Эксперимент Лурии-Дельбрюка

Две возможности, проверенные экспериментом Лурии-Дельбрюка. (А) Если мутации индуцируются средой, ожидается, что на каждой чашке появится примерно одинаковое количество мутантов. (Б) Если мутации возникают спонтанно во время деления клеток до посева, на каждой чашке будет сильно различаться количество мутантов.

Эксперимент Лурии -Дельбрюка (1943) (также называемый тестом флуктуации ) продемонстрировал, что у бактерий генетические мутации возникают в отсутствие селективного давления , а не являются ответом на него. Таким образом, они пришли к выводу, что Дарвина теория о естественном отборе, действующем на случайные мутации, применима как к бактериям, так и к более сложным организмам. Макс Дельбрюк и Сальвадор Лурия были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине Частично за эту работу 1969 года.

Простая модель

Предположим, одну бактерию помещают в питательную среду, богатую питательными веществами, и дают ей расти в течение нескольких дней. $N\times$ времени его удвоения, мы получим $2^{N}$ потомки. Затем мы вводим вызов бактериофагов. Это убьет большинство бактерий, но оставит некоторых живыми. Затем мы можем нанести питательную среду на новую питательную среду и подсчитать количество колоний как количество выживших.

В сценарии Ламарка каждая бактерия сталкивается с проблемой в одиночку. Большинство из них погибнет, но немногие переживут это испытание и найдут новую колонию. В дарвиновском сценарии устойчивость к фагу могла возникнуть случайно во время репликации. Те, кто унаследовал сопротивление, выживут, а те, кто нет, умрут.

В сценарии Ламарка, предполагая, что каждая бактерия имеет одинаково малую вероятность выживания, тогда количество новых колоний распределяется по Пуассону, которое экспоненциально затухает при большом количестве выживших.

В дарвиновском сценарии, если предположить, что вероятность мутации настолько мала, что мы ожидаем только одну мутацию в течение всей фазы репликации, и что для простоты мы действительно получаем только одну мутацию, тогда с вероятностью $1/2$ с вероятностью есть один выживший $1/4$ есть 2 выживших и т. д. То есть вероятность масштабируется как ${\frac {1}{\text{number of survivors}}}$.

В частности, если окажется, что распределение числа выживших затухает скорее по степенному закону, чем по экспоненте, то мы можем с высокой статистической вероятностью заключить, что дарвиновский сценарий верен. Это приблизительный обзор эксперимента Лурии-Дельбрюка. (раздел 4.4 )

История

К 1940-м годам идеи наследственности и мутации были общепринятыми, хотя роль ДНК как наследственного материала еще не была установлена. Считалось, что бактерии чем-то отличаются и могут развивать наследственные генетические мутации в зависимости от обстоятельств, в которых они оказались: короче говоря, была ли мутация у бактерий преадаптивной (предсуществующей) или постадаптационной (направленной адаптации)?

В своем эксперименте Лурия и Дельбрюк инокулировали небольшое количество бактерий ( Escherichia coli ) в отдельные культуральные пробирки. После периода роста они высевали равные объемы этих отдельных культур на агар, Т1 содержащий фаг (вирус). Если устойчивость бактерий к вирусу была вызвана индуцированной активацией бактерий, т.е. если устойчивость не была обусловлена ​​наследственными генетическими компонентами, то каждая чашка должна содержать примерно одинаковое количество устойчивых колоний. Предполагая постоянную скорость мутаций, Лурия предположил, что если мутации происходят после воздействия селективного агента и в ответ на него, число выживших будет распределяться в соответствии с распределением Пуассона со средним значением , равным дисперсии . Это было не то, что обнаружили Дельбрюк и Лурия: вместо этого количество устойчивых колоний на каждой чашке резко различалось: дисперсия была значительно больше средней.

Лурия и Дельбрюк предположили, что эти результаты можно объяснить возникновением постоянной скорости случайных мутаций в каждом поколении бактерий, растущих в исходных культуральных пробирках. На основе этих предположений Дельбрюк вывел распределение вероятностей (теперь называемое распределением Лурии – Дельбрюка). ), что дает связь между моментами , согласующуюся с экспериментально полученными значениями. Поэтому был сделан вывод, что мутации у бактерий, как и у других организмов, носят скорее случайный , чем направленный характер.

Результаты Лурии и Дельбрюка были подтверждены Ньюкомбом более наглядно, но менее количественно. Ньюкомб инкубировал бактерии в чашке Петри в течение нескольких часов, а затем поместил их в две новые чашки Петри, обработанные фагом. Первую пластину оставляли нерасправленной, а вторую пластину затем раскладывали заново, то есть бактериальные клетки перемещали, позволяя отдельным клеткам в некоторой колонии образовывать свои собственные новые колонии. Если бы колонии содержали резистентные бактериальные клетки до контакта с фаговым вирусом, можно было бы ожидать, что некоторые из этих клеток сформируют новые резистентные колонии на повторно рассеянной чашке и, таким образом, обнаружат там большее количество выживших бактерий. Когда обе чашки инкубировали для роста, на повторно разложенной чашке оказалось в 50 раз больше бактериальных колоний. Это показало, что бактериальные мутации устойчивости к вирусу произошли случайным образом во время первой инкубации. И снова мутации произошли до того, как был применен отбор.

Совсем недавно результаты Лурии и Дельбрюка были подвергнуты сомнению Кэрнсом и другими, которые изучали мутации в метаболизме сахара как форму экологического стресса. Некоторые ученые предполагают, что этот результат мог быть вызван отбором на амплификацию генов и/или более высокой частотой мутаций в клетках, неспособных делиться. Другие защищали исследования и предлагали механизмы, объясняющие наблюдаемые явления, соответствующие адаптивному мутагенезу .

Это распределение, по-видимому, было впервые определено Холдейном . была обнаружена неопубликованная рукопись, В 1991 году в Университетском колледже Лондона описывающая это распределение. Вывод другой, но результаты трудно вычислить без использования компьютера.

Описание теста

Небольшое количество клеток используют для инокуляции параллельных культур в неселективной среде. Культуры выращивают до насыщения для получения одинаковой плотности клеток. Клетки высеивают на селективную среду для получения количества мутантов ( r ). Разведения высевают на богатую среду для расчета общего количества жизнеспособных клеток ( N _t ). Число мутантов, появляющихся в насыщенной культуре, является мерой как скорости мутаций, так и того, когда мутанты возникают во время роста культуры: мутанты, появляющиеся на ранних этапах роста культуры, будут размножать гораздо больше мутантов, чем те, которые возникают позже в ходе роста культуры. рост. Эти факторы приводят к тому, что частота ( r / N _t ) сильно варьируется, даже если количество мутационных событий ( m ) одинаково. Частота не является достаточно точной мерой мутации, поэтому скорость мутации ( m / N _t всегда следует рассчитывать ).

Оценка частоты мутаций (μ) сложна. Лурия и Дельбрюк оценили этот параметр по среднему значению распределения, но впоследствии было показано, что эта оценка необъективна.

Метод медианы Леа-Коулсона был введен в 1949 году. Этот метод основан на уравнении

${\frac {r}{m}}-\ln(m)-1.24=0.$

Где:

r = среднее количество колоний на одной чашке, содержащей индикатор (например, рифампицин, хлорат натрия, стрептомицин)

m = переменная, которая будет варьироваться, соответствует мутациям/культуре

Значение переменной m корректируется до тех пор, пока общее значение уравнения не станет близким к 0. Тогда скорость мутации (вероятность мутации/клетки/деления или поколения) можно рассчитать по одной из трех формул:

(1) $\mu =m/median(N_{t})$

(2) $\mu =m/(2*median(N_{t}))$

(3) $\mu =m*ln(2)/median(N_{t})$

где N _t — медиана количества жизнеспособных клеток на неиндикаторной чашке (часто агар LB без добавки)

Выбор используемой формулы зависит от того, на каком этапе деления клеток ожидается возникновение мутаций.

С тех пор этот метод был усовершенствован, но эти более точные методы сложны. Ма-Сандри-Саркара Оценщик максимального правдоподобия в настоящее время является самым известным оценщиком . Описан ряд дополнительных методов и оценок на основе экспериментальных данных.

В свободном доступе находятся два веб-приложения для расчета частоты мутаций: Falcor и бз-рейты . Bz-rates реализует обобщенную версию оценки максимального правдоподобия Ма-Сандри-Саркара , которая может учитывать относительную дифференциальную скорость роста между мутантными клетками и клетками дикого типа, а также оценку производящей функции, которая может оценивать как скорость мутаций, так и дифференциальный темп роста. Проработанный пример показан в этой статье Джонса и др .

Распределение

Во всех этих моделях скорость мутаций ( μ ) и скорость роста ( β ) предполагались постоянными. Модель можно легко обобщить, чтобы ослабить эти и другие ограничения. Эти показатели, вероятно, будут различаться в неэкспериментальных условиях. Модели также требуют, чтобы N _t μ >> 1, где N _t — общее количество организмов. Это предположение, вероятно, будет справедливым в большинстве реалистичных или экспериментальных условий.

Лурия и Дельбрюк оценил скорость мутаций (мутаций на бактерию в единицу времени) по уравнению

$\mu ={\frac {\beta \ln(\rho )}{n_{0}[1-\exp(\beta t)]}}$

где β — скорость роста клеток, n ₀ — исходное количество бактерий в каждой культуре, t — время, и

$\rho ={\frac {N_{s}}{N}}$

где N _s — количество культур без резистентных бактерий, а N — общее количество культур.

Модель Леи и Коулсона отличались от оригинала тем, что рассматривали совокупность независимых процессов Юла (фильтрованный процесс Пуассона ). Численное сравнение этих двух моделей с реалистичными значениями параметров показало, что они различаются незначительно. Производящая функция для этой модели была найдена Бартлеттом в 1978 году. и есть

$G(z,\mu ,\phi )=\exp \left({\frac {\mu }{\phi }}\left({\frac {1}{z}}-1\right)\log \left(1-\phi z\right)\right)$

где µ — скорость мутаций (считается постоянной), φ = 1 − e ^{− βt} где β — скорость роста клеток (также предполагается постоянной) и t — время.

Определение μ из этого уравнения оказалось трудным, но решение было найдено в 2005 году. . Дифференцирование производящей функции по µ позволяет применить метод Ньютона–Рафсона , который вместе с использованием оценочной функции позволяет получить доверительные интервалы для µ .

Молекулярная биология

Механизм устойчивости к фагу Т1, по-видимому, обусловлен мутациями в гене fhu A — мембранном белке, который действует как рецептор T1. Продукт гена ton B также необходим для заражения T1. Белок FhuA активно участвует в транспорте феррихрома , альбомицина и рифамицина . Он также придает чувствительность к микроцину J25 и колицину М и действует как рецептор для фагов Т5 и фи80, а также Т1.

Белок FhuA имеет домен бета-бочонка (остатки с 161 по 714), который закрыт глобулярным пробковым доменом (остатки с 1 по 160). Внутри пробкового домена находится область связывания TonB (остатки с 7 по 11). Большие мономерные β-бочкообразные домены, охватывающие мембрану, имеют 22 β-цепи переменной длины, некоторые из которых простираются значительно за пределы гидрофобного ядра мембраны во внеклеточное пространство. Существует 11 внеклеточных петель, пронумерованных от L1 до L11. Петля L4 — это место, где связывается фаг Т1.

Внешние ссылки

• В лаборатории мутаций
• Научные профили: документы Сальвадора Э. Лурии. Информация о Сальвадоре Лурии из Национальной медицинской библиотеки.