Иммобилизованный фермент
Иммобилизованный фермент — это фермент с ограниченной подвижностью, прикрепленный к инертному, нерастворимому материалу, такому как альгинат кальция (полученный путем реакции смеси раствора альгината натрия и раствора фермента с хлоридом кальция ). Это может обеспечить повышенную устойчивость к изменениям таких условий, как pH или температура . Это также позволяет ферментам удерживаться на месте на протяжении всей реакции, после чего они легко отделяются от продуктов и могут быть использованы снова - гораздо более эффективный процесс, поэтому он широко используется в промышленности для ферментами катализируемых реакций, . Альтернативой иммобилизации ферментов является иммобилизация целых клеток . [1] [2] С иммобилизованными ферментами легко обращаться: их просто отделяют от продуктов, и их можно использовать повторно. [3]
Ферменты — это биокатализаторы, которые играют важную роль в усилении химических реакций в клетках, не подвергаясь постоянной модификации, не тратясь впустую и не приводя к потере равновесия химических реакций. Хотя характеристики ферментов чрезвычайно уникальны, их применение в промышленности ограничено из-за отсутствия возможности повторного использования, стабильности и высокой стоимости производства. [4]
История
[ редактировать ]Первый синтетический иммобилизованный фермент был создан в 1950-х годах путем включения фермента в полимерные матрицы или связывания с веществами-носителями. Также применялась процедура сшивания путем сшивания белка отдельно или вместе с добавлением инертных материалов. [3] За последнее десятилетие были разработаны различные методы иммобилизации. Например, связывание фермента с ранее синтезированными материалами-носителями на сегодняшний день является наиболее предпочтительным методом. В последнее время процедура сшивания кристаллов фермента также рассматривается как интересная замена. Уровень использования иммобилизованных ферментов постоянно растет. [5]
Соображения
[ редактировать ]Прежде чем выполнять какие-либо методы иммобилизации, следует учитывать некоторые факторы. Необходимо понимать химическое и физическое воздействие на фермент после иммобилизации. Стабильность и кинетические характеристики фермента могут быть изменены, например, из-за изменений условий микроокружения фермента после захвата, прикрепления материала носителя или продуктов ферментативного действия. Кроме того, важно учитывать сохранение третичной структуры фермента до иммобилизации, чтобы получить функциональный фермент. Аналогичным образом, еще одним важным местом для функциональности фермента является активный центр , который также следует поддерживать, пока фермент прикрепляется к поверхности для иммобилизации. Необходимо иметь селективный метод прикрепления поверхности/материала к поверхности. не получить иммобилизованный, но дисфункциональный фермент. [3] Следовательно, существует три основных фактора, которые следует учитывать при производстве функциональных иммобилизованных ферментов: иммобилизация поддерживает отбор, условия и методы иммобилизации. [6]
Поддержка выбора
[ редактировать ]Чтобы материал носителя был идеальным, он должен быть гидрофильным , инертным по отношению к ферментам, биосовместимым , устойчивым к микробному воздействию и сжатию, а также должен быть доступным. [7] [8] Материалы-носители могут быть органическими или неорганическими, синтетическими или натуральными (в зависимости от состава), поскольку биоматериалов в конечном итоге они представляют собой типы . Не существует универсального типа материала-подложки, который можно было бы использовать для иммобилизации всех ферментов. Однако существуют некоторые широко используемые носители, такие как носители на основе диоксида кремния, акриловые смолы , синтетические полимеры , активные мембраны и обменные смолы. [6] Одним из самых сложных процессов перед самим процессом иммобилизации является выбор материала поддержки, поскольку он зависит от типа фермента, реакции среды, политики безопасности гидродинамики и условий реакции. [3] [8] Поскольку разные типы носителей обладают разными физическими и химическими характеристиками и свойствами, которые влияют на функцию фермента, например: гидрофильность / гидрофобность , химия поверхности и размер пор.
Методы
[ редактировать ]Ферменты можно иммобилизовать физическими или химическими методами, включая:
Физический
[ редактировать ]Адсорбция
[ редактировать ]- Простой метод обратимой иммобилизации, включающий адсорбцию или физическое прикрепление ферментов к поддерживающему веществу. Адсорбция может происходить за счет слабых неспецифических сил, таких как ван-дер-ваальсовые связи , водородные связи и гидрофобные взаимодействия, тогда как при ионной связи ферменты связываются через солевые связи. [6]
- Адсорбция на стекле, альгинатных шариках или матрице: Фермент прикрепляется к внешней стороне инертного материала. В целом этот метод самый медленный среди перечисленных здесь. Поскольку адсорбция не является химической реакцией , активный центр иммобилизованного фермента может блокироваться матрицей или шариком, что значительно снижает активность фермента. [9]
Захват
[ редактировать ]- Это метод необратимой физической иммобилизации, который можно рассматривать как физическое ограничение фермента в определенной области/пространстве. Его можно использовать для повышения механической стабильности, а также для уменьшения выщелачивания ферментов. Поскольку фермент в этом процессе не взаимодействует химически с полимером/материалом волокон/решетки носителя, он остается защищенным от денатурации с течением времени. [6]
- По сути, фермент заключен в нерастворимые шарики или микросферы, такие как шарики альгината кальция . Однако эти нерастворимые вещества препятствуют поступлению субстрата и выходу продуктов.
Химическая
[ редактировать ]Сшивка
[ редактировать ]- Сшивание : еще один необратимый метод, не требующий поддерживающего материала для прикрепления молекул фермента. В этом методе молекулы ферментов ковалентно связываются друг с другом, образуя матрицу, состоящую практически только из фермента. фермента Реакция гарантирует, что сайт связывания не закрывает активный сайт , на активность фермента влияет только неподвижность. Однако негибкость ковалентных связей исключает свойства самовосстановления, проявляемые хемоадсорбированными самоорганизующимися монослоями. В этом случае использование спейсерной молекулы, такой как полиэтиленгликоль , помогает уменьшить стерические затруднения со стороны субстрата. [6]
Ковалентная связь
[ редактировать ]- Фермент ковалентно связан с нерастворимым носителем (таким как силикагель или макропористые полимерные шарики с эпоксидными группами). Этот подход обеспечивает наиболее сильное взаимодействие фермента и носителя и, следовательно, наименьшую утечку белка во время катализа. [10]
- Активность ковалентно связанного фермента зависит от нескольких факторов, включая: форму и размер материала носителя, тип метода связывания, состав и особые условия связывания материала носителя. [11]
Связывание аффинной метки: представляет собой метод иммобилизации, сочетающий физические и химические методы, при котором ферменты могут быть иммобилизованы на поверхности, например, в пористом материале, с использованием нековалентных или ковалентных белковых меток . Эта технология была создана для целей очистки белков. Этот метод является общеприменимым и может быть реализован без предварительной очистки фермента с получением в результате чистого препарата. Используют пористое стекло и его производные, где пористую поверхность можно адаптировать с точки зрения гидрофобности в соответствии с рассматриваемым ферментом. [9]
Случайное или направленное на сайт
[ редактировать ]Многочисленные ферменты, имеющие биотехнологическое значение, иммобилизованы на различных носителях (неорганических, органических, композитных и наноматериалах) посредством случайного многоточечного прикрепления. Однако иммобилизация посредством случайной химической модификации приводит к образованию гетерогенной популяции белков, в которой более чем одна боковая цепь (амино, карбоксильная, тиоловая и т. д.), присутствующая в белках, связана с подложкой с потенциальным снижением активности из-за ограничения доступа субстрата к активному центру. . [12]
Напротив, при сайт-направленной иммобилизации фермента подложка может быть связана с одной конкретной аминокислотой (обычно N- или C-концом) в молекуле белка вдали от активного центра. Таким образом сохраняется максимальная активность фермента благодаря свободному доступу субстрата к активному центру. Эти стратегии в основном являются химическими, но могут дополнительно потребовать генетических и ферментативных методов для создания функциональных групп (отсутствующих в белке) на носителе и ферменте. [12]
Выбор метода СДКМ зависит от многих факторов, таких как тип фермента (менее стабильный психрофильный или более стабильный термофильный гомолог), pH-стабильность фермента, наличие N- или C-концов реагента, невмешательство конец фермента с указанием активности фермента, типа каталитического аминокислотного остатка, доступности, цены и простоты приготовления реагентов. Например, создание дополнительных кликабельных функциональных групп (алкина и азида) на носителе и ферменте является одним из наиболее удобных способов иммобилизации ферментов посредством сайт-направленной химической модификации. [13]
Иммобилизация подложки
[ редактировать ]Другим широко используемым применением подхода иммобилизации вместе с ферментами являются ферментативные реакции на иммобилизованных субстратах. Этот подход облегчает анализ активности ферментов и имитирует действие ферментов, например, на клеточные стенки. [14]
Коммерческое использование
[ редактировать ]Иммобилизованные ферменты имеют важное прикладное применение, поскольку они снижают затраты и улучшают результат реакции, которую они катализируют. Преимущества включают в себя:
- Удобство
- незначительное количество белка растворяется В реакции , поэтому обработка может быть намного проще. По завершении реакционные смеси обычно содержат только растворитель и продукты реакции. [15]
- Экономика
- Иммобилизованный фермент легко удаляется из реакции, что упрощает переработку биокатализатора . Это особенно полезно в таких процессах, как производство безлактозного молока, поскольку молоко можно слить из контейнера, оставив внутри фермент ( лактазу ), готовый для следующей партии. [15]
- Стабильность
- Иммобилизованные ферменты обычно обладают большей термической и эксплуатационной стабильностью, чем растворимая форма фермента. [15]
В прошлом биологические стиральные порошки и моющие средства содержали множество протеаз и липаз , расщепляющих грязь. Однако когда чистящие средства попадали на кожу человека, они вызывали аллергические реакции. Вот почему иммобилизация ферментов важна для многих областей применения.
Иммобилизованные ферменты используются в различных областях, включая пищевую, химическую, фармацевтическую и медицинскую промышленность. Например, в пищевой промышленности иммобилизованные ферменты используются для производства нескольких типов бескалорийных подсластителей. Аллюлоза например, представляет собой эпимер фруктозы , , которая отличается по структуре, в результате чего она не усваивается человеческим организмом при приеме внутрь. Другой пример подсластителей на основе иммобилизованных ферментов: тагатоза (иммобилизованная β-галактозидаза ). [16]
В химической (косметической) промышленности иммобилизованные ферменты также используются для производства смягчающих эфиров с использованием иммобилизованного фермента CalB. Первой компанией, применившей такой метод, стала компания Evonik в 2000 году. Фермент липаза-CalB в иммобилизованном состоянии фактически используется в других фармацевтических приложениях для производства оданакатиба и софосбувира . [16]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Заушицына О, Берилло Д, Кирсебом Х, Маттиассон Б (2013). «Криоструктурированные и сшитые жизнеспособные клетки, образующие монолиты, пригодные для применения в биореакторах». Темы катализа . 57 (5): 339–348. дои : 10.1007/s11244-013-0189-9 . S2CID 94773366 .
- ^ Бёрнер Р.А., Заушицына О, Берилло Д, Скачча Н, Маттиассон Б, Кирсебом Х (2014). «Иммобилизация Clostridium acetobutylicum DSM 792 в виде макропористых агрегатов посредством криогелеобразования для производства бутанола». Технологическая биохимия . 49 : 10–18. дои : 10.1016/j.procbio.2013.09.027 .
- ^ Перейти обратно: а б с д Фесснер В.Д. (1999). Биокатализ: от открытия к применению . Берлин: Шпрингер. ISBN 3-540-64942-5 . OCLC 40551838 .
- ^ Чжан Д.Х., Ювэнь LX, Пэн LJ (2013). «Параметры, влияющие на эффективность иммобилизованного фермента» . Химический журнал . 2013 : 1–7. дои : 10.1155/2013/946248 . ISSN 2090-9063 .
- ^ Зелински Т., Вальдманн Х. (4 апреля 1997 г.). «Сшитые кристаллы ферментов (КЛЭК) — эффективные и стабильные биокатализаторы для препаративной органической химии» . Прикладная химия (на немецком языке). 109 (7): 746–748. Бибкод : 1997АнгЧ.109..746Z . дои : 10.1002/anie.19971090709 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и Мохамад Н.Р., Марзуки Н.Х., Буанг Н.А., Хуйоп Ф., Вахаб Р.А. (март 2015 г.). «Обзор технологий иммобилизации ферментов и методов анализа поверхности иммобилизованных ферментов» . Биотехнология, Биотехнологическое оборудование . 29 (2): 205–220. дои : 10.1080/13102818.2015.1008192 . ПМЦ 4434042 . ПМИД 26019635 .
- ^ Броделиус П., Мосбах К. (1987). «[14] Обзор». Методы энзимологии . Том. 135. Эльзевир. стр. 173–175. дои : 10.1016/0076-6879(87)35075-х . ISBN 9780121820350 . Проверено 28 декабря 2022 г.
- ^ Перейти обратно: а б Бухгольц К., Кляйн Дж (1987). «[1] Характеристика иммобилизованных биокатализаторов». Характеристика иммобилизованных биокатализаторов . Методы энзимологии. Том. 135. Эльзевир. стр. 3–30. дои : 10.1016/0076-6879(87)35062-1 . ISBN 9780121820350 . ПМИД 3600301 .
- ^ Перейти обратно: а б Энгельмарк Кассимджи К., Кадов М., Викмарк Й., Сведендал Хамбл М., Ротштейн М.Л., Ротштейн Д.М., Бэквалл Дж.Е. (август 2014 г.). «Общий метод очистки и иммобилизации белков на стекле с контролируемой пористостью: биокаталитические применения» . Химические коммуникации . 50 (65): 9134–9137. дои : 10.1039/C4CC02605E . ПМИД 24989793 .
- ^ Зукка П., Санжуст Э. (сентябрь 2014 г.). «Неорганические материалы как подложки для ковалентной иммобилизации ферментов: методы и механизмы» . Молекулы . 19 (9): 14139–14194. дои : 10.3390/molecules190914139 . ПМК 6272024 . ПМИД 25207718 .
- ^ «Поляроны со слабой связью: смягчение, вызванное носителями» , Polarons , Cambridge University Press, стр. 13–20, 29 ноября 2012 г., doi : 10.1017/cbo9781139023436.005 , ISBN 9781139023436 , получено 28 декабря 2022 г.
- ^ Перейти обратно: а б Маргезин Р (22 июня 2017 г.). Психрофилы: от биоразнообразия к биотехнологии (второе изд.). Чам, Швейцария: Springer. ISBN 978-3-319-57057-0 . OCLC 991854426 .
- ^ Шемси А.М., Хандай Ф.А., Кураши А., Халил А., Геррьеро Дж., Сиддики К.С. (май 2019 г.). «Химически модифицированные магнитные ферменты местного действия: производство, усовершенствования, биотехнологические применения и перспективы». Достижения биотехнологии . 37 (3): 357–381. doi : 10.1016/j.biotechadv.2019.02.002 . ПМИД 30768953 . S2CID 73473772 .
- ^ Грей CJ, Вайсенборн MJ, Эйерс CE, Флитш С.Л. (август 2013 г.). «Ферментативные реакции на иммобилизованных субстратах». Обзоры химического общества . 42 (15): 6378–6405. дои : 10.1039/C3CS60018A . ПМИД 23579870 .
- ^ Перейти обратно: а б с У Х, Лян Ю, Ши Дж, Ван Х, Ян Д, Цзян Цзи (апрель 2013 г.). «Повышенная стабильность каталазы, ковалентно иммобилизованной на функционализированных субмикросферах титана» . Материаловедение и инженерия. C. Материалы для биологических применений . 33 (3): 1438–1445. дои : 10.1016/j.msec.2012.12.048 . ПМИД 23827593 .
- ^ Перейти обратно: а б Бассо, Алессандра; Сербан, Симона (2020), Гизан, Хосе М.; Боливар, Хуан М.; Лопес-Гальего, Фернандо; Роча-Мартин, Хавьер (ред.), «Обзор применения иммобилизованных ферментов в фармацевтической, химической и пищевой промышленности» , Иммобилизация ферментов и клеток , Методы молекулярной биологии, том. 2100, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Springer US, стр. 27–63, doi : 10.1007/978-1-0716-0215-7_2 , ISBN. 978-1-0716-0214-0 , PMID 31939114 , S2CID 210826633 , получено 9 января 2023 г.
| Базы данных органов управления : Национальные |
|---|
