодирующие РНК, микроРНК, антисмысловые транскрипты, локализованные ядерные РНК и транскрипты полимеразы III. Наконец, Crispri обладает гораздо большим целевым пространством последовательностей; Промоутеры и, теоретически, интроны также могут быть нацелены. ^{[ 16 ]}
В E. coli конструкция штамма нокдауна гена является чрезвычайно быстрой и требует только одного шага -рекомбинерирования олиго . ^{[ 6 ]}

Ограничения

Требование последовательности смежного мотива протоспацера (PAM) ограничивает количество потенциальных целевых последовательностей. CAS9 и его гомологи могут использовать различные последовательности PAM и, следовательно, теоретически могут использоваться для расширения количества потенциальных целевых последовательностей. ^{[ 11 ]}
Специфичность последовательности для локусов -мишеней составляет всего 14 нт длиной (12 нт Sgrna и 2nt PAM), которые могут повторяться около 11 раз в геноме человека. ^{[ 11 ]} Репрессия обратно коррелирует с расстоянием целевого сайта от начального участка транскрипции. Вычислительные прогнозы по всему геному или выбор гомологов CAS9 с более длинной ПАМ могут снизить неспецифическое нацеливание.
Эндогенные состояния хроматина и модификации могут предотвратить специфическое связывание последовательности комплекса DCAS9-SGRNA. ^{[ 11 ]} Уровень транскрипционной репрессии в клетках млекопитающих варьируется между генами. Необходимо много работы, чтобы понять роль местной конформации ДНК и хроматина в отношении связывания и регуляторной эффективности.
Crispri может влиять на гены, которые находятся в непосредственной близости от гена -мишени. Это особенно важно при нацеливании генов, которые либо перекрывают другие гены (смысл или антисмысловые перекрытия), либо обусловлены двунаправленным промотором. ^{[ 26 ]}
Специфичная последовательность токсичности сообщалась у эукариот, с некоторыми последовательностями в Пэм-проксимальной области, вызывая большой бремя физической подготовки. ^{[ 27 ]} Это явление, называемое «плохим эффектом семян», все еще необъяснимо, но может быть уменьшено путем оптимизации уровня экспрессии DCAS9. ^{[ 28 ]}

Ссылки

^ Jensen OF, Mikelsen NS, Gao Z, Fouselteder J, Pabst G, Axelgaard E, et al. (Ноябрь 2021 г.). «Целевая регуляция транспрессии в первичных клетках USPRA и Crispri » Geome Research 31 (11): 2120–2 Doi : 10.1101/ gr.275607.1 PMC 8559706 . 34407984PMID
^ Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} ^и Ци Л.С., Ларсон М.Х., Гилберт Л.А., Доудна Дж.А., Вайсман Дж.С., Аркин А.П., Лим Ва (февраль 2013 г.). «Перепрофилирование CRISPR в качестве РНК-платформы для специфической для последовательности контроля экспрессии генов» . Клетка . 152 (5): 1173–1183. doi : 10.1016/j.cell.2013.02.022 . PMC 3664290 . PMID 23452860 .
^ Баррунгу Р., Фримо С., Дево Х., Ричардс М., Бойавал П., Моино С. и др. (Март 2007 г.). «CRISPR обеспечивает приобретенную устойчивость к вирусам у прокариот». Наука . 315 (5819): 1709–1712. Bibcode : 2007sci ... 315.1709b . doi : 10.1126/science.1138140 . HDL : 20.500.11794/38902 . PMID 17379808 . S2CID 3888761 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} Цзян В., Бикард Д., Кокс Д., Чжан Ф., Марраффини Л.А. (март 2013 г.). «Редакция бактериальных геномов с РНК с использованием систем CRISPR-CAS» . Nature Biotechnology . 31 (3): 233–239. doi : 10.1038/nbt.2508 . PMC 3748948 . PMID 23360965 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} Peters JM, Colavin A, Shi H, Czarny TL, Larson MH, Wong S, et al. (Июнь 2016 г.). «Комплексный функциональный анализ основных генов на основе CRISPR» . Клетка . 165 (6): 1493–1506. doi : 10.1016/j.cell.2016.05.003 . PMC 4894308 . PMID 27238023 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} ^в Li XT, Jun Y, Erickstad MJ, Brown SD, Parks A, Court DL, Jun S (декабрь 2016 г.). «Tcrispri: настраиваемая и обратимая, одноступенчатая контроль экспрессии генов» . Научные отчеты . 6 : 39076. Bibcode : 2016natsr ... 639076L . doi : 10.1038/srep39076 . PMC 5171832 . PMID 27996021 .
^ Dicarlo JE, Norville JE, Mali P, Rios X, Aach J, Church GM (апрель 2013 г.). «Инженер генома в Saccharomyces cerevisiae с использованием систем Crispr-Cas» . Исследование нуклеиновых кислот . 41 (7): 4336–4343. doi : 10.1093/nar/gkt135 . PMC 3627607 . PMID 23460208 .
^ Гратц С.Дж., Каммингс А.М., Нгуен Дж.Н., Хэмм Д.К., Донохью Л.К., Харрисон М.М. и др. (Август 2013). «Геном инженерия Drosophila с помощью RNA-нуклеазы CAS9, управляемой CRISPR» . Генетика . 194 (4): 1029–1035. doi : 10.1534/Genetics.113.152710 . PMC 3730909 . PMID 23709638 .
^ Hwang Wy, Fu Y, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD, et al. (Март 2013). «Эффективное редактирование генома у рыбок данио с использованием системы CRISPR-CAS» . Nature Biotechnology . 31 (3): 227–229. doi : 10.1038/nbt.2501 . PMC 3686313 . PMID 23360964 .
^ Ван Х., Ян Х., Шивалла К.С., Давлати М.М., Ченг А.В., Чжан Ф., Джаниш Р. (май 2013). «Одноэтапное поколение мышей, несущих мутации в нескольких генах с помощью CRISPR/CAS-опосредованного генома инженерии» . Клетка . 153 (4): 910–918. doi : 10.1016/j.cell.2013.04.025 . PMC 3969854 . PMID 23643243 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} ^и ^фон ^глин Larson MH, Gilbert LA, Wang X, Lim WA, Weissman JS, Qi LS (ноябрь 2013 г.). «Интерференция CRISPR (CRISPRI) для последовательно-специфической для контроля экспрессии генов» . Природные протоколы . 8 (11): 2180–2196. doi : 10.1038/nprot.2013.132 . PMC 3922765 . PMID 24136345 .
^ Джинк М., Чилински К., Фонфара И., Хауэр М., Доудна Дж.А., Чарпентье Е (август 2012 г.). «Программируемая двойная РНК-эндонуклеаза ДНК при адаптивном бактериальном иммунитете» . Наука . 337 (6096): 816–821. Bibcode : 2012sci ... 337..816j . doi : 10.1126/science.1225829 . PMC 6286148 . PMID 22745249 .
^ Vigouroux A, Bikard D (май 2020). «Инструменты CRISPR для контроля экспрессии генов у бактерий» . Микробиология и молекулярная биология обзоры . 84 (2). doi : 10.1128/mmbr.00077-19 . PMC 7117552 . PMID 32238445 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} Дхамад А.Е., Лесер DJ (октябрь 2020 г.). Атоми H (ред.). «Система Crispri-DCAS9 для Archaea и ее использование для изучения функции генов во время фиксации азота Methanosarcina acetivorans» . Прикладная и экологическая микробиология . 86 (21): E01402–20. Bibcode : 2020apenm..86e1402d . doi : 10.1128/aem.01402-20 . PMC 7580536 . PMID 32826220 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} ^в Vigouroux A, Oldewurtel E, Cui L, Bikard D, Van Teeffelen S (март 2018 г.). «Настройка способности DCAS9 блокировать транскрипцию обеспечивает надежный, бесшумный нокдаун бактериальных генов» . Биология молекулярных систем . 14 (3): E7899. doi : 10.15252/msb.20177899 . PMC 5842579 . PMID 29519933 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} Гилберт Л.А., Ларсон М.Х., Морсут Л., Лю З., Брр Г.А., Торрес С.Е. и др. (Июль 2013). «CRISPR-опосредованная модульная РНК-регуляция транскрипции у эукариот» . Клетка . 154 (2): 442–451. doi : 10.1016/j.cell.2013.06.044 . PMC 3770145 . PMID 23849981 .
^ Radzisheuskaya A, Shlyueva D, Müller I, Helin K (октябрь 2016 г.). «Оптимизация положения SGRNA заметно повышает эффективность CRISPR/DCAS9-опосредованной транскрипционной репрессии» . Исследование нуклеиновых кислот . 44 (18): E141. doi : 10.1093/nar/gkw583 . PMC 5062975 . PMID 27353328 .
^ Chen B, Gilbert LA, Cimini BA, Schnitzbauer J, Zhang W, Li GW, et al. (Декабрь 2013). «Динамическая визуализация геномных локусов в живых человеческих клетках с помощью оптимизированной системы CRISPR/CAS» . Клетка . 155 (7): 1479–1491. doi : 10.1016/j.cell.2013.12.001 . PMC 3918502 . PMID 24360272 .
^ Kearns NA, Genga RM, Enuameh MS, Garber M, Wolfe SA, Maehr R (январь 2014 г.). «Cas9-опосредованная регуляция транскрипции и дифференцировки в плюрипотентных стволовых клетках человека» . Разработка . 141 (1): 219–223. doi : 10.1242/dev.103341 . PMC 3865759 . PMID 24346702 .
^ Hu J, Lei Y, Wong WK, Liu S, Lee KC, He X, et al. (Апрель 2014). «Прямая активация генов OCT4 человека и мыши с использованием инженерных факторов транскрипции TALE и CAS9» . Исследование нуклеиновых кислот . 42 (7): 4375–4390. doi : 10.1093/nar/gku109 . PMC 3985678 . PMID 24500196 .
^ Такахаши К, Яманака С (август 2006 г.). «Индукция плюрипотентных стволовых клеток из культур эмбриональных и фибробластов мыши с помощью определенных факторов». Клетка . 126 (4): 663–676. doi : 10.1016/j.cell.2006.07.024 . HDL : 2433/159777 . PMID 16904174 . S2CID 1565219 .
^ Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, Vale Rd (октябрь 2014 г.). «Белковая система для амплификации сигнала в экспрессии генов и флуоресцентной визуализации» . Клетка . 159 (3): 635–646. doi : 10.1016/j.cell.2014.09.039 . PMC 4252608 . PMID 25307933 .
^ Ji W, Lee D, Wong E, Dadlani P, Dinh D, Huang V, et al. (Декабрь 2014). «Специфическая репрессия генов системой Crispri, передаваемой с помощью бактериального сопряжения» . ACS Синтетическая биология . 3 (12): 929–931. doi : 10.1021/sb500036q . PMC 4277763 . PMID 25409531 .
^ Hawkins JS, Silvis MR, Koo BM, Peters JM, Jost M, Hearne CC, et al. (2019-10-15). «Модулированная эффективность Crispri выявляет эволюционное сохранение важнейших отношений экспрессии и экспрессии генов у бактерий» . Biorxiv : 805333. DOI : 10.1101/805333 . S2CID 208583386 . Получено 2020-01-16 .
^ Reis AC, Halper SM, Vezeau GE, Cetnar DP, Hossain A, Clauer PR, Salis HM (ноябрь 2019 г.). «Одновременная репрессия множества бактериальных генов с использованием нерепетитивных массивов SGRNA в течение длительного времени». Nature Biotechnology . 37 (11): 1294–1301. doi : 10.1038/s41587-019-0286-9 . Ости 1569832 . PMID 31591552 . S2CID 203852115 .
^ Гоял А., Мьячева К., Грос М., Клингенберг М., Дюран Арке Б., Дидериш С. (февраль 2017 г.). «Проблемы приложений CRISPR/CAS9 для длинных некодирующих генов РНК» . Исследование нуклеиновых кислот . 45 (3): E12. doi : 10.1093/nar/gkw883 . PMC 5388423 . PMID 28180319 .
^ На что L, Vigorouroux A, Rousset F, Varet H, Khanna V, Bikard D (май 2018). «Экран Crispri в E. coli показывает токсичность Sequece-Pecifica DCAS9» . Природная связь . 9 (1): 1912. Bibcode : 2018natco ... 9.1912c . Doi : 10.1038/s41467-04209-5 . PMC 5954155 . PMID 29765036 .
^ Depardieu F, Bikard D (февраль 2020 г.). «Генсинг гена с CrisPri в бактериях и оптимизация уровней экспрессии DCAS9» (PDF) . Методы Методы характеристики, применения и обучения систем CRISPR-CAS. 172 : 61–75. doi : 10.1016/j.ymeth.2019.07.024 . PMID 31377338 . S2CID 199436713 .

[1] Jensen OF, Mikelsen NS, Gao Z, Fouselteder J, Pabst G, Axelgaard E, et al. (Ноябрь 2021 г.). «Целевая регуляция транспрессии в первичных клетках USPRA и Crispri » Geome Research 31 (11): 2120–2 Doi : 10.1101/ gr.275607.1 PMC 8559706 . 34407984PMID

[pmid23452860-2] Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} ^и Ци Л.С., Ларсон М.Х., Гилберт Л.А., Доудна Дж.А., Вайсман Дж.С., Аркин А.П., Лим Ва (февраль 2013 г.). «Перепрофилирование CRISPR в качестве РНК-платформы для специфической для последовательности контроля экспрессии генов» . Клетка . 152 (5): 1173–1183. doi : 10.1016/j.cell.2013.02.022 . PMC 3664290 . PMID 23452860 .

[pmid17379808-3] Баррунгу Р., Фримо С., Дево Х., Ричардс М., Бойавал П., Моино С. и др. (Март 2007 г.). «CRISPR обеспечивает приобретенную устойчивость к вирусам у прокариот». Наука . 315 (5819): 1709–1712. Bibcode : 2007sci ... 315.1709b . doi : 10.1126/science.1138140 . HDL : 20.500.11794/38902 . PMID 17379808 . S2CID 3888761 .

[pmid23360965-4] Jump up to: ^а ^{беременный} Цзян В., Бикард Д., Кокс Д., Чжан Ф., Марраффини Л.А. (март 2013 г.). «Редакция бактериальных геномов с РНК с использованием систем CRISPR-CAS» . Nature Biotechnology . 31 (3): 233–239. doi : 10.1038/nbt.2508 . PMC 3748948 . PMID 23360965 .

[pmid27238023-5] Jump up to: ^а ^{беременный} Peters JM, Colavin A, Shi H, Czarny TL, Larson MH, Wong S, et al. (Июнь 2016 г.). «Комплексный функциональный анализ основных генов на основе CRISPR» . Клетка . 165 (6): 1493–1506. doi : 10.1016/j.cell.2016.05.003 . PMC 4894308 . PMID 27238023 .

[pmid27996021-6] Jump up to: ^а ^{беременный} ^в Li XT, Jun Y, Erickstad MJ, Brown SD, Parks A, Court DL, Jun S (декабрь 2016 г.). «Tcrispri: настраиваемая и обратимая, одноступенчатая контроль экспрессии генов» . Научные отчеты . 6 : 39076. Bibcode : 2016natsr ... 639076L . doi : 10.1038/srep39076 . PMC 5171832 . PMID 27996021 .

[pmid23460208-7] Dicarlo JE, Norville JE, Mali P, Rios X, Aach J, Church GM (апрель 2013 г.). «Инженер генома в Saccharomyces cerevisiae с использованием систем Crispr-Cas» . Исследование нуклеиновых кислот . 41 (7): 4336–4343. doi : 10.1093/nar/gkt135 . PMC 3627607 . PMID 23460208 .

[pmid2408874-8] Гратц С.Дж., Каммингс А.М., Нгуен Дж.Н., Хэмм Д.К., Донохью Л.К., Харрисон М.М. и др. (Август 2013). «Геном инженерия Drosophila с помощью RNA-нуклеазы CAS9, управляемой CRISPR» . Генетика . 194 (4): 1029–1035. doi : 10.1534/Genetics.113.152710 . PMC 3730909 . PMID 23709638 .

[pmid23360964-9] Hwang Wy, Fu Y, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD, et al. (Март 2013). «Эффективное редактирование генома у рыбок данио с использованием системы CRISPR-CAS» . Nature Biotechnology . 31 (3): 227–229. doi : 10.1038/nbt.2501 . PMC 3686313 . PMID 23360964 .

[pmid23643243-10] Ван Х., Ян Х., Шивалла К.С., Давлати М.М., Ченг А.В., Чжан Ф., Джаниш Р. (май 2013). «Одноэтапное поколение мышей, несущих мутации в нескольких генах с помощью CRISPR/CAS-опосредованного генома инженерии» . Клетка . 153 (4): 910–918. doi : 10.1016/j.cell.2013.04.025 . PMC 3969854 . PMID 23643243 .

[pmid24136345-11] Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} ^и ^фон ^глин Larson MH, Gilbert LA, Wang X, Lim WA, Weissman JS, Qi LS (ноябрь 2013 г.). «Интерференция CRISPR (CRISPRI) для последовательно-специфической для контроля экспрессии генов» . Природные протоколы . 8 (11): 2180–2196. doi : 10.1038/nprot.2013.132 . PMC 3922765 . PMID 24136345 .

[pmid22745249-12] Джинк М., Чилински К., Фонфара И., Хауэр М., Доудна Дж.А., Чарпентье Е (август 2012 г.). «Программируемая двойная РНК-эндонуклеаза ДНК при адаптивном бактериальном иммунитете» . Наука . 337 (6096): 816–821. Bibcode : 2012sci ... 337..816j . doi : 10.1126/science.1225829 . PMC 6286148 . PMID 22745249 .

[13] Vigouroux A, Bikard D (май 2020). «Инструменты CRISPR для контроля экспрессии генов у бактерий» . Микробиология и молекулярная биология обзоры . 84 (2). doi : 10.1128/mmbr.00077-19 . PMC 7117552 . PMID 32238445 .

[Dhamad_2020-14] Jump up to: ^а ^{беременный} Дхамад А.Е., Лесер DJ (октябрь 2020 г.). Атоми H (ред.). «Система Crispri-DCAS9 для Archaea и ее использование для изучения функции генов во время фиксации азота Methanosarcina acetivorans» . Прикладная и экологическая микробиология . 86 (21): E01402–20. Bibcode : 2020apenm..86e1402d . doi : 10.1128/aem.01402-20 . PMC 7580536 . PMID 32826220 .

[auto-15] Jump up to: ^а ^{беременный} ^в Vigouroux A, Oldewurtel E, Cui L, Bikard D, Van Teeffelen S (март 2018 г.). «Настройка способности DCAS9 блокировать транскрипцию обеспечивает надежный, бесшумный нокдаун бактериальных генов» . Биология молекулярных систем . 14 (3): E7899. doi : 10.15252/msb.20177899 . PMC 5842579 . PMID 29519933 .

[pmid23849981-16] Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} Гилберт Л.А., Ларсон М.Х., Морсут Л., Лю З., Брр Г.А., Торрес С.Е. и др. (Июль 2013). «CRISPR-опосредованная модульная РНК-регуляция транскрипции у эукариот» . Клетка . 154 (2): 442–451. doi : 10.1016/j.cell.2013.06.044 . PMC 3770145 . PMID 23849981 .

[17] Radzisheuskaya A, Shlyueva D, Müller I, Helin K (октябрь 2016 г.). «Оптимизация положения SGRNA заметно повышает эффективность CRISPR/DCAS9-опосредованной транскрипционной репрессии» . Исследование нуклеиновых кислот . 44 (18): E141. doi : 10.1093/nar/gkw583 . PMC 5062975 . PMID 27353328 .

[pmid24360272-18] Chen B, Gilbert LA, Cimini BA, Schnitzbauer J, Zhang W, Li GW, et al. (Декабрь 2013). «Динамическая визуализация геномных локусов в живых человеческих клетках с помощью оптимизированной системы CRISPR/CAS» . Клетка . 155 (7): 1479–1491. doi : 10.1016/j.cell.2013.12.001 . PMC 3918502 . PMID 24360272 .

[pmid24346702-19] Kearns NA, Genga RM, Enuameh MS, Garber M, Wolfe SA, Maehr R (январь 2014 г.). «Cas9-опосредованная регуляция транскрипции и дифференцировки в плюрипотентных стволовых клетках человека» . Разработка . 141 (1): 219–223. doi : 10.1242/dev.103341 . PMC 3865759 . PMID 24346702 .

[pmid24500196-20] Hu J, Lei Y, Wong WK, Liu S, Lee KC, He X, et al. (Апрель 2014). «Прямая активация генов OCT4 человека и мыши с использованием инженерных факторов транскрипции TALE и CAS9» . Исследование нуклеиновых кислот . 42 (7): 4375–4390. doi : 10.1093/nar/gku109 . PMC 3985678 . PMID 24500196 .

[pmid16904174-21] Такахаши К, Яманака С (август 2006 г.). «Индукция плюрипотентных стволовых клеток из культур эмбриональных и фибробластов мыши с помощью определенных факторов». Клетка . 126 (4): 663–676. doi : 10.1016/j.cell.2006.07.024 . HDL : 2433/159777 . PMID 16904174 . S2CID 1565219 .

[pmid25307933-22] Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, Vale Rd (октябрь 2014 г.). «Белковая система для амплификации сигнала в экспрессии генов и флуоресцентной визуализации» . Клетка . 159 (3): 635–646. doi : 10.1016/j.cell.2014.09.039 . PMC 4252608 . PMID 25307933 .

[pmid25409531-23] Ji W, Lee D, Wong E, Dadlani P, Dinh D, Huang V, et al. (Декабрь 2014). «Специфическая репрессия генов системой Crispri, передаваемой с помощью бактериального сопряжения» . ACS Синтетическая биология . 3 (12): 929–931. doi : 10.1021/sb500036q . PMC 4277763 . PMID 25409531 .

[24] Hawkins JS, Silvis MR, Koo BM, Peters JM, Jost M, Hearne CC, et al. (2019-10-15). «Модулированная эффективность Crispri выявляет эволюционное сохранение важнейших отношений экспрессии и экспрессии генов у бактерий» . Biorxiv : 805333. DOI : 10.1101/805333 . S2CID 208583386 . Получено 2020-01-16 .

[25] Reis AC, Halper SM, Vezeau GE, Cetnar DP, Hossain A, Clauer PR, Salis HM (ноябрь 2019 г.). «Одновременная репрессия множества бактериальных генов с использованием нерепетитивных массивов SGRNA в течение длительного времени». Nature Biotechnology . 37 (11): 1294–1301. doi : 10.1038/s41587-019-0286-9 . Ости 1569832 . PMID 31591552 . S2CID 203852115 .

[26] Гоял А., Мьячева К., Грос М., Клингенберг М., Дюран Арке Б., Дидериш С. (февраль 2017 г.). «Проблемы приложений CRISPR/CAS9 для длинных некодирующих генов РНК» . Исследование нуклеиновых кислот . 45 (3): E12. doi : 10.1093/nar/gkw883 . PMC 5388423 . PMID 28180319 .

[27] На что L, Vigorouroux A, Rousset F, Varet H, Khanna V, Bikard D (май 2018). «Экран Crispri в E. coli показывает токсичность Sequece-Pecifica DCAS9» . Природная связь . 9 (1): 1912. Bibcode : 2018natco ... 9.1912c . Doi : 10.1038/s41467-04209-5 . PMC 5954155 . PMID 29765036 .

[28] Depardieu F, Bikard D (февраль 2020 г.). «Генсинг гена с CrisPri в бактериях и оптимизация уровней экспрессии DCAS9» (PDF) . Методы Методы характеристики, применения и обучения систем CRISPR-CAS. 172 : 61–75. doi : 10.1016/j.ymeth.2019.07.024 . PMID 31377338 . S2CID 199436713 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

[ 16 ]

[ 17 ]

[ 18 ]

[ 19 ]

[ 20 ]

[ 21 ]

[ 22 ]

[ 23 ]

[ 24 ]

[ 25 ]

[ 26 ]

[ 27 ]

[ 28 ]