Культура малярии
Культура малярии представляет собой метод выращивания малярийных паразитов вне организма, т. е. в среде ex vivo . Хотя попытки размножения паразитов за пределами людей или животных были предприняты еще в 1912 году, [ 2 ] успех первоначальных попыток ограничивался одним или несколькими циклами. Первая успешная непрерывная культура была создана в 1976 году. [ 3 ] Первоначальные надежды на то, что культура ex vivo быстро приведет к открытию вакцины, оказались преждевременными. Однако разработка новых лекарств значительно облегчилась. [ 4 ]
Метод
[ редактировать ]
Инфицированные эритроциты человека инкубируют в культуральной чашке или колбе при 37°С вместе с питательной средой и плазмой , сывороткой или заменителями сыворотки. [ 5 ] Особенностью инкубации является специальная газовая смесь, наполненная азотом (90-92 %), CO 2 (5 %) и кислородом (3-5 %), позволяющая паразитам расти при температуре 37°С в клеточном инкубаторе . [ 6 ] Альтернативой отравлению культур точной газовой смесью является использование подсвечника. культуры и зажженная свеча Подсвечник представляет собой герметичный контейнер, в который помещаются . Горящая свеча потребляет часть кислорода и выделяет углекислый газ (CO 2 ), который действует как огнетушитель . Содержание углекислого газа в свежем воздухе колеблется от 0,036 % до 0,039 %. Как только концентрация CO 2 достигнет примерно 5 %, свеча перестанет гореть. Количество паразитов увеличивалось в 5 раз примерно каждые 48 часов (один цикл). Паразитемию можно определить с помощью мазка крови . Чтобы поддерживать ее в желаемых пределах, культуру можно разбавить здоровыми эритроцитами. [ 7 ]
Оригинальный метод успешного ex vivo размножения P. falciparum включал культивирование паразита в статических условиях (метод Трагера-Йенсена). [ 3 ] Джеймс Б. Дженсен присоединился к лаборатории Трагера в качестве научного сотрудника в 1976 году. Он решил использовать подсвечник вместо инкубатора с CO 2 . Летом 1976 года Милтон Фридман, аспирант лаборатории Трагера, работавший в лабораториях MRC в Гамбии , организовал отправку образца человеческой крови, зараженной P. falciparum, в Нью-Йорк. Его разбавляли RPMI 1640 (который оказался лучшим из коммерческих средств) в чашках Петри , помещали в подсвечник и инкубировали. Линия росла очень хорошо и стала FCR-3/Gambia, одним из наиболее широко используемых штаммов. Позже с использованием аналогичных методов будут созданы и другие линии, и влияние непрерывного культивирования P. falciparum было феноменальным, особенно для тестирования предполагаемых противомалярийных препаратов и для расшифровки его генов. Ряд последующих сообщений (еще в начале 1980-х годов) показал, что суспензия клеток (с использованием встряхивающего инкубатора ) значительно увеличивала рост культуры. Также было показано, что непрерывное перемешивание улучшает другие параметры роста культуры, имеющие значение для исследователей, такие как продление синхронности культур после процедур синхронизации и снижение уровня множественных инфекций. [ 9 ] Несмотря на это, практика культивирования паразита в статических условиях остается широко распространенной. Наибольшая ценность метода свечи состоит в том, что его можно использовать в лабораториях практически в любой точке мира, где есть инкубатор, свеча и эксикатор . [ 10 ] Около 60% зараженных паразитами клеток можно получить, используя оптимизированные условия культивирования. [ 1 ] Недавние исследования P. falciparum, выделенных непосредственно от инфицированных пациентов, показывают, что у естественного хозяина возникают альтернативные биологические состояния паразита, которые не наблюдаются у паразитов, культивируемых ex vivo . [ 11 ]
Концентрация инфицированных клеток
[ редактировать ]
Для достижения синхронизации и/или концентрации паразитов в культуре было разработано несколько методов. прерывистого Перколла. градиента Для изоляции можно использовать процедуру инфицированные эритроциты, поскольку эритроциты, содержащие плазмодии, менее плотны, чем нормальные. Молодые трофозоиты совпадали с эритроцитами в широкой полосе, соответствующей плотности от 1,075 до 1,100 г/мл, тогда как шизонты концентрировались при плотности около 1,062 г/мл. [ 14 ] Однако есть исследования, которые предполагают, что некоторые штаммы P.falciparum теряют способность к инвазии после воздействия этого химического вещества. Разницу между диамагнитным низкоспиновым оксигемоглобином в неинфицированных эритроцитах и парамагнитным гемозоином в инфицированных эритроцитах также можно использовать для выделения. Магнитные колонки оказались менее вредными для паразита, они просты и адаптируются к потребностям исследователя. [ 15 ] [ 16 ] Колонку устанавливали в мощный магнитный держатель, и культура протекала через него. Колонка улавливает эритроциты, зараженные последними стадиями паразитов, которые затем можно элюировать, когда колонку удаляют из магнита. Это простой метод, который не требует дорогостоящего оборудования и, похоже, не влияет на способность паразитов к вторжению в дальнейшем. [ 12 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с Радфар А., Мендес Д., Монерис С., Линарес М., Марин-Гарсия П., Пуйет А., Диес А., Баутиста Х.М. (2009). «Синхронная культура Plasmodium falciparum при высоком уровне паразитемии». Нат. Проток . 4 (11): 1899–915. дои : 10.1038/нпрот.2009.198 . ПМИД 20010926 .
- ^ Бас CC , Джонс FM. (1912). «Культивирование малярийных плазмодий (Plasmodium vivax и Plasmodium Falciparum) in vitro » . Дж. Эксп. Мед . 16 (4): 567–579. дои : 10.1084/jem.16.4.567 . ПМК 2124976 . ПМИД 19867597 .
- ^ Jump up to: а б Трагер В., Дженсен Дж.Б. (1976). «Малярийные паразиты человека в непрерывной культуре». Наука . 193 (4254): 673–675. Бибкод : 1976Sci...193..673T . дои : 10.1126/science.781840 . ПМИД 781840 .
- ^ Трагер В., Дженсен Дж.Б. (1997). «Непрерывная культура Plasmodium falciparum: ее влияние на исследования малярии». Межд. Дж. Паразитол . 27 (9): 989–1006. дои : 10.1016/S0020-7519(97)00080-5 . ПМИД 9363481 .
- ^ Баско Л.К. (2003). «Молекулярная эпидемиология малярии в Камеруне. XV. Экспериментальные исследования заменителей и добавок сыворотки, а также альтернативных культуральных сред для анализа чувствительности к лекарствам in vitro с использованием свежих изолятов Plasmodium falciparum» . Являюсь. Ж. Троп. Мед. Хиг . 69 (2): 168–173. дои : 10.4269/ajtmh.2003.69.168 . ПМИД 14506772 .
- ^ Тригг ПИ (1985). «Последние достижения в культивировании малярийных паразитов и их применение к исследованиям взаимоотношений хозяин-паразит: обзор» (PDF) . Бык. Всемирный орган здравоохранения . 63 (2): 387–398. ПМЦ 2536397 . ПМИД 3893779 . Архивировано из оригинала (PDF) 28 ноября 2003 г.
- ^ Шустер, Флорида (2002). «Культивирование видов плазмодия» . Клин. Микробиол. Преподобный . 15 (3): 355–364. doi : 10.1128/CMR.15.3.355-364.2002 . ПМК 118084 . ПМИД 12097244 .
- ^ Руссманн Л., Юнг А., Гейдрих Х.Г. (1982). «Использование градиентов Перколла, элютриатора роторного элюирования и окрашивания митрамицином для выделения и идентификации внутриэритроцитарных стадий плазмодия berghei». З. Параситенкд . 66 (3): 273–280. дои : 10.1007/BF00925344 . ПМИД 6177116 .
- ^ Аллен Р.Дж., Кирк К. (2010). « Культура Plasmodium falciparum : преимущества встряхивания». Мол. Биохим. Паразитол . 169 (1): 63–5. doi : 10.1016/j.molbiopara.2009.09.005 . ПМИД 19766147 .
- ^ Шерман, И.В. (2010). Волшебные пули для победы над малярией. От хинина до Цинхаосу . АСМ Пресс. ISBN 978-1-55581-543-1 .
- ^ ЛеРу М., Лакшманан В., Daily JP (2009). «Биология Plasmodium falciparum: анализ условий роста in vitro и in vivo». Тенденции Паразитол . 25 (10): 474–481. дои : 10.1016/j.pt.2009.07.005 . ПМИД 19747879 .
- ^ Jump up to: а б Спадафора С., Герена Л., Копыдловски К.М. (2011). «Сравнение инвазивных способностей шизонтов Plasmodium falciparum in vitro, выделенных градиентом Перколла или с использованием магнитной сепарации» . Малар. Дж . 10 (1): 96. дои : 10.1186/1475-2875-10-96 . ПМК 3100259 . ПМИД 21501476 .
- ^ Коронадо Л.М., Тайлер Н.М., Корреа Р., Джовани Р.М., Спадафора К. (2013). «Разделение эритроцитов, инфицированных Plasmodium falciparum на поздней стадии, магнитными средствами» . Дж. Вис. Эксп . 73 (73): е50342. дои : 10.3791/50342 . ПМК 3622091 . ПМИД 23486405 .
- ^ Риваденейра Э.М., Вассерман М., Эспиналь КТ (1983). «Разделение и концентрирование шизонтов Plasmodium falciparum с помощью градиентов Перколла» . Дж. Протозоол . 30 (2): 367–370. дои : 10.1111/j.1550-7408.1983.tb02932.x . ПМИД 6313915 . [ мертвая ссылка ]
- ^ Ким CC, Уилсон Э.Б., Дериси Дж.Л. (2010). «Улучшенные методы магнитной очистки малярийных паразитов и гемозоина» (PDF) . Малар. Дж . 9 (1): 17. дои : 10.1186/1475-2875-9-17 . ПМЦ 2817699 . ПМИД 20074366 .
- ^ Бхакди С.К., Оттингер А., Сомсри С., Сратогно П., Паннадапорн П., Чимма П., Маласит П., Паттанапаньясат К., Нойманн Х.П. (2010). «Оптимизированная высокоградиентная магнитная сепарация для выделения эритроцитов, инфицированных плазмодиями» (PDF) . Малар. Дж . 9 (1): 38. дои : 10.1186/1475-2875-9-38 . ПМК 2831011 . ПМИД 20122252 .
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]• Дулан, Д.Л. (редактор) (2002) Методы и протоколы борьбы с малярией (методы в молекулярной медицине) , Тотова, Нью-Джерси: Humana Press, ISBN 0-89603-823-8 / ISBN 978-0-89603-823-3
